Penggunaan Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut sebagai Imunostimulan untuk Pencegahan Penyakit White Spot pada Udang Vaname
PENGGUNAAN EKSTRAK BATANG PISANG AMBON LUMUT
SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK PENCEGAHAN
PENYAKIT WHITE SPOT PADA UDANG VANAME
AFRIANI RAMADHAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Penggunaan
Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut sebagai Imunostimulan untuk Pencegahan
Penyakit White Spot pada Udang Vaname” adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2017
Afriani Ramadhan
NIM C151140381
RINGKASAN
AFRIANI RAMADHAN. Penggunaan Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut
sebagai Imunostimulan untuk pencegahan penyakit White Spot pada Udang
Vaname. Dibimbing oleh SRI NURYATI, NUR BAMBANG PRIYO UTOMO
dan ALIMUDDIN.
Penyakit white spot merupakan penyakit yang menjadi permasalahan
utama penyebab penurunan produksi pada budidaya udang vaname. Upaya dalam
penanggulangan dan pencegahan penyakit pada udang adalah melalui peningkatan
sistem imun udang, yaitu dengan menggunakan imunostimulan. Bahan-bahan
alamiah dapat berperan sebagai imunostimulan, salah satunya adalah ekstrak
batang pisang ambon lumut Musa cavendishii var. dwarf Paxton. Batang pisang
ambon mengandung beberapa senyawa aktif imunostimulan. Penggunaan
imunostimulan telah banyak diteliti untuk pengendalian penyakit virus pada
udang dan terbukti mampu meningkatkan respons imun non-spesifik serta
pertumbuhan udang. Akan tetapi, sampai saat ini masih sangat minim informasi
mengenai dosis yang optimal untuk pemberian imunostimulan pada udang. Oleh
karena itu, penelitian ini dilakukan untuk menentukan dosis pemberian ekstrak
batang pisang ambon yang optimal untuk pemberian ekstrak batang pisang
ambon, sehingga mampu menginduksi sistem kekebalan tubuh non-spesifik
terhadap serangan penyakit viral khususnya white spot serta memacu
pertumbuhan udang vaname.
Penelitian ini dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap, terdiri atas
lima perlakuan ekstrak batang pisang ambon, yaitu: dua perlakuan kontrol
(kontrol positif dan negatif), perlakuan A: 0,1 g kg-1 pakan, B: 0,3 g kg-1 pakan,
dan C 0,5 g kg-1 pakan. Setiap perlakuan dibuat 3 ulangan. Pemberian pakan
dilakukan sebanyak 4 kali sehari selama 29 hari dan secara at-satiation. Observasi
parameter pertumbuhan meliputi feed conversion ratio (FCR) dan laju
pertumbuhan spesifik (LPS). Kemudian udang diuji tantang dengan diinjeksi
menggunakan filtrat WSSV (10-3). Variabel pengamatan meliputi gejala klinis,
kelangsungan hidup, konfirmasi WSSV menggunakan PCR, ekspresi gen
prophenoloxydase, mengkaji efisiensi pakan dengan pemberian ekstrak batang
pisang ambon serta parameter imunitas (total hemocyte count (THC), aktivitas
prophenoloxydase (proPO), aktivitas respiratory burst (RB), dan aktivitas
fagositik. Pengamatan dilakukan sebelum pemberian ekstrak batang pisang
ambon, sebelum uji tantang, hari pertama pascauji tantang, hari ketiga pascauji
tantang, hari kelima pascauji tantang dan hari ketujuh pascauji tantang pada tiap
perlakuan.
Hasil penelitian menunjukkan nilai THC setelah 29 hari pemberian ekstrak
batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g kg-1 (perlakuan C) mengalami
peningkatan lebih tinggi dibanding dengan kontrol. Peningkatan nilai THC
mengindikasikan reaksi cepat imunitas udang vaname terhadap infeksi yang
diberikan. Hasil pengamatan aktivitas proPO selama penelitian juga menunjukkan
adanya peningkatan nilai proPO setelah perlakuan pemberian ekstrak batang
pisang ambon terutama pada perlakuan C, yaitu pemberian ekstrak batang pisang
ambon dengan dosis 0,5 g kg-1. Peningkatan nilai proPO menyebabkan
kemampuan udang vaname dalam mengenali benda asing semakin baik. Hasil
pengamatan aktivitas RB udang vaname yang diberi ekstrak batang pisang ambon
dengan dosis 0,5 g kg-1 mengalami peningkatan yang lebih tinggi dibandingkan
kontrol. Demikian halnya pada hasil pengamatan aktivitas fagositik (AF) udang
vaname yang diberi ekstrak batang pisang ambon 0,5 g kg-1 juga menunjukkan
nilai AF yang lebih tinggi dibanding perlakuan lainnya. Hal ini menunjukkan
bahwa dengan adanya pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g
kg-1 mampu meningkatkan kemampuan sistem imun nonspesifik pada udang
vaname dengan adanya sel-sel fagosit. Pemberian ekstrak batang pisang ambon
juga mendapatkan pita DNA hasil ekspresi gen prophenoloxydase dibandingkan
dengan perlakuan k+ (tanpa pemberian ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi
WSSV).
Pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g kg-1 (perlakuan
C) mampu meningkatkan kelangsungan hidup udang vaname 100,00±0,00%, dan
menunjukkan laju pertumbuhan spesifik yang lebih tinggi dibanding perlakuan
lainnya dengan nilai 7,79±0,06%. Pemberian ekstrak batang pisang ambon pada
udang vaname juga mampu menekan penggunaan pakan, terlihat dari nilai nilai
rasio konversi pakan, perlakuan C (dosis 0,5 g kg-1) menunjukkan nilai rasio
konversi pakan yang lebih baik dibanding perlakuan lainnya (1,52±0,01). Bila
ditinjau dari segi efisiensinya, pemberian ekstrak batang pisang ambon dosis 0,5 g
kg-1 (perlakuan C) menunjukkan biaya pembuatan ekstrak batang pisang ambon
tertinggi dengan jumlah biaya Rp30 750. Hal ini dapat berimplikasi dengan
penambahan biaya produksi ketika diaplikasikan pada skala laboratorium dan
lapang namun dapat lebih menguntungkan karena nilai kelangsungan hidup dan
jumlah bobot yang diperoleh lebih tinggi.
Kata kunci: ekstrak batang pisang ambon, respons imun, udang vaname, white
spot
SUMMARY
AFRIANI RAMADHAN. Aplication of banana steam extract as an
immunostimulants for preventing diseases white spot on white shrimp
(Litopenaeus vannamei). Supervised by SRI NURYATI, NUR BAMBANG
PRIYO UTOMO and ALIMUDDIN.
White spot is a disease that is the main problem causing production
decline in shrimp farming vaname. An efforts in the reduction and prevention of
disease in shrimp is through improving the immune system of shrimp, with using
immunostimulant. Natural ingredients can act as an immunostimulant, one of
them is an ambon lumut banana stem extract Musa cavendishii var. dwarf
Paxton. Banana stem contains several active compounds immunostimulant. The
use of immunostimulant has been widely studied for the control of viral diseases
in shrimp and proved to increase non-specific immune response as well as the
growth of shrimp. However, until now still limited information about the optimal
dose for administration of immunostimulant on shrimp. Therefore, this study was
conducted to determine the dose of extract of banana stems optimal to induce the
immune system against non-spesific viral disease especially white spot prawns
and stimulate the growth of white shrimp.
This study was conducted using a completely randomized design,
consisting of five treatments banana stem extract, namely: two control treatments
(positive and negative control), treatment A: 0,1 g kg-1 feed, B: 0,3 g kg-1 feed,
and C 0,5 g kg-1 feed. Each treatment was made three replications. The feeding
conducted as much four times a day 29 days and at-satiation. Observation of the
growth parameters include feed convertion ratio (FCR) and specific growth rate
(SGR). Then tested shrimp challenged WSSV filtrate (10-3). Variable include the
observations clinical symptoms, survival, confirmation WSSV using PCR,
prophenoloxydase gene expression, total hemocyte count (THC), the activity
prophenoloxydase (proPO), respiratory burst activity (RB), and phagocytic
activity. Observation was done before the giving extract of banana stems, before
the challange test, the first day after challanged, after challanged third day, fifth
day and the seventh day after challange at every treatment. As a supported data,
this research was also assessing feed efficiency banana stem extract.
The results showed the value of THC after 29 days of administration of
banana stem extract at a dose of 0,5 g kg-1 (treatment C) has increased higher than
control. Increasing the value of THC indicates rapid reaction vaname shrimp
immunity to infection given. The observations also showed an increase in the
value of proPO after treatment banana giving extract of stem primarily on C
treatment (dosage 0,5 g kg-1). proPO gene expression was also detected in
treatment C while in treatment and K+ (without giving extract of banana stems
and infected with WSSV) is not detected. Increasing the valueand gene expression
proPO demonstrate the ability of white shrimp recognize foreign objects getting
better. The observation activity by RB shrimp vaname banana stem extract at a
dose of 0,5 g kg-1 increased higher than the control. Similarly, on the observations
of shrimp AF by banana stems extract 0,5 g kg-1 also shows the value of AF is
hifgher than other treatments. This suggests that the presence of banana stem
giving extract of at a dose of 0,5 g kg-1 is able to improve the nonspecific immune
system of shrimp with the phagocytic cells.
Banana stem extract at a dose of 0,5 g kg-1 (treatment C) were able to
increase the survival of shrimp 100,00 ± 0,00%, and showed LPS higher than
other treatments. The extract stem banana on shrimp also able to suppress the use
of feed, seen from the values of FCR, C treatment (dosage 0,5 g kg-1) indicates
the value of the FCR are better than the other treatments. When viewed in terms
of efficiency, ambon lumut banana stem extract dose of 0,5 g kg-1 (treatment C)
shows the cost of making banana stem extract highest amount costs of Rp30 750.
This may have implications for the increase in the cost of production when
applied on a laboratory scale and airy but it can be more profitable because the
value of the survival and the amount of weight gained higher.
Keywords: Banana steam extract, immune response, shrimp vaname, white spot
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENGGUNAAN EKSTRAK BATANG PISANG AMBON LUMUT
SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK PENCEGAHAN
PENYAKIT WHITE SPOT PADA UDANG VANAME
AFRIANI RAMADHAN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Ir Widanarni, MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
segala berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah
yang berjudul “Penggunaan Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut sebagai
Imunostimulan untuk Pencegahan Penyakit White spot pada Udang Vaname” pada
Sekolah Pascasarjana, Program Studi Ilmu Akuakultur, Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan secara khusus kepada Ibu Dr Sri
Nuryati, Bapak Dr Nur Bambang Priyo Utomo dan Bapak Dr Alimuddin selaku
dosen pembimbing atas waktu, kebijaksanaan, tuntunan, perhatian, kesabaran,
nasehat, semangat, dan masukan-masukan yang telah diberikan hingga tesis ini
dapat diselesaikan. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Widanarni selaku
penguji luar komisi dan Dr Iis Diatin selaku komisi program studi dalam pelaksanaan
ujian tesis. Penulis juga mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya
kepada Drs H Abd Azis P dan Hj Hidjrah Abd Hafid SPd atas segala doa, kasih
sayang, semangat dan nasehat yang tidak pernah putus diberikan.
Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan
Tinggi (DIKTI) dibawah Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan yang telah
memberikan beasiswa S2 Fresh Graduate pada tahun 2014 sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian ini serta memperdalam ilmu di Sekolah Pascasarjana
Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu serta memberikan
masukan dan ide yang membangun selama kegiatan penelitian, Bapak Ranta, Mba
Lina Mulyani, Qorie Astria SPi., MSi, Aminatul Zahra SPi., MSi, Nunun Ainun
SSi, Suardi laheng SPi., MSi, Windu Sukendar SPi., MSi, Eko Priyantono SP.,
MSi, Kurniawan wahyu SPi., MSi, Ardana Kurniadji SPi, rekan-rekan di
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik (Hasan Nasrullah
SPi, Pak Asep Sopian SPi, Ibu Reni Agustina SPi., MSi, Haryayu SPi, serta
teman-teman mahasiswa Program Studi Ilmu Akuakultur Angkatan 2014, teman
teman Himpunan mahasiswa Palu Sulawesi Tengah, teman teman Volunter
Mentari Pagi, teman teman perantauan kos Syariah atas bantuan, kebersamaan,
kekompakan serta motivasinya dalam perjuangan menempuh studi. Akhir kata,
semoga karya ilmiah ini bermanfaat untuk kemajuan ilmu pengetahuan umumnya
dan perikanan budidaya khususnya.
Bogor, Maret 2017
Afriani Ramadhan
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Rancangan Penelitian
Prosedur Penelitian
Prosedur Ekstraksi Batang Pisang Ambon dengan Maserasi
Analisis Fitokimia
Preparasi Pakan
Persiapan Wadah
Persiapan Udang Uji
Penyiapan dan Infeksi Virus White Spot
Parameter Uji
Kelangsungan Hidup
Relative Percent Survival (RPS)
Total Hemocyte Count (THC)
Aktivitas Prophenoloxydase (proPO)
Respiratory Burst (RB)
Aktivitas Fagositik
Konfirmasi Keberadaan WSSV Menggunakan PCR
Gejala Klinis
Rasio Konversi Pakan
Laju Pertumbuhan Spesifik
Ekspresi Gen Prophenoloxydase
Kualitas Air
Efisiensi Biaya Ekstrak Batang Pisang Ambon
Analisis Data
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kelangsungan Hidup dan Relative Percent Survival (RPS)
Pola Mortalitas Harian
Total Hemocyte Count (THC)
Aktivitas Prophenoloxydase (proPO)
Respiratory Burst (RB)
Aktivitas Fagositik
Konfirmasi Keberadaan WSSV Menggunakan PCR
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
9
10
11
11
12
13
Gejala Klinis
Rasio Konversi Pakan
Laju Pertumbuhan Spesifik
Ekspresi Gen Prophenoloxydase
Efisiensi Biaya Ekstrak Batang Pisang Ambon
Pembahasan
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
14
14
15
15
16
16
19
19
20
21
24
29
DAFTAR TABEL
1 Perlakuan pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis yang
berbeda
2 Kelangsungan hidup (KH) dan relative percent survival (RPS) udang
vaname pascauji tantang WSSV
3 Biaya pakan dengan penambahan ekstrak batang pisang ambon
3
9
16
DAFTAR GAMBAR
1. Pola mortalitas harian udang vaname (Litopenaeus vannamei) pascauji
tantang
2. Total hemocyte count udang vaname sebelum perlakuan, sebelum uji
tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
4 Aktivitas prophenoloxydase udang vaname sebelum perlakuan,
sebelum uji tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
5 Aktivitas respiratory burst udang vaname sebelum perlakuan, sebelum
uji tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
6 Aktivitas fagositik udang vaname sebelum perlakuan, sebelum uji
tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
7 Konfirmasi akhir pemeliharaan udang uji setelah perlakuan dengan
menggunakan PCR
8 Perubahan gejala klinis secara morfologis pada hepatopankreas udang
terinfeksi WSSV
9 Rasio konversi pakan udang vaname selama 29 hari pemberian ekstrak
batang pisang ambon
10 Laju pertumbuhan spesifik udang vaname selama 29 hari pemberian
ekstrak batang pisang ambon
11 Ekspresi gen prophenoloxydase
9
10
11
12
13
13
14
14
15
15
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
Prosedur analisis kualitatif fitokimia
Respons imun
Analisis ekspresi gen
Pengamatan parameter kualitas air selama penelitian
Rincian biaya bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan ekstrak
batang pisang ambon
6 Rincian biaya pembuatan ekstrak batang pisang ambon
7 Kebutuhan pakan yang digunakan untuk 100 ekor udang vaname
25
25
26
28
28
28
28
25 1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Udang vaname Litopenaeus vannamei merupakan komoditas ekspor perikanan
yang telah memberikan kontribusi yang besar terhadap Indonesia. Udang vaname
banyak disukai masyarakat karena rasa dagingnya yang enak serta memiliki nilai
gizi yang lengkap, tetapi produksi udang vaname mengalami penurunan yang
cukup besar, seperti pada tahun 2015 triwulan pertama produksinya dari 75.100
ton, turun menjadi 72.046 triwulan kedua, kemudian triwulan ketiga hanya
mencapai 63.349 ton (KKP 2015). Salah satu penyebab penurunan produksi
udang vaname yaitu adanya penyakit viral yang disebabkan oleh virus. Penyakit
white spot dapat menyebabkan kematian hingga 100% (Huang et al. 2011).
Udang vaname termasuk krustasea yang hanya memiliki sistem imun nonspesifik
dalam mempertahankan tubuhnya terhadap serangan virus. Upaya dalam
penanggulangan dan pencegahan penyakit pada udang adalah melalui peningkatan
sistem imun udang, yaitu dengan menggunakan imunostimulan (Alifuddin 2002),
vitamin (Darvishpour et al. 2012), dan probiotik (Lakshmi et al. 2013).
Imunostimulan biasa dilakukan dengan pemberian komponen mikrobia seperti
β-glukan dan lipopolisakarida atau sel bakteri yang telah dimatikan (Smith et al.
2003). Kelemahan imunostimulan ini adalah tidak mudah didapatkan dan
harganya mahal sehingga diperlukan alternatif lain yang juga dapat berperan
sebagai imunostimulan pada tubuh udang.
Bahan-bahan alamiah mempunyai fungsi untuk memperbaiki kondisi
lingkungan. Selain itu harganya murah dan mudah didapatkan sehingga dapat
mencegah pemakaian beberapa macam obat yang dapat menyebabkan resisten
bagi patogen. Bahan-bahan alami yang dapat digunakan adalah batang pisang.
Batang pisang merupakan limbah pertanian potensial yang belum banyak
dimanfaatkan. Menurut data yang bersumber dari (BPS 2015), produksi pisang di
Indonesia sebanyak tujuh milyar ton. Perbandingan bobot segar antara batang,
daun, dan buah pisang berturut-turut adalah 63%, 14%, dan 23% (Rahman 2006).
Salah satu cara dalam memanfaatkan limbah batang pisang ambon, yaitu dapat
diekstrak dan dimanfaatkan sebagai senyawa antibakteri dan antivirus.
Hasil analisis fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak batang pisang ambon
mengandung tanin 4,94%, saponin 8,38% dan flavonoid 19,52% (BALITRO
2015), Senyawa-senyawa tersebut berpotensi sebagai antibakteri, antivirus dan
sebagai sumber imunostimulan. Penelitian mengenai penggunaan ekstrak batang
pisang ambon sebagai imunostimulan untuk pencegahan, pengobatan dan
pengendalian penyakit pada ikan telah dilakukan (Efrianti 2013; Lidiawati 2014;
Aulia 2014; Nurul 2015; Sari 2016; Indraswari 2016). Penelitian Penggunaan
ekstrak batang pisang ambon sebagai imunostimulan untuk pengendalian white
spot pada budidaya udang vaname di karamba jaring apung dengan dosis 0,5%
sebelum dan setelah uji tantang memiliki nilai kelangsungan hidup sebesar 100%
dibandingkan perlakuan kontrol positif sebesar 0% (Simanjuntak 2016). Selain
itu penelitian Simanjuntak (2016) telah mendapatkan hasil frekuensi pemberian
setiap hari ekstrak batang pisang ambon dan dosis 0,5% yang terbaik, akan tetapi
belum diketahui apakah dosis masih dapat diturunkan sehingga penggunaan
2
ekstrak batang pisang ambon menjadi lebih efisien. Oleh karena itu tujuan
penelitian ini adalah menguji dosis berbeda ekstrak batang pisang ambon melalui
pakan dalam meningkatkan respons imun, pertumbuhan, resistensi udang vaname
terhadap penyakit white spot dan efisiensi penggunaanya pada budidaya udang
vaname.
Perumusan Masalah
Penyakit white spot masih menjadi masalah utama yang dapat
menyebabkan kegagalan budidaya udang vaname. Mekanisme pertahanan udang
sangat bergantung pada kekebalan bawaan (innate immunity) yang terdiri dari
komponen seluler dan humoral yang sangat efektif dalam pertahanan tubuh dari
serangan patogen (Yeh et al. 2009). Salah satu alternatif pencegahan penyakit
viral yang dapat dikembangkan adalah penggunaan ekstrak dari bahan-bahan
alami yang dapat berperan sebagai imunostimulan (Harikrishnan et al. 2011).
Bahan-bahan alami yang dapat digunakan adalah ekstrak batang pisang.
Kandungan senyawa aktif ekstrak batang pisang sangat efektif dalam pencegahan
penyakit white spot. Pemberian imunostimulan yang baik juga harus
memperhatikan dosis yang optimal. Penelitian Simanjuntak (2016) telah
mendapatkan dosis terbaik sebanyak 0,5 g kg-1, tetapi belum diketahui apakah
dosis masih dapat diturunkan sehingga penggunaannya lebih efisien. Respons
imun pada udang tergambar dari kelangsungan hidup udang yang terinfeksi,
konfirmasi WSSV dengan PCR, parameter pertumbuhan seperti rasio konversi
pakan dan laju pertumbuhan spesifik serta parameter imun yang mengekspresikan
respons imun pada udang berupa total hemocyte count, aktivitas
prophenoloxydase (proPO), respiratory burst (RB), aktivitas fagositik gejala
klinis dan ekspresi gen prophenoloxydase (proPO). Pakan dengan dosis ekstrak
batang pisang ambon yang optimal diharapkan dapat meningkatkan pertumbuhan
serta resistensi udang vaname terhadap serangan penyakit viral khususnya white
spot. Selain itu diperlukan analisis ekonomi untuk melihat seberapa efisien
penggunaan ekstrak batang pisang ambon pada budidaya udang vaname sebagai
dasar aplikasi pada skala lapang.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menguji dosis berbeda ekstrak batang pisang
ambon melalui pakan dalam meningkatkan respons imun, resistensi terhadap
penyakit white spot, perfoma pertumbuhan dan efisiensi penggunaanya pada
budidaya udang vaname.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini dapat dijadikan sebagai salah satu alternatif
pencegahan penyakit viral khususnya white spot sehingga dapat mencegah
kegagalan budidaya akibat infeksi penyakit, dan meningkatkan produksi pada
kegiatan budidaya udang vaname.
3
Hipotesis
Pemberian ekstrak batang pisang ambon melalui pakan dengan dosis yang
lebih rendah dari 0,5 g kg-1 dapat meningkatkan respons imun, resistensi terhadap
penyakit white spot, perfoma pertumbuhan dan efisiensi dalam penggunaannya.
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada September 2015 – April 2016. Analisis
fitokimia bertempat di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Bogor.
Pemeliharaan udang uji bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan Kolam
Percobaan Babakan, Analisis hematologi Bertempat di Laboratorium Kesehatan
Organisme Akuatik, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK), analisis
konfirmasi WSSV dengan PCR bertempat di Balai Penelitian dan Pengembangan
Budidaya Air Tawar Bogor, analisis ekspresi gen bertempat di Laboratorium
Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, BDP-FPIK-IPB.
Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk menguji respons imun udang vaname, yang
diberi ekstrak batang pisang ambon dosis berbeda terhadap serangan WSSV.
Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap terdiri atas 5
perlakuan, yaitu: 2 perlakuan kontrol (kontrol negatif dan positif) dan 3 perlakuan
pemberian pakan mengandung ekstrak batang pisang ambon (Tabel 1). Setiap
perlakuan dibuat tiga ulangan.
Tabel 1 Perlakuan pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis yang
berbeda.
Perlakuan
Keterangan
Kontol
negatif (K-)
Kontrol
positif (K+)
A
B
C
Tanpa penambahan ekstrak batang pisang ambon dan tidak
diinfeksi WSSV
Tanpa penambahan ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi
WSSV
0,1 g kg-1 ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV
0,3 g kg-1 ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV
0,5 g kg-1 ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV
Prosedur Penelitian
Prosedur Ekstraksi Batang Pisang Ambon dengan Maserasi
Batang pisang ambon yang digunakan berasal dari Desa Pabuaran
Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Ekstraksi batang pisang ambon
menggunakan metode Septiana dan Asnani (2012), dan bagian batang pisang
ambon yang telah dipanen berumur sekitar lima bulan, dipotong hingga menjadi
bagian kecil-kecil. Batang pisang diekstraksi menggunakan pelarut etanol 96%.
4
Simplisia batang pisang diekstraksi dengan perbandingan 1:10 (bobot : volume)
antara sampel dan pelarut. Ekstraksi dilakukan menggunakan metode maserasi
selama 24 jam menggunakan Thermoshake dengan kecepatan 160 rpm dan suhu
40 °C Filrat yang diperoleh disaring kemudian dikumpulkan dan diuapkan dengan
rotary evaporator pada suhu 40 °C. Hasil yang diperoleh berupa ekstrak kental
batang pisang ambon.
Analisis Fitokimia
Analisis fitokimia dilakukan di Balai Tanaman Rempah dan Obat
Cimanggu Bogor dengan menggunakan metode thin layer chromatography (TLC)
(Lampiran 1).
Preparasi Pakan
Ekstrak batang pisang ambon dilarutkan terlebih dahulu dalam 300 mL
akuades steril yang sebelumnya telah ditambahkan putih telur sebagai binder pada
konsentrasi 2%. Larutan hasil ekstrak batang pisang ambon dicampurkan secara
merata ke dalam pakan udang komersial yang berprotein 40%. Pakan dikeringanginkan sekitar 1 jam. Pakan yang telah siap dapat langsung digunakan atau
dapat dimasukkan dalam wadah plastik yang tertutup rapat dan disimpan dalam
lemari pendingin dengan suhu 4 ⁰C hingga akan digunakan.
Persiapan Wadah
Prosedur penelitian diawali dengan persiapan wadah. Wadah yang
digunakan adalah akuarium berukuran (65×30×35) cm3. Akuarium dibersihkan
dengan menggunakan sabun detergen, dibilas sampai bersih, didesinfeksi
menggunakan klorin 30 ppm, kemudian dikeringkan selama 24 jam. Setelah
kering akuarium diisi air sebanyak 40 liter per akuarium dan diaerasi satu titik per
akuarium untuk memberikan suplai oksigen pada media pemeliharaan. Akuarium
yang digunakan sebanyak 15 akuarium untuk pengamatan kelangsungan hidup,
dan 5 akuarium untuk uji hematologi.
Persiapan Udang Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang vaname yang
berasal dari KJA budidaya udang di Kepulauan Seribu dan bobot badan yang
digunakan 4,18±0,02 gram ekor-1. Sebelum dilakukan pemeliharaan dan
pemberian ekstrak batang pisang ambon selama 29 hari, udang uji terlebih dahulu
diadaptasikan selama 14 hari dalam akuarium perlakuan sebanyak 10 ekor-1
akuarium dan diberi pakan komersial dengan kadar protein 40% secara atsatiation dengan frekuensi pemberian pakan empat kali sehari. Kualitas air media
dipertahankan dengan melakukan penyifonan setiap pagi hari sebanyak 10% dari
total volume akuarium. Sebelum diberi perlakuan, udang uji dipuasakan selama
24 jam dengan tujuan menghilangkan sisa pakan dalam tubuh.
Penyiapan dan Infeksi Virus White Spot
Udang vaname positif terinfeksi WSSV diperoleh dari Balai Perikanan
Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, Jawa Timur yang sebelumnya telah
dikonfirmasi menggunakan PCR. Prosedur pembuatan filtrat WSSV selanjutnya
dilakukan dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh Xie et al. (2004).
Jaringan tubuh udang yang terinfeksi WSSV (tanpa hepatopankreas, usus dan
5
karapaks) ditimbang sebanyak 5 gram, kemudian dicacah menjadi bagian-bagian
kecil dan dihomogenkan dengan 20 mL TN-Buffer (200 mM Tris, 400 mM NaCl,
pH 7,5) menggunakan mortar. Selanjutnya, jaringan udang yang telah
dihomogenkan dengan TN-Buffer disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4 C, kemudian supernatan yang diperoleh
dipindahkan pada wadah mikrotube yang baru dan disentrifugasi kembali pada
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 C. Hasil supernatan yang
diperoleh kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 10-3 dan difilter
menggunakan syringe filter 0,45 μm. Injeksi WSSV dilakukan pada bagian
punggung udang, di antara segmen ketiga dan keempat sebanyak 0,1 mL ekor-1
dengan dosis 10-3 yang diperoleh dari LD50 yang telah dilakukan sebelumnya.
Udang yang digunakan sebagai kontrol negatif diinjeksi menggunakan larutan
phosphate buffer saline (PBS) sebanyak 0,1 mL ekor-1. Uji tantang dilakukan
selama tujuh hari dan selama uji tantang udang diberi pakan serta tidak dilakukan
pergantian air.
Parameter Uji
Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup udang vaname diamati setiap hari hingga akhir
perlakuan. Perhitungan kelangsungan hidup dilakukan di akhir perlakuan dengan
rumus sebagai berikut:
Kelangsungan hidup (%) =
Keterangan : Nt = Jumlah udang akhir (ekor)
No = Jumlah udang awal (ekor)
Relative Percent Survival (RPS)
Pengamatan udang yang mati dilakukan setiap hari selama 29 hari.
Persentase mortalitas tiap perlakuan dibandingkan dengan kontrol dan
kelangsungan hidup relatif (relative percent survival, RPS) dihitung untuk
masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan dengan persamaan Ellis (1988),
sebagai berikut:
RPS (%) = (1) 100
Keterangan:
RPS = Relative percent survival (%)
Mn = Persentase mortalitas udang perlakuan ke-n
M0 = Persentase mortalitas udang kontrol
Respons Imun
Total Hemocyte count (THC)
Pengamatan total hemocyte count (THC) udang vaname dilakukan dengan
mengambil darah udang atau hemolim sebanyak 0,1 ml hemolim ditambahkan
antikoagulan (EDTA 10%) sebanyak 0,7 ml, kemudian dihomogenkan selama 5
menit di dalam microtube. Hemolim kemudian dihitung dengan haemocytometer
6
di bawah mikroskop pada perbesaran 40 kali, kemudian dihitung berdasarkan
rumus berikut:
THC (sel/mm3)= rata-rata ∑sel terhitung x
x FP x 1000
Keterangan: FP = Faktor Pengenceran
Aktivitas Prophenoloxidase (proPO)
Aktivitas
prophenoloxidase
diukur
dengan
menggunakan
spektrofotometrik dengan mencatat perubahan bentuk dopachrome yang
diproduksi dari L-dihidroxyphenylalanine (L-DOPA) menggunakan metode yang
digunakan Liu dan Chen (2004) dengan cara mengambil sampel hemolim dari
satu ekor udang pada masing-masing perlakuan dan digabung. Pengambilan
sampel dilakukan sebelum perlakuan, sebelum uji tantang, hari ke-1, ke-3, ke-5
dan ke-7 pascauji tantang (Lampiran 2).
Respiratory Burst (RB)
Respiratory burst dari hemosit udang diukur menggunakan metode yang
dilakukan Immanuel et al. (2012) berdasarkan reduksi NBT (nitroblue
tetrazolium) sebagai ukuran superoxide anion (O2-) dengan cara mengambil
sampel hemolim dari satu ekor udang pada masing-masing perlakuan dan
digabung. Pengambilan sampel dilakukan sebelum perlakuan, sebelum uji
tantang, hari ke-1, ke-3, ke5 dan ke-7 pascauji tantang (Lampiran 2).
Aktivitas Fagositik
Aktivitas fagositik diukur menggunakan metode yang dilakukan Immanuel
et al. (2012) dengan cara mengambil sampel hemolim dari satu ekor udang pada
masing-masing perlakuan dan digabung. Pengambilan sampel dilakukan sebelum
perlakuan, sebelum uji tantang, hari ke-1, ke-3, ke-5 dan ke-7 pascauji tantang
(Lampiran 2).
Konfirmasi Keberadaan WSSV Menggunakan PCR
Pemeriksaan virus dengan metode PCR dilakukan guna mengkonfirmasi
keberadaan virus WSSV pada udang vaname menggunakan metode yang telah
dikembangkan oleh Nunan dan Lightner (2011) dengan tetap melakukan optimasi
sesuai dengan kondisi. Optimasi dilakukan terhadap suhu annealing, konsentrasi
MgCl2, dan konsentrasi templat DNA sampel. Primer yang digunakan WSSV-F
5′-GAA ACT ATT GAA AAG GCT TTC CCT C-3′ WSSV-R 5′-GTT CCT TAT
TTA CTA CTA CGG CAA-3′. Konsentrasi PCR yang diperlukan adalah 1x bufer
PCR yang mengandung MgCl2, 250 µM dNTPmix, 1.25 U Ex Taq Polymerase,
masing-masing 0,4 µM primer F dan R, dan 5 µL sampel. Reaksi PCR dilakukan
pada tabung 0,2 mL dengan konsentrasi total dibuat menjadi 20 µL dengan
menambahkan distilled water. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: denaturasi
awal 95 C selama lima menit, diikuti dengan 35 siklus denaturasi 95 C 30 detik,
annealing 60 C selama satu menit, dan ekstensi 72 C selamat satu menit, serta
ekstensi akhir pada suhu 72 C selama lima menit.
7
Gejala Klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan secara visual setiap hari pascauji
tantang hingga akhir pemeliharaan. Gejala klinis yang diamati sama dengan
pengamatan yaitu meliputi perubahan pola renang dan tingkah laku, respons
terhadap pakan, serta patologi makroskopis organ luar udang vaname.
Rasio Konversi Pakan
Rasio konversi pakan atau feed convertion ratio (FCR) udang vaname
selama pemeliharaan dihitung menggunakan rumus (Yang et al. 2015) :
FCR =
Keterangan:
FCR= Konversi pakan
Fi = Jumlah pakan yang diberikan (gram)
Fw = Biomassa udang pada saat akhir perlakuan (gram)
Iw = Biomassa udang pada saat awal perlakuan (gram)
Laju Pertumbuhan Spesifik
Laju pertumbuhan spesifik udang uji dihitung berdasarkan persamaan
berikut (Zhang et al. 2014):
Gw =
Keterangan:
LPS = Laju pertumbuhan spesifik (%)
W1 = Bobot udang pada akhir penelitian
W0 = Bobot udang pada awal penelitian
T = Lama pemeliharaan (hari)
Analisis Ekspresi Gen Prophenoloxydase (proPO)
Analisis gen proPO dilakukan untuk mendapatkan informasi tentang
ekspresi gen proPO akibat pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan cara
mengambil sampel hemolim dari tiga ekor udang vaname pada masing-masing
perlakuan dan digabung. Pengambilan sampel perlakuan K+ (tanpa pemberian
ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV) dan C (pemberian ekstrak
batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g kg-1 dan diinfeksi WSSV) dilakukan 24
jam pascauji tantang kemudian untuk pengambilan sampel pada perlakuan Cdilakukan setelah pemeliharaan kembali selama 29 hari. Tahapan ekstraksi RNA
dan sintesis cDNA proPO dilakukan seperti yang dijelaskan Zokaeifar et al. 2012
(Lampiran 3).
Kualitas Air
Pengukuran kualitas air media pemeliharaan udang dilakukan dua kali
selama penelitian, yaitu pada awal dan akhir perlakuan hari ke-1 dan 29.
Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu (°C), salinitas (g L-1), oksigen
8
terlarut (DO) (mg L-1), TAN (mg L-1) dan pH. Pengukuran kualitas air langsung
pada wadah penelitian menggunakan alat pengukur masing-masing parameter,
yaitu: salinitas (salinity AZ-8371), pH (pHep hanna instrument), suhu dan DO
(dissolved oxygen meter Lutron DO-5509) (Lampiran 4).
Efisiensi Biaya Ekstrak Batang Pisang Ambon
Efisiensi biaya ekstrak batang pisang ambon bertujuan untuk
membandingkan seberapa efisien penggunaan ekstrak batang pisang ambon pada
budidaya udang vaname apabila ditinjau dari budidaya udang vaname sebanyak
100 ekor. Nilai efisiensi ditentukan dengan membandingkan biaya ekstrak batang
pisang ambon dihitung berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan seperti
perhitungan biaya pelarut etanol, bobot individu berdasarkan berat biomassa akhir
penelitian dibagi 30 ekor udang uji, jumlah pakan dihitung berdasarkan bobot
individu dikalikan 100 ekor, kemudian dikalikan rasio konversi pakan yang
diperoleh selama penelitian, biaya pakan berdasarkan biaya ekstrak dikalikan
jumlah pakan yang digunakan, kemudian dibagi 1000, serta bahan-bahan yang
digunakan untuk preparasi pakan menggunakan ekstrak batang pisang ambon
berupa putih telur, tween 80, akuades, biaya penyewaan alat rotary evaporator.
Analisis Data
Data dianalisis menggunakan Ms. Excel dan diuji statistik menggunakan
software SPSS 17,0 bila berbeda nyata diuji lanjut dengan menggunakan uji
Duncan pada taraf nyata 5%.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kelangsungan hidup (KH) dan relative percent survival (RPS) udang uji pada
masa uji tantang
Secara umum nilai KH udang pada perlakuan ekstrak batang pisang
ambon (66,67-100,00%) lebih tinggi dibandingkan perlakuan kontrol positif
(53,33%). Hal tersebut mengindikasikan bahwa pemberian ekstrak batang pisang
ambon mampu meningkatkan kelangsungan hidup udang vaname terhadap infeksi
WSSV pascauji tantang. Kelangsungan hidup udang vaname dengan pemberian
ekstrak batang pisang ambon menunjukkan perlakuan C menghasilkan nilai KH
lebih tinggi (P
SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK PENCEGAHAN
PENYAKIT WHITE SPOT PADA UDANG VANAME
AFRIANI RAMADHAN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Penggunaan
Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut sebagai Imunostimulan untuk Pencegahan
Penyakit White Spot pada Udang Vaname” adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2017
Afriani Ramadhan
NIM C151140381
RINGKASAN
AFRIANI RAMADHAN. Penggunaan Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut
sebagai Imunostimulan untuk pencegahan penyakit White Spot pada Udang
Vaname. Dibimbing oleh SRI NURYATI, NUR BAMBANG PRIYO UTOMO
dan ALIMUDDIN.
Penyakit white spot merupakan penyakit yang menjadi permasalahan
utama penyebab penurunan produksi pada budidaya udang vaname. Upaya dalam
penanggulangan dan pencegahan penyakit pada udang adalah melalui peningkatan
sistem imun udang, yaitu dengan menggunakan imunostimulan. Bahan-bahan
alamiah dapat berperan sebagai imunostimulan, salah satunya adalah ekstrak
batang pisang ambon lumut Musa cavendishii var. dwarf Paxton. Batang pisang
ambon mengandung beberapa senyawa aktif imunostimulan. Penggunaan
imunostimulan telah banyak diteliti untuk pengendalian penyakit virus pada
udang dan terbukti mampu meningkatkan respons imun non-spesifik serta
pertumbuhan udang. Akan tetapi, sampai saat ini masih sangat minim informasi
mengenai dosis yang optimal untuk pemberian imunostimulan pada udang. Oleh
karena itu, penelitian ini dilakukan untuk menentukan dosis pemberian ekstrak
batang pisang ambon yang optimal untuk pemberian ekstrak batang pisang
ambon, sehingga mampu menginduksi sistem kekebalan tubuh non-spesifik
terhadap serangan penyakit viral khususnya white spot serta memacu
pertumbuhan udang vaname.
Penelitian ini dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap, terdiri atas
lima perlakuan ekstrak batang pisang ambon, yaitu: dua perlakuan kontrol
(kontrol positif dan negatif), perlakuan A: 0,1 g kg-1 pakan, B: 0,3 g kg-1 pakan,
dan C 0,5 g kg-1 pakan. Setiap perlakuan dibuat 3 ulangan. Pemberian pakan
dilakukan sebanyak 4 kali sehari selama 29 hari dan secara at-satiation. Observasi
parameter pertumbuhan meliputi feed conversion ratio (FCR) dan laju
pertumbuhan spesifik (LPS). Kemudian udang diuji tantang dengan diinjeksi
menggunakan filtrat WSSV (10-3). Variabel pengamatan meliputi gejala klinis,
kelangsungan hidup, konfirmasi WSSV menggunakan PCR, ekspresi gen
prophenoloxydase, mengkaji efisiensi pakan dengan pemberian ekstrak batang
pisang ambon serta parameter imunitas (total hemocyte count (THC), aktivitas
prophenoloxydase (proPO), aktivitas respiratory burst (RB), dan aktivitas
fagositik. Pengamatan dilakukan sebelum pemberian ekstrak batang pisang
ambon, sebelum uji tantang, hari pertama pascauji tantang, hari ketiga pascauji
tantang, hari kelima pascauji tantang dan hari ketujuh pascauji tantang pada tiap
perlakuan.
Hasil penelitian menunjukkan nilai THC setelah 29 hari pemberian ekstrak
batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g kg-1 (perlakuan C) mengalami
peningkatan lebih tinggi dibanding dengan kontrol. Peningkatan nilai THC
mengindikasikan reaksi cepat imunitas udang vaname terhadap infeksi yang
diberikan. Hasil pengamatan aktivitas proPO selama penelitian juga menunjukkan
adanya peningkatan nilai proPO setelah perlakuan pemberian ekstrak batang
pisang ambon terutama pada perlakuan C, yaitu pemberian ekstrak batang pisang
ambon dengan dosis 0,5 g kg-1. Peningkatan nilai proPO menyebabkan
kemampuan udang vaname dalam mengenali benda asing semakin baik. Hasil
pengamatan aktivitas RB udang vaname yang diberi ekstrak batang pisang ambon
dengan dosis 0,5 g kg-1 mengalami peningkatan yang lebih tinggi dibandingkan
kontrol. Demikian halnya pada hasil pengamatan aktivitas fagositik (AF) udang
vaname yang diberi ekstrak batang pisang ambon 0,5 g kg-1 juga menunjukkan
nilai AF yang lebih tinggi dibanding perlakuan lainnya. Hal ini menunjukkan
bahwa dengan adanya pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g
kg-1 mampu meningkatkan kemampuan sistem imun nonspesifik pada udang
vaname dengan adanya sel-sel fagosit. Pemberian ekstrak batang pisang ambon
juga mendapatkan pita DNA hasil ekspresi gen prophenoloxydase dibandingkan
dengan perlakuan k+ (tanpa pemberian ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi
WSSV).
Pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g kg-1 (perlakuan
C) mampu meningkatkan kelangsungan hidup udang vaname 100,00±0,00%, dan
menunjukkan laju pertumbuhan spesifik yang lebih tinggi dibanding perlakuan
lainnya dengan nilai 7,79±0,06%. Pemberian ekstrak batang pisang ambon pada
udang vaname juga mampu menekan penggunaan pakan, terlihat dari nilai nilai
rasio konversi pakan, perlakuan C (dosis 0,5 g kg-1) menunjukkan nilai rasio
konversi pakan yang lebih baik dibanding perlakuan lainnya (1,52±0,01). Bila
ditinjau dari segi efisiensinya, pemberian ekstrak batang pisang ambon dosis 0,5 g
kg-1 (perlakuan C) menunjukkan biaya pembuatan ekstrak batang pisang ambon
tertinggi dengan jumlah biaya Rp30 750. Hal ini dapat berimplikasi dengan
penambahan biaya produksi ketika diaplikasikan pada skala laboratorium dan
lapang namun dapat lebih menguntungkan karena nilai kelangsungan hidup dan
jumlah bobot yang diperoleh lebih tinggi.
Kata kunci: ekstrak batang pisang ambon, respons imun, udang vaname, white
spot
SUMMARY
AFRIANI RAMADHAN. Aplication of banana steam extract as an
immunostimulants for preventing diseases white spot on white shrimp
(Litopenaeus vannamei). Supervised by SRI NURYATI, NUR BAMBANG
PRIYO UTOMO and ALIMUDDIN.
White spot is a disease that is the main problem causing production
decline in shrimp farming vaname. An efforts in the reduction and prevention of
disease in shrimp is through improving the immune system of shrimp, with using
immunostimulant. Natural ingredients can act as an immunostimulant, one of
them is an ambon lumut banana stem extract Musa cavendishii var. dwarf
Paxton. Banana stem contains several active compounds immunostimulant. The
use of immunostimulant has been widely studied for the control of viral diseases
in shrimp and proved to increase non-specific immune response as well as the
growth of shrimp. However, until now still limited information about the optimal
dose for administration of immunostimulant on shrimp. Therefore, this study was
conducted to determine the dose of extract of banana stems optimal to induce the
immune system against non-spesific viral disease especially white spot prawns
and stimulate the growth of white shrimp.
This study was conducted using a completely randomized design,
consisting of five treatments banana stem extract, namely: two control treatments
(positive and negative control), treatment A: 0,1 g kg-1 feed, B: 0,3 g kg-1 feed,
and C 0,5 g kg-1 feed. Each treatment was made three replications. The feeding
conducted as much four times a day 29 days and at-satiation. Observation of the
growth parameters include feed convertion ratio (FCR) and specific growth rate
(SGR). Then tested shrimp challenged WSSV filtrate (10-3). Variable include the
observations clinical symptoms, survival, confirmation WSSV using PCR,
prophenoloxydase gene expression, total hemocyte count (THC), the activity
prophenoloxydase (proPO), respiratory burst activity (RB), and phagocytic
activity. Observation was done before the giving extract of banana stems, before
the challange test, the first day after challanged, after challanged third day, fifth
day and the seventh day after challange at every treatment. As a supported data,
this research was also assessing feed efficiency banana stem extract.
The results showed the value of THC after 29 days of administration of
banana stem extract at a dose of 0,5 g kg-1 (treatment C) has increased higher than
control. Increasing the value of THC indicates rapid reaction vaname shrimp
immunity to infection given. The observations also showed an increase in the
value of proPO after treatment banana giving extract of stem primarily on C
treatment (dosage 0,5 g kg-1). proPO gene expression was also detected in
treatment C while in treatment and K+ (without giving extract of banana stems
and infected with WSSV) is not detected. Increasing the valueand gene expression
proPO demonstrate the ability of white shrimp recognize foreign objects getting
better. The observation activity by RB shrimp vaname banana stem extract at a
dose of 0,5 g kg-1 increased higher than the control. Similarly, on the observations
of shrimp AF by banana stems extract 0,5 g kg-1 also shows the value of AF is
hifgher than other treatments. This suggests that the presence of banana stem
giving extract of at a dose of 0,5 g kg-1 is able to improve the nonspecific immune
system of shrimp with the phagocytic cells.
Banana stem extract at a dose of 0,5 g kg-1 (treatment C) were able to
increase the survival of shrimp 100,00 ± 0,00%, and showed LPS higher than
other treatments. The extract stem banana on shrimp also able to suppress the use
of feed, seen from the values of FCR, C treatment (dosage 0,5 g kg-1) indicates
the value of the FCR are better than the other treatments. When viewed in terms
of efficiency, ambon lumut banana stem extract dose of 0,5 g kg-1 (treatment C)
shows the cost of making banana stem extract highest amount costs of Rp30 750.
This may have implications for the increase in the cost of production when
applied on a laboratory scale and airy but it can be more profitable because the
value of the survival and the amount of weight gained higher.
Keywords: Banana steam extract, immune response, shrimp vaname, white spot
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENGGUNAAN EKSTRAK BATANG PISANG AMBON LUMUT
SEBAGAI IMUNOSTIMULAN UNTUK PENCEGAHAN
PENYAKIT WHITE SPOT PADA UDANG VANAME
AFRIANI RAMADHAN
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Ir Widanarni, MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
segala berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah
yang berjudul “Penggunaan Ekstrak Batang Pisang Ambon Lumut sebagai
Imunostimulan untuk Pencegahan Penyakit White spot pada Udang Vaname” pada
Sekolah Pascasarjana, Program Studi Ilmu Akuakultur, Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan secara khusus kepada Ibu Dr Sri
Nuryati, Bapak Dr Nur Bambang Priyo Utomo dan Bapak Dr Alimuddin selaku
dosen pembimbing atas waktu, kebijaksanaan, tuntunan, perhatian, kesabaran,
nasehat, semangat, dan masukan-masukan yang telah diberikan hingga tesis ini
dapat diselesaikan. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Widanarni selaku
penguji luar komisi dan Dr Iis Diatin selaku komisi program studi dalam pelaksanaan
ujian tesis. Penulis juga mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya
kepada Drs H Abd Azis P dan Hj Hidjrah Abd Hafid SPd atas segala doa, kasih
sayang, semangat dan nasehat yang tidak pernah putus diberikan.
Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan
Tinggi (DIKTI) dibawah Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan yang telah
memberikan beasiswa S2 Fresh Graduate pada tahun 2014 sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian ini serta memperdalam ilmu di Sekolah Pascasarjana
Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu serta memberikan
masukan dan ide yang membangun selama kegiatan penelitian, Bapak Ranta, Mba
Lina Mulyani, Qorie Astria SPi., MSi, Aminatul Zahra SPi., MSi, Nunun Ainun
SSi, Suardi laheng SPi., MSi, Windu Sukendar SPi., MSi, Eko Priyantono SP.,
MSi, Kurniawan wahyu SPi., MSi, Ardana Kurniadji SPi, rekan-rekan di
Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik (Hasan Nasrullah
SPi, Pak Asep Sopian SPi, Ibu Reni Agustina SPi., MSi, Haryayu SPi, serta
teman-teman mahasiswa Program Studi Ilmu Akuakultur Angkatan 2014, teman
teman Himpunan mahasiswa Palu Sulawesi Tengah, teman teman Volunter
Mentari Pagi, teman teman perantauan kos Syariah atas bantuan, kebersamaan,
kekompakan serta motivasinya dalam perjuangan menempuh studi. Akhir kata,
semoga karya ilmiah ini bermanfaat untuk kemajuan ilmu pengetahuan umumnya
dan perikanan budidaya khususnya.
Bogor, Maret 2017
Afriani Ramadhan
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Rancangan Penelitian
Prosedur Penelitian
Prosedur Ekstraksi Batang Pisang Ambon dengan Maserasi
Analisis Fitokimia
Preparasi Pakan
Persiapan Wadah
Persiapan Udang Uji
Penyiapan dan Infeksi Virus White Spot
Parameter Uji
Kelangsungan Hidup
Relative Percent Survival (RPS)
Total Hemocyte Count (THC)
Aktivitas Prophenoloxydase (proPO)
Respiratory Burst (RB)
Aktivitas Fagositik
Konfirmasi Keberadaan WSSV Menggunakan PCR
Gejala Klinis
Rasio Konversi Pakan
Laju Pertumbuhan Spesifik
Ekspresi Gen Prophenoloxydase
Kualitas Air
Efisiensi Biaya Ekstrak Batang Pisang Ambon
Analisis Data
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kelangsungan Hidup dan Relative Percent Survival (RPS)
Pola Mortalitas Harian
Total Hemocyte Count (THC)
Aktivitas Prophenoloxydase (proPO)
Respiratory Burst (RB)
Aktivitas Fagositik
Konfirmasi Keberadaan WSSV Menggunakan PCR
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
9
10
11
11
12
13
Gejala Klinis
Rasio Konversi Pakan
Laju Pertumbuhan Spesifik
Ekspresi Gen Prophenoloxydase
Efisiensi Biaya Ekstrak Batang Pisang Ambon
Pembahasan
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
14
14
15
15
16
16
19
19
20
21
24
29
DAFTAR TABEL
1 Perlakuan pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis yang
berbeda
2 Kelangsungan hidup (KH) dan relative percent survival (RPS) udang
vaname pascauji tantang WSSV
3 Biaya pakan dengan penambahan ekstrak batang pisang ambon
3
9
16
DAFTAR GAMBAR
1. Pola mortalitas harian udang vaname (Litopenaeus vannamei) pascauji
tantang
2. Total hemocyte count udang vaname sebelum perlakuan, sebelum uji
tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
4 Aktivitas prophenoloxydase udang vaname sebelum perlakuan,
sebelum uji tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
5 Aktivitas respiratory burst udang vaname sebelum perlakuan, sebelum
uji tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
6 Aktivitas fagositik udang vaname sebelum perlakuan, sebelum uji
tantang dan pascauji tantang dengan WSSV
7 Konfirmasi akhir pemeliharaan udang uji setelah perlakuan dengan
menggunakan PCR
8 Perubahan gejala klinis secara morfologis pada hepatopankreas udang
terinfeksi WSSV
9 Rasio konversi pakan udang vaname selama 29 hari pemberian ekstrak
batang pisang ambon
10 Laju pertumbuhan spesifik udang vaname selama 29 hari pemberian
ekstrak batang pisang ambon
11 Ekspresi gen prophenoloxydase
9
10
11
12
13
13
14
14
15
15
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
Prosedur analisis kualitatif fitokimia
Respons imun
Analisis ekspresi gen
Pengamatan parameter kualitas air selama penelitian
Rincian biaya bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan ekstrak
batang pisang ambon
6 Rincian biaya pembuatan ekstrak batang pisang ambon
7 Kebutuhan pakan yang digunakan untuk 100 ekor udang vaname
25
25
26
28
28
28
28
25 1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Udang vaname Litopenaeus vannamei merupakan komoditas ekspor perikanan
yang telah memberikan kontribusi yang besar terhadap Indonesia. Udang vaname
banyak disukai masyarakat karena rasa dagingnya yang enak serta memiliki nilai
gizi yang lengkap, tetapi produksi udang vaname mengalami penurunan yang
cukup besar, seperti pada tahun 2015 triwulan pertama produksinya dari 75.100
ton, turun menjadi 72.046 triwulan kedua, kemudian triwulan ketiga hanya
mencapai 63.349 ton (KKP 2015). Salah satu penyebab penurunan produksi
udang vaname yaitu adanya penyakit viral yang disebabkan oleh virus. Penyakit
white spot dapat menyebabkan kematian hingga 100% (Huang et al. 2011).
Udang vaname termasuk krustasea yang hanya memiliki sistem imun nonspesifik
dalam mempertahankan tubuhnya terhadap serangan virus. Upaya dalam
penanggulangan dan pencegahan penyakit pada udang adalah melalui peningkatan
sistem imun udang, yaitu dengan menggunakan imunostimulan (Alifuddin 2002),
vitamin (Darvishpour et al. 2012), dan probiotik (Lakshmi et al. 2013).
Imunostimulan biasa dilakukan dengan pemberian komponen mikrobia seperti
β-glukan dan lipopolisakarida atau sel bakteri yang telah dimatikan (Smith et al.
2003). Kelemahan imunostimulan ini adalah tidak mudah didapatkan dan
harganya mahal sehingga diperlukan alternatif lain yang juga dapat berperan
sebagai imunostimulan pada tubuh udang.
Bahan-bahan alamiah mempunyai fungsi untuk memperbaiki kondisi
lingkungan. Selain itu harganya murah dan mudah didapatkan sehingga dapat
mencegah pemakaian beberapa macam obat yang dapat menyebabkan resisten
bagi patogen. Bahan-bahan alami yang dapat digunakan adalah batang pisang.
Batang pisang merupakan limbah pertanian potensial yang belum banyak
dimanfaatkan. Menurut data yang bersumber dari (BPS 2015), produksi pisang di
Indonesia sebanyak tujuh milyar ton. Perbandingan bobot segar antara batang,
daun, dan buah pisang berturut-turut adalah 63%, 14%, dan 23% (Rahman 2006).
Salah satu cara dalam memanfaatkan limbah batang pisang ambon, yaitu dapat
diekstrak dan dimanfaatkan sebagai senyawa antibakteri dan antivirus.
Hasil analisis fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak batang pisang ambon
mengandung tanin 4,94%, saponin 8,38% dan flavonoid 19,52% (BALITRO
2015), Senyawa-senyawa tersebut berpotensi sebagai antibakteri, antivirus dan
sebagai sumber imunostimulan. Penelitian mengenai penggunaan ekstrak batang
pisang ambon sebagai imunostimulan untuk pencegahan, pengobatan dan
pengendalian penyakit pada ikan telah dilakukan (Efrianti 2013; Lidiawati 2014;
Aulia 2014; Nurul 2015; Sari 2016; Indraswari 2016). Penelitian Penggunaan
ekstrak batang pisang ambon sebagai imunostimulan untuk pengendalian white
spot pada budidaya udang vaname di karamba jaring apung dengan dosis 0,5%
sebelum dan setelah uji tantang memiliki nilai kelangsungan hidup sebesar 100%
dibandingkan perlakuan kontrol positif sebesar 0% (Simanjuntak 2016). Selain
itu penelitian Simanjuntak (2016) telah mendapatkan hasil frekuensi pemberian
setiap hari ekstrak batang pisang ambon dan dosis 0,5% yang terbaik, akan tetapi
belum diketahui apakah dosis masih dapat diturunkan sehingga penggunaan
2
ekstrak batang pisang ambon menjadi lebih efisien. Oleh karena itu tujuan
penelitian ini adalah menguji dosis berbeda ekstrak batang pisang ambon melalui
pakan dalam meningkatkan respons imun, pertumbuhan, resistensi udang vaname
terhadap penyakit white spot dan efisiensi penggunaanya pada budidaya udang
vaname.
Perumusan Masalah
Penyakit white spot masih menjadi masalah utama yang dapat
menyebabkan kegagalan budidaya udang vaname. Mekanisme pertahanan udang
sangat bergantung pada kekebalan bawaan (innate immunity) yang terdiri dari
komponen seluler dan humoral yang sangat efektif dalam pertahanan tubuh dari
serangan patogen (Yeh et al. 2009). Salah satu alternatif pencegahan penyakit
viral yang dapat dikembangkan adalah penggunaan ekstrak dari bahan-bahan
alami yang dapat berperan sebagai imunostimulan (Harikrishnan et al. 2011).
Bahan-bahan alami yang dapat digunakan adalah ekstrak batang pisang.
Kandungan senyawa aktif ekstrak batang pisang sangat efektif dalam pencegahan
penyakit white spot. Pemberian imunostimulan yang baik juga harus
memperhatikan dosis yang optimal. Penelitian Simanjuntak (2016) telah
mendapatkan dosis terbaik sebanyak 0,5 g kg-1, tetapi belum diketahui apakah
dosis masih dapat diturunkan sehingga penggunaannya lebih efisien. Respons
imun pada udang tergambar dari kelangsungan hidup udang yang terinfeksi,
konfirmasi WSSV dengan PCR, parameter pertumbuhan seperti rasio konversi
pakan dan laju pertumbuhan spesifik serta parameter imun yang mengekspresikan
respons imun pada udang berupa total hemocyte count, aktivitas
prophenoloxydase (proPO), respiratory burst (RB), aktivitas fagositik gejala
klinis dan ekspresi gen prophenoloxydase (proPO). Pakan dengan dosis ekstrak
batang pisang ambon yang optimal diharapkan dapat meningkatkan pertumbuhan
serta resistensi udang vaname terhadap serangan penyakit viral khususnya white
spot. Selain itu diperlukan analisis ekonomi untuk melihat seberapa efisien
penggunaan ekstrak batang pisang ambon pada budidaya udang vaname sebagai
dasar aplikasi pada skala lapang.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menguji dosis berbeda ekstrak batang pisang
ambon melalui pakan dalam meningkatkan respons imun, resistensi terhadap
penyakit white spot, perfoma pertumbuhan dan efisiensi penggunaanya pada
budidaya udang vaname.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini dapat dijadikan sebagai salah satu alternatif
pencegahan penyakit viral khususnya white spot sehingga dapat mencegah
kegagalan budidaya akibat infeksi penyakit, dan meningkatkan produksi pada
kegiatan budidaya udang vaname.
3
Hipotesis
Pemberian ekstrak batang pisang ambon melalui pakan dengan dosis yang
lebih rendah dari 0,5 g kg-1 dapat meningkatkan respons imun, resistensi terhadap
penyakit white spot, perfoma pertumbuhan dan efisiensi dalam penggunaannya.
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada September 2015 – April 2016. Analisis
fitokimia bertempat di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Bogor.
Pemeliharaan udang uji bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan Kolam
Percobaan Babakan, Analisis hematologi Bertempat di Laboratorium Kesehatan
Organisme Akuatik, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK), analisis
konfirmasi WSSV dengan PCR bertempat di Balai Penelitian dan Pengembangan
Budidaya Air Tawar Bogor, analisis ekspresi gen bertempat di Laboratorium
Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, BDP-FPIK-IPB.
Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk menguji respons imun udang vaname, yang
diberi ekstrak batang pisang ambon dosis berbeda terhadap serangan WSSV.
Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap terdiri atas 5
perlakuan, yaitu: 2 perlakuan kontrol (kontrol negatif dan positif) dan 3 perlakuan
pemberian pakan mengandung ekstrak batang pisang ambon (Tabel 1). Setiap
perlakuan dibuat tiga ulangan.
Tabel 1 Perlakuan pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan dosis yang
berbeda.
Perlakuan
Keterangan
Kontol
negatif (K-)
Kontrol
positif (K+)
A
B
C
Tanpa penambahan ekstrak batang pisang ambon dan tidak
diinfeksi WSSV
Tanpa penambahan ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi
WSSV
0,1 g kg-1 ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV
0,3 g kg-1 ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV
0,5 g kg-1 ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV
Prosedur Penelitian
Prosedur Ekstraksi Batang Pisang Ambon dengan Maserasi
Batang pisang ambon yang digunakan berasal dari Desa Pabuaran
Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Ekstraksi batang pisang ambon
menggunakan metode Septiana dan Asnani (2012), dan bagian batang pisang
ambon yang telah dipanen berumur sekitar lima bulan, dipotong hingga menjadi
bagian kecil-kecil. Batang pisang diekstraksi menggunakan pelarut etanol 96%.
4
Simplisia batang pisang diekstraksi dengan perbandingan 1:10 (bobot : volume)
antara sampel dan pelarut. Ekstraksi dilakukan menggunakan metode maserasi
selama 24 jam menggunakan Thermoshake dengan kecepatan 160 rpm dan suhu
40 °C Filrat yang diperoleh disaring kemudian dikumpulkan dan diuapkan dengan
rotary evaporator pada suhu 40 °C. Hasil yang diperoleh berupa ekstrak kental
batang pisang ambon.
Analisis Fitokimia
Analisis fitokimia dilakukan di Balai Tanaman Rempah dan Obat
Cimanggu Bogor dengan menggunakan metode thin layer chromatography (TLC)
(Lampiran 1).
Preparasi Pakan
Ekstrak batang pisang ambon dilarutkan terlebih dahulu dalam 300 mL
akuades steril yang sebelumnya telah ditambahkan putih telur sebagai binder pada
konsentrasi 2%. Larutan hasil ekstrak batang pisang ambon dicampurkan secara
merata ke dalam pakan udang komersial yang berprotein 40%. Pakan dikeringanginkan sekitar 1 jam. Pakan yang telah siap dapat langsung digunakan atau
dapat dimasukkan dalam wadah plastik yang tertutup rapat dan disimpan dalam
lemari pendingin dengan suhu 4 ⁰C hingga akan digunakan.
Persiapan Wadah
Prosedur penelitian diawali dengan persiapan wadah. Wadah yang
digunakan adalah akuarium berukuran (65×30×35) cm3. Akuarium dibersihkan
dengan menggunakan sabun detergen, dibilas sampai bersih, didesinfeksi
menggunakan klorin 30 ppm, kemudian dikeringkan selama 24 jam. Setelah
kering akuarium diisi air sebanyak 40 liter per akuarium dan diaerasi satu titik per
akuarium untuk memberikan suplai oksigen pada media pemeliharaan. Akuarium
yang digunakan sebanyak 15 akuarium untuk pengamatan kelangsungan hidup,
dan 5 akuarium untuk uji hematologi.
Persiapan Udang Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah udang vaname yang
berasal dari KJA budidaya udang di Kepulauan Seribu dan bobot badan yang
digunakan 4,18±0,02 gram ekor-1. Sebelum dilakukan pemeliharaan dan
pemberian ekstrak batang pisang ambon selama 29 hari, udang uji terlebih dahulu
diadaptasikan selama 14 hari dalam akuarium perlakuan sebanyak 10 ekor-1
akuarium dan diberi pakan komersial dengan kadar protein 40% secara atsatiation dengan frekuensi pemberian pakan empat kali sehari. Kualitas air media
dipertahankan dengan melakukan penyifonan setiap pagi hari sebanyak 10% dari
total volume akuarium. Sebelum diberi perlakuan, udang uji dipuasakan selama
24 jam dengan tujuan menghilangkan sisa pakan dalam tubuh.
Penyiapan dan Infeksi Virus White Spot
Udang vaname positif terinfeksi WSSV diperoleh dari Balai Perikanan
Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, Jawa Timur yang sebelumnya telah
dikonfirmasi menggunakan PCR. Prosedur pembuatan filtrat WSSV selanjutnya
dilakukan dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh Xie et al. (2004).
Jaringan tubuh udang yang terinfeksi WSSV (tanpa hepatopankreas, usus dan
5
karapaks) ditimbang sebanyak 5 gram, kemudian dicacah menjadi bagian-bagian
kecil dan dihomogenkan dengan 20 mL TN-Buffer (200 mM Tris, 400 mM NaCl,
pH 7,5) menggunakan mortar. Selanjutnya, jaringan udang yang telah
dihomogenkan dengan TN-Buffer disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4 C, kemudian supernatan yang diperoleh
dipindahkan pada wadah mikrotube yang baru dan disentrifugasi kembali pada
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 C. Hasil supernatan yang
diperoleh kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 10-3 dan difilter
menggunakan syringe filter 0,45 μm. Injeksi WSSV dilakukan pada bagian
punggung udang, di antara segmen ketiga dan keempat sebanyak 0,1 mL ekor-1
dengan dosis 10-3 yang diperoleh dari LD50 yang telah dilakukan sebelumnya.
Udang yang digunakan sebagai kontrol negatif diinjeksi menggunakan larutan
phosphate buffer saline (PBS) sebanyak 0,1 mL ekor-1. Uji tantang dilakukan
selama tujuh hari dan selama uji tantang udang diberi pakan serta tidak dilakukan
pergantian air.
Parameter Uji
Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup udang vaname diamati setiap hari hingga akhir
perlakuan. Perhitungan kelangsungan hidup dilakukan di akhir perlakuan dengan
rumus sebagai berikut:
Kelangsungan hidup (%) =
Keterangan : Nt = Jumlah udang akhir (ekor)
No = Jumlah udang awal (ekor)
Relative Percent Survival (RPS)
Pengamatan udang yang mati dilakukan setiap hari selama 29 hari.
Persentase mortalitas tiap perlakuan dibandingkan dengan kontrol dan
kelangsungan hidup relatif (relative percent survival, RPS) dihitung untuk
masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan dengan persamaan Ellis (1988),
sebagai berikut:
RPS (%) = (1) 100
Keterangan:
RPS = Relative percent survival (%)
Mn = Persentase mortalitas udang perlakuan ke-n
M0 = Persentase mortalitas udang kontrol
Respons Imun
Total Hemocyte count (THC)
Pengamatan total hemocyte count (THC) udang vaname dilakukan dengan
mengambil darah udang atau hemolim sebanyak 0,1 ml hemolim ditambahkan
antikoagulan (EDTA 10%) sebanyak 0,7 ml, kemudian dihomogenkan selama 5
menit di dalam microtube. Hemolim kemudian dihitung dengan haemocytometer
6
di bawah mikroskop pada perbesaran 40 kali, kemudian dihitung berdasarkan
rumus berikut:
THC (sel/mm3)= rata-rata ∑sel terhitung x
x FP x 1000
Keterangan: FP = Faktor Pengenceran
Aktivitas Prophenoloxidase (proPO)
Aktivitas
prophenoloxidase
diukur
dengan
menggunakan
spektrofotometrik dengan mencatat perubahan bentuk dopachrome yang
diproduksi dari L-dihidroxyphenylalanine (L-DOPA) menggunakan metode yang
digunakan Liu dan Chen (2004) dengan cara mengambil sampel hemolim dari
satu ekor udang pada masing-masing perlakuan dan digabung. Pengambilan
sampel dilakukan sebelum perlakuan, sebelum uji tantang, hari ke-1, ke-3, ke-5
dan ke-7 pascauji tantang (Lampiran 2).
Respiratory Burst (RB)
Respiratory burst dari hemosit udang diukur menggunakan metode yang
dilakukan Immanuel et al. (2012) berdasarkan reduksi NBT (nitroblue
tetrazolium) sebagai ukuran superoxide anion (O2-) dengan cara mengambil
sampel hemolim dari satu ekor udang pada masing-masing perlakuan dan
digabung. Pengambilan sampel dilakukan sebelum perlakuan, sebelum uji
tantang, hari ke-1, ke-3, ke5 dan ke-7 pascauji tantang (Lampiran 2).
Aktivitas Fagositik
Aktivitas fagositik diukur menggunakan metode yang dilakukan Immanuel
et al. (2012) dengan cara mengambil sampel hemolim dari satu ekor udang pada
masing-masing perlakuan dan digabung. Pengambilan sampel dilakukan sebelum
perlakuan, sebelum uji tantang, hari ke-1, ke-3, ke-5 dan ke-7 pascauji tantang
(Lampiran 2).
Konfirmasi Keberadaan WSSV Menggunakan PCR
Pemeriksaan virus dengan metode PCR dilakukan guna mengkonfirmasi
keberadaan virus WSSV pada udang vaname menggunakan metode yang telah
dikembangkan oleh Nunan dan Lightner (2011) dengan tetap melakukan optimasi
sesuai dengan kondisi. Optimasi dilakukan terhadap suhu annealing, konsentrasi
MgCl2, dan konsentrasi templat DNA sampel. Primer yang digunakan WSSV-F
5′-GAA ACT ATT GAA AAG GCT TTC CCT C-3′ WSSV-R 5′-GTT CCT TAT
TTA CTA CTA CGG CAA-3′. Konsentrasi PCR yang diperlukan adalah 1x bufer
PCR yang mengandung MgCl2, 250 µM dNTPmix, 1.25 U Ex Taq Polymerase,
masing-masing 0,4 µM primer F dan R, dan 5 µL sampel. Reaksi PCR dilakukan
pada tabung 0,2 mL dengan konsentrasi total dibuat menjadi 20 µL dengan
menambahkan distilled water. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: denaturasi
awal 95 C selama lima menit, diikuti dengan 35 siklus denaturasi 95 C 30 detik,
annealing 60 C selama satu menit, dan ekstensi 72 C selamat satu menit, serta
ekstensi akhir pada suhu 72 C selama lima menit.
7
Gejala Klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan secara visual setiap hari pascauji
tantang hingga akhir pemeliharaan. Gejala klinis yang diamati sama dengan
pengamatan yaitu meliputi perubahan pola renang dan tingkah laku, respons
terhadap pakan, serta patologi makroskopis organ luar udang vaname.
Rasio Konversi Pakan
Rasio konversi pakan atau feed convertion ratio (FCR) udang vaname
selama pemeliharaan dihitung menggunakan rumus (Yang et al. 2015) :
FCR =
Keterangan:
FCR= Konversi pakan
Fi = Jumlah pakan yang diberikan (gram)
Fw = Biomassa udang pada saat akhir perlakuan (gram)
Iw = Biomassa udang pada saat awal perlakuan (gram)
Laju Pertumbuhan Spesifik
Laju pertumbuhan spesifik udang uji dihitung berdasarkan persamaan
berikut (Zhang et al. 2014):
Gw =
Keterangan:
LPS = Laju pertumbuhan spesifik (%)
W1 = Bobot udang pada akhir penelitian
W0 = Bobot udang pada awal penelitian
T = Lama pemeliharaan (hari)
Analisis Ekspresi Gen Prophenoloxydase (proPO)
Analisis gen proPO dilakukan untuk mendapatkan informasi tentang
ekspresi gen proPO akibat pemberian ekstrak batang pisang ambon dengan cara
mengambil sampel hemolim dari tiga ekor udang vaname pada masing-masing
perlakuan dan digabung. Pengambilan sampel perlakuan K+ (tanpa pemberian
ekstrak batang pisang ambon dan diinfeksi WSSV) dan C (pemberian ekstrak
batang pisang ambon dengan dosis 0,5 g kg-1 dan diinfeksi WSSV) dilakukan 24
jam pascauji tantang kemudian untuk pengambilan sampel pada perlakuan Cdilakukan setelah pemeliharaan kembali selama 29 hari. Tahapan ekstraksi RNA
dan sintesis cDNA proPO dilakukan seperti yang dijelaskan Zokaeifar et al. 2012
(Lampiran 3).
Kualitas Air
Pengukuran kualitas air media pemeliharaan udang dilakukan dua kali
selama penelitian, yaitu pada awal dan akhir perlakuan hari ke-1 dan 29.
Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu (°C), salinitas (g L-1), oksigen
8
terlarut (DO) (mg L-1), TAN (mg L-1) dan pH. Pengukuran kualitas air langsung
pada wadah penelitian menggunakan alat pengukur masing-masing parameter,
yaitu: salinitas (salinity AZ-8371), pH (pHep hanna instrument), suhu dan DO
(dissolved oxygen meter Lutron DO-5509) (Lampiran 4).
Efisiensi Biaya Ekstrak Batang Pisang Ambon
Efisiensi biaya ekstrak batang pisang ambon bertujuan untuk
membandingkan seberapa efisien penggunaan ekstrak batang pisang ambon pada
budidaya udang vaname apabila ditinjau dari budidaya udang vaname sebanyak
100 ekor. Nilai efisiensi ditentukan dengan membandingkan biaya ekstrak batang
pisang ambon dihitung berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan seperti
perhitungan biaya pelarut etanol, bobot individu berdasarkan berat biomassa akhir
penelitian dibagi 30 ekor udang uji, jumlah pakan dihitung berdasarkan bobot
individu dikalikan 100 ekor, kemudian dikalikan rasio konversi pakan yang
diperoleh selama penelitian, biaya pakan berdasarkan biaya ekstrak dikalikan
jumlah pakan yang digunakan, kemudian dibagi 1000, serta bahan-bahan yang
digunakan untuk preparasi pakan menggunakan ekstrak batang pisang ambon
berupa putih telur, tween 80, akuades, biaya penyewaan alat rotary evaporator.
Analisis Data
Data dianalisis menggunakan Ms. Excel dan diuji statistik menggunakan
software SPSS 17,0 bila berbeda nyata diuji lanjut dengan menggunakan uji
Duncan pada taraf nyata 5%.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kelangsungan hidup (KH) dan relative percent survival (RPS) udang uji pada
masa uji tantang
Secara umum nilai KH udang pada perlakuan ekstrak batang pisang
ambon (66,67-100,00%) lebih tinggi dibandingkan perlakuan kontrol positif
(53,33%). Hal tersebut mengindikasikan bahwa pemberian ekstrak batang pisang
ambon mampu meningkatkan kelangsungan hidup udang vaname terhadap infeksi
WSSV pascauji tantang. Kelangsungan hidup udang vaname dengan pemberian
ekstrak batang pisang ambon menunjukkan perlakuan C menghasilkan nilai KH
lebih tinggi (P