Variasi gen cytochrome oxidase i (coi) pada lebah trigona di desa batu kucing dan desa bungku, jambi
VARIASI GEN CYTOCHROME OXIDASE I (COI) PADA LEBAH
Trigona DI DESA BATU KUCING DAN DESA BUNGKU, JAMBI
RYZKA ANNISA BAHER
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Variasi Gen
Cytochrome Oxidase I (COI) pada Lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa
Bungku, Jambi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Ryzka Annisa Baher
NIM G34090063
ABSTRAK
RYZKA ANNISA BAHER. Variasi Gen Cytochrome Oxidase I (COI) pada
Lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi. Dibimbing oleh
RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA.
Lebah Trigona merupakan salah satu serangga polinator yang berperan
dalam ekosistem. Pendataan keanekaragaman Trigona secara morfologi telah
dilakukan di Indonesia, namun pendataan secara molekular dengan variasi gen
Cytochrome Oxidase I (COI) belum dilakukan. Penelitian ini bertujuan
menganalisis kekerabatan antar tiga spesies Trigona dan mempelajari variasi gen
Cytochrome Oxidase I (COI) pada lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa
Bungku, Jambi. Jumlah sampel yang dianalisis sebanyak dua individu pada T.
fuscobalteata, T. laeviceps asal Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi.
Primer gen COI di disain berdasarkan Melipona bicolor dari Genbank. Hasil
sekuen gen COI Trigona secara parsial menghasilkan panjang nukleotida T.
fuscobalteata dan T. laeviceps berturut-turut sebesar 724 dan 908 pb dengan
komposisi AT yang tinggi. Alignment sekuen asam amino T. fuscobalteata, T.
laeviceps dan T. chanchamayoensis dengan outgroup Melipona bicolor
menunjukkan daerah yang conserve sebanyak 161 pb dan variasi ditemukan pada
19 pb. Analisis jarak genetik tertinggi diperoleh antara M. bicolor dengan T.
laeviceps sebesar 0.023. Konstruksi filogeni dilakukan menggunakan metode
Maximum Parsimony (MP) dan Neighbour Joining (NJ). Hasil kedua konstruksi
filogeni menunjukkan kesamaan T. laeviceps memiliki kekerabatan yang dekat
dengan T. fuscobalteata dibandingkan T. chanchamayoensis.
Kata kunci: gen COI, DNA mitokondria, Trigona
ABSTRACT
RYZKA ANNISA BAHER. Variation of Cytochrome Oxidase I (COI) Gene of
Trigona Bee from Desa Batu Kucing and Desa Bungku, Jambi. Supervised by
RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA.
Trigona stingless bees are one of many pollinator insects, which have
important role in ecosystem. Morphology of the diversity of Trigona in Indonesia
had been explored, however the molecular data of Trigona based on the variation
of Cytochrome Oxidase I (COI) gene had not been carried out. This research was
aimed to analyze the relationships between species of Trigona and to study the
variation of COI gene of Trigona bees from Desa Batu Kucing and Desa Bungku,
Jambi. Two samples of T. fuscobalteata, T. laeviceps from Batu Kucing Village
and Bungku Village, Jambi were analysed. COI gene primer were designed based
in Melipona bicolor from Genbank. The partial sequence of COI gene are 724 bp
and 725 bp from T. fuscobalteata and T. laeviceps, respectively with AT rich
composition. The alignment of amino acid sequen T. fuscobalteata, T. laeviceps
and T. chanchamayoensi and outgroup of Melipona bicolor show that there are
161 bp of conserve and 19 bp of variation regions. Genetic distance between M.
bicolor with T. fuscobalteata and M. bicolor with T. fuscobalteata.is 0.096.
Phylogeny construction using Neighbour Joining (NJ) methode by using JonesTaylor-Thornton (JTT) model showed that T. fuscobalteata had closer relationship
with that of T. laeviceps compare to T. chanchamayoensis.
Keywords: COI gene, Mitochondrial DNA, Trigona
VARIASI GEN CYTOCHROME OXIDASE I (COI) PADA LEBAH
Trigona DI DESA BATU KUCING DAN DESA BUNGKU, JAMBI
RYZKA ANNISA BAHER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Variasi Gen Cytochrome Oxidase I (COI) pada Lebah Trigona di
Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi
Nama
: Ryzka Annisa Baher
NIM
: G34090063
Disetujui oleh
Dr Ir Rika Raffiudin, MSi
Pembimbing I
Drs M. Chandra Widjaja, MM
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah dengan judul “Variasi Gen Cytochrome
Oxidase I (COI) pada Lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa Bungku,
Jambi” berhasil diselesaikan. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan sejak bulan
September 2013 sampai Februari 2014 di di laboratorium bagian Fungsi Hayati
dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Rika Raffiudin, MSi dan
Bapak Drs M. Chandra Widjaja, MM atas bimbingan dan pengarahan yang telah
diberikan, serta Prof Dr Alex Hartana selaku anggota komisi pendidikan. Terima
kasih kepada Bapak, Mama, serta seluruh keluarga atas setiap dukungan terbaik
yang diberikan sejak lahir sampai menyelesaikan studi ini. Ungkapan terima kasih
juga ditujukan kepada Andi Trisnandi, Lilia, Icha, Kak Uce, Kak Gina, Kak Eni,
Bapak Adi, sahabat Wisma Balio Atas (Ulfah, Irna, Kak Ida, Lintang, Fawwarah,
Dina, dan lainnya), dan teman-teman Biologi 46 untuk semangat, bantuan dan
kerja samanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2014
Ryzka Annisa Baher
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Bahan dan Alat
2
Tahapan Analisis DNA
3
Ekstraksi DNA
3
Amplifikasi DNA
3
Visualisasi DNA
4
Sekuen dan Analisis Bioinformatika
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Amplifikasi DNA Gen COI Trigona
6
Sekuen DNA Gen COI Trigona dan Analisis Bioinformatika
6
Analisis Homologi Asam Amino COI Trigona
9
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni
10
SIMPULAN
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
18
DAFTAR TABEL
1. Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Trigona berdasarkan M.
bicolor dan T. laeviceps
2. Data sampel ingroup Trigona dan outgroup Melipona dan
Tetragonisca yang digunakan untuk analisis gen COI
3. Homologi tertinggi gen COI T. fuscobalteata dan T. laeviceps
dengan database nukleotida pada Genbank menggunakan BLAST-N
(www.ncbi. nlm.nih.gov/blastn)
4. Homologi tertinggi asam amino protein COI T. fuscobalteata dan T.
laeviceps dengan database asam amino pada Genbank menggunakan
BLAST-P (www.ncbi. nlm.nih.gov/blastp)
5. Jarak genetik asam amino gen COI tiga spesies Trigona hasil
penelitian ini dengan outgroup Melipona
4
5
9
9
11
DAFTAR GAMBAR
1. Susunan sarang pada koloni T. laeviceps di ruas bambu (Wati 2013)
2. Morfologi Trigona: a. T. fuscobalteata, b. T. laeviceps (Soegiarso
2013)
3. Pita DNA T. laeviceps.
4. Amplikon pita DNA gen COI lebah Trigona
5. Sekuen gen COI T. fuscobalteata dan deduksi asam amino.
6. Sekuen gen COI T. laeviceps dan deduksi asam amino.
7. Penyejajaran asam amino putative gen COI tiga spesies Trigona dan
M. bicolor.
8. Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Neighbour Joining (NJ) dengan model JonesTaylor-Thornton (JTT).
9. Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Maximum Parsimony (MP).
2
2
4
6
7
8
10
11
11
DAFTAR LAMPIRAN
1. Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T.
fuscobalteata menggunakan primer forward Trg.COI.F
2. Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T.
fuscbalteata menggunakan primer reverse Trg.COI.R
16
17
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lebah Trigona (Hymenoptera: Apidae) merupakan spesies lebah yang
tergolong dalam stingless bee atau lebah tak bersengat. Trigona tergolong dalam
kelompok serangga sosial tingkat tinggi karena terdapat pembagian kasta yang
jelas pada koloni (Michener 2000). Pada setiap koloni Trigona berjumlah 300
sampai 800.000 lebah. Trigona membuat sarang pada tempat berongga seperti
celah-celah dinding, ruas bambu di dalam rumah atau pada rongga pada pohon
yang hidup (Free 1982). Pada tanaman stroberi, penyerbukan oleh lebah Trigona
laeviceps dan Apis cerana dapat meningkatkan pembentukan buah dan
menurunkan persentase buah abnormal (Harahap 2010). Peran Trigona lainnya
yakni pemanfaatan propolis sebagai anti mikrobial telah digunakan secara luas
oleh masyarakat (Fatoni et al. 2008).
Distribusi Trigona tersebar di wilayah dataran rendah tropis dan beberapa
subtropis yaitu sebagian besar Afrika Selatan, Amerika Selatan, dan Asia
Tenggara (Free 1982). Distribusi Trigona yang luas mengindikasikan adanya
keragaman spesies Trigona pada masing-masing wilayah. Beberapa penelitian di
Indonesia menunjukkan adanya keragaman Trigona, yaitu 23 spesies Trigona
ditemukan di Sumatra Barat (Sakagami et al. 1990) dan 10 spesies dari 23
spesies Trigona ditemukan di Jambi di antaranya Trigona fuscobalteata dan
Trigona laeviceps (Gambar 2) (Soegiarso 2013).
Gen Cytochrome Oxydase subunit I (COI) merupakan gen mtDNA yang
telah digunakan secara luas dalam teknik identifikasi molekular dalam Kingdom
Animalia. Genom mtDNA memiliki pewarisan yang bersifat maternal dalam
jumlah kopi salinan yang banyak dan memiliki bagian yang konservatif,
sehingga banyak digunakan dalam analisis variasi genetik (Simon et al. 2006).
Teknik identifikasi molekular menggunakan gen COI sebagai DNA barkode
dengan standar panjang basa nukleotida sebesar 648 pb (Hebert et al. 2003a;
Hebert dan Gregory 2005; Hajibabaei et al. 2006). Bagian yang konservatif pada
gen COI dapat dikenali pada hampir semua filum dari divisi Animalia, sehingga
dapat digunakan sebagai DNA barkode (Hebert et al. 2003a, 2003b).
Trigona merupakan salah satu serangga penting, yakni sebagai polinator
dalam rantai makanan ekosistem dan sebagai bioindikator adanya transformasi
ekosistem. Lebah Trigona merupakan salah satu serangga penyerbuk yang sangat
potensial pada tanaman pertanian dan perkebunan. Trigona pada umumnya
menjadi serangga polinator utama pada bunga yang berukuran kecil (Michener
2000). Usaha konservasi Trigona perlu dilakukan secara berdampingan baik
secara fisik maupun molekuler.
Pendekatan molekuler untuk identifikasi keragaman spesies Trigona
sangat penting dilakukan karena belum banyak data yang tersedia. Pendekatan
molekuler Trigona dapat dilakukan dengan melakukan pendataan terhadap
variasi gen COI. Data molekuler variasi gen COI Trigona dapat digunakan
sebagai data parsial pendukung dalam teknik bioidentifikasi DNA barkode.
Penggunaannya sebagai DNA barkode diharapkan dapat mempermudah proses
identifikasi apabila terjadi keterbatasan berupa perolehan spesimen yang tidak
lengkap atau hanya berupa salah satu organ, misal tungkai dan perolehan
2
spesimen pada fase hidup tertentu, misal telur, larva, pupa, atau imago (Herbert
et al. 2003a). Pendataan terhadap keragaman gen COI Trigona baru dilakukan
pada tiga spesies, diantaranya T. amalthea (No. Akses AF214669.1) (Tanaka et
al. 2001), T. chancamayeonsis (No. Akses KC853315.1) dan T. spinipes (No.
Akses KC853314.1) (Francoso dan Arias 2013).
Gambar 1 Susunan sarang pada koloni T. laeviceps di ruas bambu (Wati 2013)
a
b
Gambar 2 Morfologi Trigona: a. T. fuscobalteata, b. T. laeviceps (Soegiarso
2013)
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis kekerabatan antar spesies Trigona
dan mempelajari variasi gen Cytochrome Oxidase I (COI) pada lebah Trigona di
Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi .
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan meliputi sampel lebah T. fuscobalteata dan T.
laeviceps hasil koleksi Dr Ir Rika Raffiudin, MSi dari pedesaan di sekitar Taman
Nasional Bukit Duabelas, yakni Desa Batu Kucing dengan koordinat lokasi
S02.15084 – E102.80189 dan Hutan Hujan Harapan di Desa Bungku 2 dengan
koordinat lokasi S01.90878–E103.26059. Hasil koleksi Trigona diawetkan
dalam etanol absolut. Jumlah sampel yang dianalisis sebanyak dua individu pada
masing-masing spesies. Identifikasi spesies Trigona dilakukan oleh Soegiarso
(2013) berdasarkan Sakagami et. al (1990).
3
Tahapan Analisis DNA
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode Cetyl Trimethyl
Ammonium Brommida (CTAB) berdasarkan Sambrook et al. (1989) dengan
modifikasi presipitasi etanol berdasarkan Raffiudin dan Crozier (2007). Jumlah
sampel yang diekstraksi ialah 2 individu pada masing-masing spesies Trigona.
Persiapan ekstraksi, sampel dimasukkan ke dalam 400 µl larutan Tris-HCL
EDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; EDTA 0.2 M; air destilata) sebanyak 3 kali
pergantian selama selang waktu 4 jam untuk menghilangkan etanol absolut yang
terdapat dalam jaringan.
Sumber DNA yang diekstraksi berasal dari bagian toraks Trigona. Sampel
dipisahkan menggunakan scalpel steril dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml.
Kemudian sampel direndam dalam nitrogen cair (20 menit) dan digerus sampai
hancur menggunakan penggerus steril. Larutan buffer CTAB 0.2% (b/v) (7.5 ml
1M Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air
hingga 75 ml) sebanyak 500 µl ditambahkan pada tabung untuk mendegradasi
membran sel. Tabung yang berisi sampel ditambahkan 10 µl Proteinase-K
(5mg/ml), kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C (2 jam). Setelah inkubasi,
tabung disentrifugasi pada 12.000 rpm (10 menit). Supernatan dipindahkan ke
tabung baru, lalu ditambahkan 250 µl larutan PCI (Phenol: Chloroform: Isoamyl
alcohol = 25: 24: 1). Tabung digoyang perlahan (1 menit), kemudian
disentrifugasi pada 12 000 rpm (5 menit). Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan
atas yang berisi DNA dan lapisan bawah atau lapisan PCI. Lapisan yang berisi
DNA dipindahkan ke dalam tabung baru, lalu ditambahkan 400 µl larutan CIAA
(Chloroform: Isoamyl alcohol = 24: 1) dan digoyang perlahan (5 menit). Tabung
disentrifugasi pada 12.000 rpm (3 menit). Lapisan bagian atas yang berisi DNA
dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 600 µl larutan isopropanol,
selanjutnya disimpan pada suhu -4 °C selama (kurang lebih) 12 jam.
Presipitasi DNA dilakukan pada suhu 4 °C dan disentrifugasi pada
kecepatan 13.000 rpm (30 menit). Isopropanol yang terdapat dalam tabung
dibuang, kemudian ditambahkan etanol 70%. Sentrifugasi kembali dilakukan
pada kecepatan dan suhu yang sama (10 menit). Selanjutnya, etanol 70% pada
tabung dibuang dan dilakukan pengeringan pelet DNA dengan vakum (30 menit).
Tabung berisi DNA murni ditambahkan 20 µl larutan TE 0.5 mM dan disimpan
pada suhu 4 °C.
Amplifikasi DNA
DNA hasil esktraksi diamplifikasi dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC 1).
Fragmen DNA yang diamplifikasi ialah gen COI pada Trigona. Desain primer
dilakukan oleh peneliti berdasarkan genom lengkap mitokondria Melipona
bicolor (Silvestre et al. 2008) dengan kode akses Genbank AF466146.1.
Pasangan primer hasil desain ialah primer forward F1.Tg_Jmb_COI dan primer
reverse R2.Tg_Jmb_COI (Tabel 1).
Amplifikasi pertama dilakukan pada dua individu T. laeviceps
menggunakan primer forward F1.Tg_Jmb_COI dan reverse R2.Tg_Jmb_COI.
Hasil amplifikasi dikirim ke perusahaan jasa sekuen dan menunjukkan adanya
pita ganda sehingga perlu dilakukan klon (Gambar 3). Proses klon dilakukan
4
pada pita DNA yang berukuran lebih besar (bagian atas). Desain primer
dilakukan untuk kedua kalinya berdasarkan sekuen hasil klon yaitu sekuen T.
laeviceps. Hasil desain primer berupa pasangan primer forward Trg.COI.F dan
primer reverse Trg.COI.R (Tabel 1).
Total pereaksi yang digunakan dalam amplifikasi adalah 20 µl, terdiri atas
6.8 µl akuades steril, 0.8 µl primer forward, 0.8 µl primer reverse, 10 µl Kapa
Taq Ready Mix DNA Polymerase buffer (buffer Mg2+1.5 mM, dNTP 0.4 mM,
Kapa Taq DNA Polymerase 0.05 U/ µl) dengan penambahan 0.6 µl MgCl2 1.5
mM, dan 1 µl DNA hasil ekstraksi. Amplifikasi dilakukan dengan PCR dalam 5
tahapan dengan kondisi; predenaturation pada suhu 95 °C (2 menit),
denaturation DNA pada suhu 95 °C (2 menit), annealing pada suhu 50 °C (30
detik), elongation pada suhu 72 °C (1 menit), dan post-elongation pada suhu
72 °C (2 menit).
Tabel 1 Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Trigona berdasarkan M.
bicolor dan T. laeviceps
No
Urutan basa (5’-3’)
Primer
Posisi primer
pada mtDNA
M. bicolor (No.
Akses
AF466146.1
Primer didesain berdasarkan M. bicolor
F1.Tg_Jmb_COI TGCTTTATGATCAGGAATAATTGG
60-83
R2.Tg_Jmb_COI TAAAATATGCTCGTGTATCAATAT
886-910
Primer didesain berdasarkan T. laeviceps
Trg.COI.F
CTCTCTAGTTACAGGTCATGCA
25-46
Trg.COI.R
CTCGTGTATCAATATCGAGTCC
871-892
A
Keterangan :
A
: single band yang
dilakukan clone
M
: marker
Tl.1.2 : T. laeviceps koloni 1
individu ke 2
Gambar 3 Pita DNA T. laeviceps.
Visualisasi DNA
Amplikon gen COI Trigona dimigrasikan menggunakan Polyacrilamyde
Gel Electrophoresis (PAGE) konsentrasi 6% dengan komposisi berupa; 12 ml
akuades; 4 ml TBE 5x ((Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M); 4 ml
acrylamide 30%; 15 µl Tetramethyl Ethylene Diamine (TEMED); 150 µl
5
Amonium Peroxo Sulfat (APS) 10%. Migrasi dilakukan pada tegangan 200 V
selama 55 menit. DNA divisualisasi dengan metode pewarnaan perak nitrat
(Byun et al. 2009).
Sekuen dan Analisis Bioinformatika
Variasi genetik COI untuk T. fuscobalteata dan T. laeviceps dianalisis
menggunakan metode sekuensing pada perusahaan jasa sekuen. Hasil sekuen
diedit dan dianalisis menggunakan program Bioedit Sequence Alignment dan
Genetyx Win Version 4.0. Sekuen DNA forward dan reverse di-alignment
menggunakan program Clustal X untuk mendapatkan hasil sekuen DNA utuh.
Hasil sekuen dilakukan Basic Local Alignment Search Tool–Nucleotide
(BLAST-N) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) sebagai pembanding antara sekuen
nukleotida hasil penelitian ini dengan nukleotida database Genbank untuk
mengetahui nilai persentase homologi, e-value, dan persentase query cover.
Nilai e-value merupakan parameter yang menggambarkan tingkat harapan secara
eksponensial saat proses pencarian database (McEntyre & Ostell 2002).
Semakin rendah nilainya, maka semakin signifikan dan dapat dipercaya. Nilai
query cover merupakan persentase dari kecocokan yang meliputi sekuen input
dengan sekuen yang terdapat dalam database (McEntyre & Ostell 2002)
Sekuen DNA ditranslasikan menjadi asam amino putative menggunakan
program Genetyx Win Version 4.0. Hasil sekuen asam amino dilakukan atau
Basic
Local
Alignment
Search
Tool
–
Protein,
BLAST-P
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)
Analisis Jarak Genetik dan Filogeni
Hasil sekuen DNA di-alignment dengan program Clustal X2.1 dan MEGA
5 untuk memperoleh variasi asam amino masing-masing spesies dan analisis
pohon filogeni (Tamura et al. 2011). Penentuan jarak genetik dan analisis
filogeni dilakukan berdasarkan hasil penjajaran sekuen asam amino T.
fuscobalteata, T. laeviceps, T. chanchamayoensis sebagai ingroup dengan M.
bicolor sebagai outgroup (Tabel 2) menggunakan model Jones-Taylor-Thornton
(JTT). Penggunaan outgroup dilakukan untuk mengetahui spesies yang paling
primitif. Selanjutnya, konstruksi filogeni gen COI dilakukan dengan metode
Maximum Parsimony (MP) menggunakan tingkat kepercayaan bootstrap 1000x.
Tabel 2 Data sampel ingroup Trigona dan outgroup Melipona dan Tetragonisca
yang digunakan untuk analisis gen COI
No
Sampel
Ingroup
1.
T. fuscobalteata
2.
T. laeviceps
3.
T. chanchamayoensis
Outgroup
4.
M. bicolor
Lokasi/ Asal
No. Akses Genbank
Jambi
Jambi
Brazil
KC853315.1
Brazil
AF466146.1
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA Gen COI Trigona
Hasil amplifikasi gen COI Trigona menunjukkan ukuran pita DNA yang
sama, yakni ± 800 pasang basa (pb) (Gambar 4). Hasil amplikon T. laeviceps
pada sumur 5-8 (Gambar 4) dengan ukuran pita DNA 800 pb sesuai dengan
prediksi gen target COI Trigona sebesar 827 bp dengan primer forward
F1.Tg_Jmb_COI dan reverse R2.Tg_Jmb_COI berdasarkan genom mitokondria
M. bicolor (AF466146.1) (Silvestre et al. 2008). Sama halnya dengan amplikon
pita DNA gen COI T. fuscobalteata pada sumur 1-4 (Gambar 4) sesuai dengan
prediksi gen target COI berdasarkan gen COI T. laeviceps sebesar 846 bp
menggunakan primer forward Trg.COI.F dan reverse Trg.COI.R.
pb M
900
800
700
600
1
2
3
4
5
6
7
8
Keterangan :
1-4 : T. fuscobalteata
5-8 : T. laeviceps
M : marker dengan ladder
100 pb
Gambar 4 Amplikon pita DNA gen COI lebah Trigona
Sekuen DNA Gen COI Trigona dan Analisis Bioinformatika
Hasil sekuen gen COI yang diperoleh berupa kromatogram dengan
panjang basa nukleotida yang beragam yakni T. fuscobalteata sebesar 724 pb
dan T. laeviceps sebesar 908 pb (Gambar 5 dan 6, Lampiran 1 dan 2). Hasil
sekuen menunjukkan komposisi AT yang tinggi pada kedua spesies yakni T.
fuscobalteata sebesar 66.35% dan T. laeviceps sebesar 67.58%. Hal ini
menunjukkan adanya kesesuaian dengan komposisi AT yang tinggi pada DNA
mitokondria lebah (Crozier 1989). Namun, kedua spesies Trigona memiliki
komposisi AT yang lebih rendah dibandingkan dengan Apis, yakni Apis cerana
74.57% dan A. koschevnikovi 75.5 % (Dzulfaqor 2011 dan Nugroho 2011).
Analisis bioinformatika dengan BLAST-N dan BLAST-P dilakukan
sebagai dasar dalam menentukan tingkat ketepatan suatu sekuen. Hasil BLASTN pada T. laeviceps menunjukkan sekuen yang homolog adalah dengan gen COI
M. bicolor dengan nilai kesamaan (identity) sebesar 82%, nilai e-value 0.0 dan
query cover sebesar 95%, sedangkan homologi tertinggi pada T. fuscobalteata
ialah Tetragonisca angustula MP100 gen COI dengan nilai kesamaan 83%, nilai
e-value 2e-165 dan query cover sebesar 95% (Tabel 3).
Nilai e-value BLAST-N pada T. laeviceps dan T. fuscobalteata yang
mendekati nol menandakan ketepatan yang signifikan dan bukan karena
kebetulan. Nilai query cover mendekati 95% pada T. laeviceps dan T.
fuscobalteata menunjukan tingginya presentase kecocokan antara sekuen
tersebut dengan sekuen yang terdapat dalam database. Ketiga hal tersebut dapat
digunakan sebagai dasar untuk menyatakan bahwa sekuen tersebut sebagai
sekuen yang tepat berdasarkan nilai persentase homologi, nilai e-value, dan
persentase query cover (McEntyre & Ostell 2002).
7
[1]
10
20
30
40
50
60
[2] ACAGGTCATGCATTTTTAATAATTTTTTTTATAGTTATACCCTTTATAATTGGGGGATTT
[3] T G H A F L M I F F M V M P F M I G G F
70
80
90
100
110
120
GGGAATTTTCTTATTCCTCTAATGCTAGGTTCTCCTGATATAGCTTTTCCGCGTATAAAT
G N F L I P L M L G S P D M A F P R M N
130
140
150
160
170
180
AATATCAGATTTTGACTCTTGCCTCCCTCTTTATTGCTTCTTCTTTTTAGAAATTTTTTT
N I S F W L L P P S L L L L L F S N F F
190
200
210
220
230
240
TTTCCTAGATCAGGTACTGGTTGAACAGTTTACCCCCCCTTATCTTCATACCTATATCAT
F P S S G T G W T V Y P P L S S Y L Y H
250
260
270
280
290
300
CCTTCTCCTTCTGTAGATTTTACTATCTTTTCAATTCACATAACTGGAATTTCGTCTATT
P S P S V D F T I F S I H M T G I S S I
310
320
330
340
350
360
TTAGGATCTTTAAATTTTATTGTAACTATTTTTATAATAAAAAATATTTCTCTTGACTAT
L G S L N F I V T I F M M K N I S L D Y
370
380
390
400
410
420
GATCGAATTAGGTTATTTTCCTGGTCTATCTCAGTTACTGTAATTTTACTAATTTTGTCC
D R I S L F S W S I S V T V I L L I L S
430
440
450
460
470
480
TTACCTGTATTGGCTGGAGCAATTACAATACTTTTGTTTGATCGAAACTTTAATACATCT
L P V L A G A I T M L L F D R N F N T S
490
500
510
520
530
540
TTTTTTGATCCAATAGGAGGAGGAGATCCAATTCTTTACCAGCATCTTTTCTGATTTTTT
F F D P M G G G D P I L Y Q H L F W F F
550
560
570
580
590
600
GGACATCCGGAAGTTTATATTCTTATTCTTCCCGGGTTTGGACTAATTTCACAAATTATT
G H P E V Y I L I L P G F G L I S Q I I
610
620
630
640
650
660
ATAAACGAGAGTGGAAAGAAAGAGGTGTTTGGAAACTTGAGAATGATCTATGCAATAGTA
M N E S G K K E V F G N L S M I Y A M V
670
680
690
700
710
720
GGTATTGGGTTTCTTGGATTTATTGTTTGAGCTCATCACATATTTACGGTCGGACTCGAT
G I G F L G F I V W A H H M F T V G L D
730
ATTG
I
Keterangan :
[1] : nomor nukleotida
[2]: sekuen nukleotida T. laeviceps
[3] : deduksi asam amino dengan singkatan
satu huruf
Gambar 5 Sekuen gen COI T. fuscobalteata dan deduksi asam amino.
8
[1]
10
20
30
40
50
60
[2]
AGAGCGGCCGCCAGATCTTCCGGATGGCTCGAGTTTTTCAGCAAGATTGCTTTATGATCA
[3] S A A A S S S G W L E F F S K I A L W S
70
80
90
100
110
120
GGAATAATTGGATCCTCTTTTAGAATACTAATTCGTATAGAATTGAATAGACCCGGAATA
G M I G S S F S M L I R M E L N S P G M
130
140
150
160
170
180
TGAATTAGAAATGATCAAATCTACAACTCTCTAGTTACAGGTCATGCATTTCTAATAATC
W I S N D Q I Y N S L V T G H A F L M I
190
200
210
220
230
240
TTTTTCATGGTTATACCTTTTATAATTGGGGGGTTTGGAAACTTCTTAATTCCGTTAATA
F F M V M P F M I G G F G N F L I P L M
250
260
270
280
290
300
CTGGGATCTCCTGATATAGCTTTTCCTCGTATAAACAATATTAGATTTTGGTTACTTCCT
L G S P D M A F P R M N N I S F W L L P
310
320
330
340
350
360
CCAGCATTGATATTACTTCTATTCAGAAACTTTATTTTCCCTAGATCAGGAACTGGATGA
P A L M L L L F S N F I F P S S G T G W
370
380
390
400
410
420
ACTGTATATCCCCCCCTTTCATCTTATCTTTATCATCCTTCTCCTTCTGTAGATTTTACT
T V Y P P L S S Y L Y H P S P S V D F T
430
440
450
460
470
480
ATTTTTTCTATCCACATGACTGGAATTTCATCTATTTTAGGTTCACTAAACTTTATTGTA
I F S I H M T G I S S I L G S L N F I V
490
500
510
520
530
540
ACAATTTTTATAATAAAAAACTTTTCTCTTAATTACGACCAGATTGGGCTCTTTTCTTGA
T I F M M K N F S L N Y D Q I G L F S W
550
560
570
580
590
600
TCAATTTCAGTGACCGTAATTTTGTTAATTATTTCCTTACCTGTATTGGCAGGAGCTATT
S I S V T V I L L I I S L P V L A G A I
610
620
630
640
650
660
ACTATGCTCTTGTTTGATCGAAATTTCAACACATCATTTTTTGACCCAATAGGAGGAGGT
T M L L F D R N F N T S F F D P M G G G
670
680
690
700
710
720
GATCCAATTCTTTACCAGCATCTTTTCTGGTTTTTTGGACATCCAGAAGTCTATATCCTA
D P I L Y Q H L F W F F G H P E V Y I L
730
740
750
760
770
780
GTCCTTCCTGGATTTGGCCTTATCTCGCAAATTATCATAAACGAGAGAGGAAAAAAGGAA
V L P G F G L I S Q I I M N E S G K K E
790
800
810
820
830
840
GTTTTTGGAAATTTGAGAATGATCTACGCTATGCTAGGTATCGGATTTTTAGGATTTATT
V F G N L S M I Y A M L G I G F L G F I
850
860
870
880
890
900
GTATGAGCTCATCACATATTTACTGTAGGACTCGATATTGATACACGAGCATATTTTAAT
V W A H H M F T V G L D I D T R A Y F N
910
CTTTCTAG
L S
Keterangan :
[1] : nomor nukleotida
[2]: sekuen nukleotida T. laeviceps
[3] : deduksi asam amino dengan singkatan
satu huruf
Gambar 6 Sekuen gen COI T. laeviceps dan deduksi asam amino.
9
Tabel 3 Homologi tertinggi gen COI T. fuscobalteata dan T. laeviceps dengan
database nukleotida pada Genbank menggunakan BLAST-N
(www.ncbi. nlm.nih.gov/blastn)
Gen COI Trigona
T. fuscobalteata
T. laeviceps
Tetragonisca angustula
Melipona bicolor COI
Spesies
MP100 COI gene
gene
No. Akses
EU163097.1
AF370439
Famili
Apidae
Apidae
Sub Famili
Apinae
Apinae
Kesamaan (identity) (%)
83
82
e-value
2e-165
0.0
Query cover
95
95
Homologi tertinggi gen COI Trigona berdasarkan program BLAST-P
menunjukkan adanya kesamaan dengan data asam amino spesies lainnya yakni
sebesar 91% dengan M. melanoventer gen COI (AGO14935.1) dengan nilai
query cover sebesar 100%. Perolehan nilai e-value yang berbeda pada kedua
spesies yaitu T. laeviceps sebesar 2e-111 dan T. fuscobalteata sebesar 3e-111 tidak
memberikan hasil yang berbeda secara signifikan (Tabel 4). Berdasarkan hasil
BLAST-P menunjukkan bahwa sekuen asam amino dugaan (putative) T.
laeviceps dan T. fuscobalteata adalah tepat berdasarkan nilai persentase
homologi yang besar, nilai e-value yang kecil, dan persentase query cover yang
mendekati 100%.
Karakter
Tabel 4 Homologi tertinggi asam amino protein COI T. fuscobalteata dan T.
laeviceps dengan database asam amino pada Genbank menggunakan
BLAST-P (www.ncbi. nlm.nih.gov/blastp)
Karakter
Spesies
No. Akses
Famili
Sub Famili
Kesamaan (identity) (%)
e-value
Query Cover
Gen COI Trigona
T. fuscobalteata
T. laeviceps
Melipona
Melipona melanoventer
melanoventer COI
COI gene
gene
AGO14935.1
AGO14935.1
Apidae
Apidae
Apinae
Apinae
91
91
-111
3e
2e-111
100
100
Analisis Homologi Asam Amino COI Trigona
Penyejajaran sekuen asam amino dugaan gen COI Trigona dilakukan
antara ingroup Trigona (T. fuscobalteata, T. laeviceps, T. chanchamayoensis)
dan outgroup M. bicolor. Sekuen asam amino dugaan gen COI Trigona
dilakukan pensejajaran untuk mengetahui adanya kesamaan maupun perbedaan
sekuen asam amino antara ingroup dan outgroup. Panjang sekuen asam amino
dugaan gen COI adalah 180 pb dengan conserve sites sebanyak 161 pb dan situs
10
variabel sebanyak 19 pb (singelton sites 4 pb dan parsimoni informative sites 15
pb) (Gambar 7).
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
TGHAFLMIFF
..........
.S........
.S.....L..
MVMPFMIGGF
..........
..........
.....L....
GNFLIPLMLG
..........
..........
..Y.V.....
SPDMAFPRMN
..........
..........
..........
[
[
[
[
40]
40]
40]
40]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
NISFWLLPPA
.........S
.........S
.........S
LMLLLFSNFI
.L.......F
.F...L..LF
.....L..MF
FPSSGTGWTV
..........
..........
..N.......
YPPLSSYLYH
..........
..........
.....L....
[
[
[
[
80]
80]
80]
80]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
PSPSVDFTIF
..........
S.........
S.........
SIHMTGISSI
..........
..........
..........
LGSLNFIVTI
..........
..........
..........
FMMKNFSLNY
.....I..D.
..........
..........
[120]
[120]
[120]
[120]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
DQIGLFSWSI
.R.S......
...N......
...N......
SVTVILLIIS
........L.
.I......L.
.I......L.
LPVLAGAITM
..........
..........
..........
LLFDRNFNTS
..........
..........
..........
[160]
[160]
[160]
[160]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
FFDPMGGGDP
..........
..........
..........
ILYQHLFWFF
..........
..........
..........
[180]
[180]
[180]
[180]
Keterangan :
Simbol (.) : kesamaan sekuen asam amino dalam kolom yang sama.
Nomor Aksesi Genbank T. chanchamayoensis dan M. bicolor sesuai dengan Tabel 2.
Gambar 7 Penyejajaran asam amino putative gen COI tiga spesies Trigona dan
M. bicolor.
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni
Analisis jarak genetik dilakukan sebagai input awal untuk mengetahui
pengelompokan kekerabatan terdekat berdasarkan asam amino dugaan gen COI.
Hasil analisis dengan metode NJ diperoleh jarak genetik tertinggi sebesar 0.023
(Tabel 5) antara M. bicolor dengan T. laeviceps dengan T. fuscobalteata,
sedangkan jarak genetik terendah yaitu 0.016 antara T. laeviceps dengan T.
fuscobalteata dan M. bicolor dengan T. chancamayoensis. Semakin tinggi nilai
jarak genetik maka kekerabatan antar keduanya semakin jauh, begitu juga
sebaliknya. Hal ini menunjukkan bahwa antara T. laeviceps dengan T.
fuscobalteata memiliki kekerabatan yang paling dekat.
Konstruksi filogeni dilakukan antara T. fuscobalteata, T. laeviceps dan T.
chanchamayoensis dengan M. bicolor digunakan sebagai outgroup berdasarkan
metode Maximum Parsimony (MP) dan Neighbour Joining (NJ) dengan model
subtitusi Jones-Taylor-Thornton (JTT). Penggunaan outgroup dilakukan untuk
mengetahui spesies ingroup yang paling primitif. Panjang cabang pada pohon
filogeni dengan metode NJ merefleksikan jarak genetik antar sekuen. Berbeda
dengan metode MP, panjang cabang mengindikasikan posisi sekuen yang
memiliki kemiripan. Hasil konstruksi filogeni dengan metode NJ menunjukkan
terdapat dua kelompok utama (Gambar 8). Kelompok pertama dengan nilai ialah
ingroup Trigona, yaitu T. fuscobalteata dan T. laeviceps dengan nilai bootstrap
11
sebesar 98%. Kelompok berikutnya yaitu T. chanchamayoensis mengelompok
dengan outgroup M. bicolor. Konstruksi filogeni dengan MP dilakukan untuk
mengetahui prediksi posisi sekuen yang memiliki kemiripan. Berdasarkan
metode MP, konstruksi filogeni menunjukkan adanya kelompok ingroup
Trigona yang mengelompok pada satu kelompok utama (Gambar 9); T.
fuscobalteata dan T. laeviceps memiliki kekerabatan yang lebih dekat
dibandingkan dengan T. chanchamayoensis. Hasil dari kedua konstruksi filogeni
menunjukkan adanya kesamaan, yakni bahwa T. laeviceps memiliki kekerabatan
yang dekat dengan T. fuscobalteata dibandingkan dengan T. chanchamayoensis.
Tabel 5 Jarak genetik asam amino gen COI tiga spesies Trigona hasil penelitian
ini dengan outgroup Melipona
T. laeviceps
T. fuscobalteata
T. chanchamayoensis
M.bicolor
[1]
[2]
[3]
0.016
0.019
0.023
0.018
0.023
0.016
[4]
Keterangan :
[1] T. laeviceps
[3] T. chanchamayoensis
[2] T. fuscobalteata
[4] M. bicolor
Angka dalam kotak menunjukkan nilai terendah (0,000) dan nilai tertinggi (1,000)
T.laeviceps
T.fuscobalteata
98
T.chanchamayoensis
M.bicolor
0.01
0.02
0.03
0.04
Keterangan :
(→ ) : skala jarak genetik.
Angka pada nodus menyatakan nilai hasil bootstrap 1000x
Gambar 8 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Neighbour Joining (NJ) dengan model JonesTaylor-Thornton (JTT).
100
T.laeviceps
T.fuscobalteata
T.chanchamayoensis
M.bicolor
Keterangan :
(→ ) : skala kemiripan sekuen. Arah panah menunjukkan tingkat kemiripan
semakin tinggi
Angka pada nodus menyatakan nilai hasil bootstrap 1000x
Gambar 9 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Maximum Parsimony (MP).
12
SIMPULAN
Hasil sekuen gen COI secara parsial menghasilkan panjang nukleotida T.
fuscobalteata sebesar 724 pb dan T. laeviceps sebesar 908 pb dengan komposisi
AT yang lebih tinggi dibandingkan GC. Analisis bioinformatika dengan
BLAST-N dan BLAST-P pada kedua spesies menunjukkan nilai persentase
homologi yang tinggi, nilai e-value yang kecil, dan persentase query cover
mendekati 100%. Ketiga hal tersebut dapat digunakan sebagai dasar untuk
menyatakan bahwa sekuen tersebut sebagai sekuen yang tepat.
Analisis jarak genetik tertinggi diperoleh antara M. bicolor dengan T.
laeviceps, sedangkan jarak genetik terendah antara T. laeviceps dengan T.
fuscobalteata. Hasil konstruksi filogeni dengan metode MP, konstruksi filogeni
menunjukkan nahwa ketiga spesies Trigona membentuk satu kelompok.
Konstruksi filogeni berdasarkan NJ menunjukkan terdapat dua kelompok yaitu T.
fuscobalteata dan T. laeviceps dengan nilai bootstrap sebesar 98%. Kelompok
berikutnya yaitu T. chanchamayoensis mengelompok dengan outgroup M.
bicolor. Hasil dari kedua konstruksi filogeni menunjukkan adanya kesamaan,
yakni bahwa T. laeviceps memiliki kekerabatan yang dekat dengan T.
fuscobalteata dibandingkan dengan T. chanchamayoensis.
DAFTAR PUSTAKA
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for
silverstaining DNA in large numbers of polyacrilamide gels. Anal Biochem.
385:174-175.
Crozier RH, Crozier YC, Mackinlay AG. 1989. The CO-I and CO-II Region of
Honeybee Mitochondrial DNA: Evidence for Variation in Insect
Mitochondrial Evolutionary Rates. Mol Biol Evol 6:399-411
Dzulfaqor.2011. Cytochrome oxidase subunit I (COI) gene variations in
mitochondrial DNA of Apis koschevnikovi [Skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor
Fatoni A, Artika IM, Hasan AEZ, Kuswandi. 2008. Antibacterial Activity of
Propolis Produced by Trigona spp. Against Campylobacter spp. HAYATI J
Biosci. 15:161-164
Francoso E, Arias MC. 2013. Cytochrome c oxidase I primers for corbiculate
bees: DNA barcode and mini-barcode. Mol Ecol Res. 5: 844-850
Free JB. 1982. Bees and mankind. London (UK): George Allen and Unwind.
Hajibabaei et al. 2006. DNA barcode distinguish species of tropical
Lepidopteran. PNAS. 103: 968-971.
Harahap KK. 2010. Efektivitas polinasi Apis cerana Fabricus dan Trigona
laeviceps Smith (Hymenoptera: Apidae) pada Fragaria x annanassa kultivar
earlibrite [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003a. Biological
identifications through DNA Barcodes. Proc R Soc Lond B. 270 : 313-321.
13
Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR. 2003b. Barcoding animal life:
cythochrome c oxidase subunit 1 divergence among closely related species.
Proc R Soc Lond B. 270 : S96–S99.
Hebert PDN, Gregory TR. 2005. The promise of DNA Barcoding for Taxonomy.
Syst Biol. 54: 852-859.
Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup analysis and
parsimony. Syst Zool 33: 83-103.
McEntyre J, Ostell J. 2002. The NCBI Handbook. National Center for
Biotechnology Information Bethesda (MD): National Center for
Biotechnology Information (US)
Michener CD. 2000. The Bees of The World. Baltimore: The John Hopkins Univ
Pr.
Nugroho C. 2011. Variasi gen cytochrome oxidase subunit I (COI) DNA
mitokondira pada lebah Apis cerana [Skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor
Raffiudin R, Crozier RH. 2007. Phylogentic analysis of honey bee behavioural
evolution. Mol Phy Evol. 43: 543-552.
Sakagami SF, Ohgushi R, Roubik DW. 1990. Natural History of Social Wasps
and Bees in Equatorial Sumatra. Sapporo (JP): Hokkaido Univ. Press.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratorium
Manual Second Edition. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
Silvestre D, Downton M, Arias MC.2008.The mitochondrial genome of the
stingless bee Melipona bicolor (Hymenoptera, Apidae, Meliponini): Sequence,
gene organization and a unique tRNA translocation event conserved across
the tribe Meliponini. Gen Mol Biol 31: 451-460
Simon C, Buckley TR, Frati F, Stewart JB, Beckenbach AT. 2006. Incorporating
molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of
conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA.
Annu Rev Ecol Evol Syst. 37: 545-579.
Soegiarso ATP. 2013. Keanekaragaman ordo Hymenoptera di perkebunan
kelapa sawit, perkebunan karet dan hutan karet di Jambi [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Tanaka H, Roubik DW, Kato M, Liew F, Gunsalam G. 2001. Phylogenetic
position of Apis nuluensis of nothern Borneo and phylogeography of Apis
cerana as inferred from mitochondrial DNA sequences. Insectes Soc. 48: 4451
Wati DL. 2013. Aktivitas Terbang Harian dan Mencari Polen Trigona laeviceps
Smith di Perkebunan Karet (Hevea braziliensis) dan Kelapa Sawit (Elaeis
guineensis) [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14
15
LAMPIRAN
16
16
Lampiran 1 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T. fuscobalteata menggunakan primer forward Trg.COI.
17
Lampiran 2 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T. fuscbalteata menggunakan primer reverse Trg.COI.R
17
18
18
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta tanggal 21 Februari 1993
dari pasangan Bangar Sianipar dan Nanih Suherni. Penulis
merupakan anak pertama dari dua bersudara. Menyelesaikan
pendidikan menengah atas di SMAN 33 Jakarta pada tahun
2009, penulis melanjutkan pendidikan tinggi pada tahun yang
sama di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan IPA
Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI).
Selama perkuliahan, penulis memiliki pengalaman sebagai asisten
praktikum Anatomi dan Morfologi Tumbuhan (2012/2013) dan Biologi Dasar
(2012/2013). Penulis juga telah melakukan penelitian mengenai Keanekaragaman
Tanaman Pekarangan di Desa-desa Sekitar Gunung Walat dalam rangka program
studi lapangan Departemen Biologi tahun 2011. Selain itu penulis juga telah
melakukan praktik lapangan di PT. Alam Desa Tapos Salaca mengenai
Pembesaran Ikan Hias Koi (Cyprinus carpio L.) di PT. Alam Desa Tapos Dalaca
Kecamatan Tenjolaya Kabupaten Bogor.
Trigona DI DESA BATU KUCING DAN DESA BUNGKU, JAMBI
RYZKA ANNISA BAHER
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Variasi Gen
Cytochrome Oxidase I (COI) pada Lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa
Bungku, Jambi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Ryzka Annisa Baher
NIM G34090063
ABSTRAK
RYZKA ANNISA BAHER. Variasi Gen Cytochrome Oxidase I (COI) pada
Lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi. Dibimbing oleh
RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA.
Lebah Trigona merupakan salah satu serangga polinator yang berperan
dalam ekosistem. Pendataan keanekaragaman Trigona secara morfologi telah
dilakukan di Indonesia, namun pendataan secara molekular dengan variasi gen
Cytochrome Oxidase I (COI) belum dilakukan. Penelitian ini bertujuan
menganalisis kekerabatan antar tiga spesies Trigona dan mempelajari variasi gen
Cytochrome Oxidase I (COI) pada lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa
Bungku, Jambi. Jumlah sampel yang dianalisis sebanyak dua individu pada T.
fuscobalteata, T. laeviceps asal Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi.
Primer gen COI di disain berdasarkan Melipona bicolor dari Genbank. Hasil
sekuen gen COI Trigona secara parsial menghasilkan panjang nukleotida T.
fuscobalteata dan T. laeviceps berturut-turut sebesar 724 dan 908 pb dengan
komposisi AT yang tinggi. Alignment sekuen asam amino T. fuscobalteata, T.
laeviceps dan T. chanchamayoensis dengan outgroup Melipona bicolor
menunjukkan daerah yang conserve sebanyak 161 pb dan variasi ditemukan pada
19 pb. Analisis jarak genetik tertinggi diperoleh antara M. bicolor dengan T.
laeviceps sebesar 0.023. Konstruksi filogeni dilakukan menggunakan metode
Maximum Parsimony (MP) dan Neighbour Joining (NJ). Hasil kedua konstruksi
filogeni menunjukkan kesamaan T. laeviceps memiliki kekerabatan yang dekat
dengan T. fuscobalteata dibandingkan T. chanchamayoensis.
Kata kunci: gen COI, DNA mitokondria, Trigona
ABSTRACT
RYZKA ANNISA BAHER. Variation of Cytochrome Oxidase I (COI) Gene of
Trigona Bee from Desa Batu Kucing and Desa Bungku, Jambi. Supervised by
RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA.
Trigona stingless bees are one of many pollinator insects, which have
important role in ecosystem. Morphology of the diversity of Trigona in Indonesia
had been explored, however the molecular data of Trigona based on the variation
of Cytochrome Oxidase I (COI) gene had not been carried out. This research was
aimed to analyze the relationships between species of Trigona and to study the
variation of COI gene of Trigona bees from Desa Batu Kucing and Desa Bungku,
Jambi. Two samples of T. fuscobalteata, T. laeviceps from Batu Kucing Village
and Bungku Village, Jambi were analysed. COI gene primer were designed based
in Melipona bicolor from Genbank. The partial sequence of COI gene are 724 bp
and 725 bp from T. fuscobalteata and T. laeviceps, respectively with AT rich
composition. The alignment of amino acid sequen T. fuscobalteata, T. laeviceps
and T. chanchamayoensi and outgroup of Melipona bicolor show that there are
161 bp of conserve and 19 bp of variation regions. Genetic distance between M.
bicolor with T. fuscobalteata and M. bicolor with T. fuscobalteata.is 0.096.
Phylogeny construction using Neighbour Joining (NJ) methode by using JonesTaylor-Thornton (JTT) model showed that T. fuscobalteata had closer relationship
with that of T. laeviceps compare to T. chanchamayoensis.
Keywords: COI gene, Mitochondrial DNA, Trigona
VARIASI GEN CYTOCHROME OXIDASE I (COI) PADA LEBAH
Trigona DI DESA BATU KUCING DAN DESA BUNGKU, JAMBI
RYZKA ANNISA BAHER
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Variasi Gen Cytochrome Oxidase I (COI) pada Lebah Trigona di
Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi
Nama
: Ryzka Annisa Baher
NIM
: G34090063
Disetujui oleh
Dr Ir Rika Raffiudin, MSi
Pembimbing I
Drs M. Chandra Widjaja, MM
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah dengan judul “Variasi Gen Cytochrome
Oxidase I (COI) pada Lebah Trigona di Desa Batu Kucing dan Desa Bungku,
Jambi” berhasil diselesaikan. Kegiatan penelitian ini dilaksanakan sejak bulan
September 2013 sampai Februari 2014 di di laboratorium bagian Fungsi Hayati
dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Rika Raffiudin, MSi dan
Bapak Drs M. Chandra Widjaja, MM atas bimbingan dan pengarahan yang telah
diberikan, serta Prof Dr Alex Hartana selaku anggota komisi pendidikan. Terima
kasih kepada Bapak, Mama, serta seluruh keluarga atas setiap dukungan terbaik
yang diberikan sejak lahir sampai menyelesaikan studi ini. Ungkapan terima kasih
juga ditujukan kepada Andi Trisnandi, Lilia, Icha, Kak Uce, Kak Gina, Kak Eni,
Bapak Adi, sahabat Wisma Balio Atas (Ulfah, Irna, Kak Ida, Lintang, Fawwarah,
Dina, dan lainnya), dan teman-teman Biologi 46 untuk semangat, bantuan dan
kerja samanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2014
Ryzka Annisa Baher
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Bahan dan Alat
2
Tahapan Analisis DNA
3
Ekstraksi DNA
3
Amplifikasi DNA
3
Visualisasi DNA
4
Sekuen dan Analisis Bioinformatika
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Amplifikasi DNA Gen COI Trigona
6
Sekuen DNA Gen COI Trigona dan Analisis Bioinformatika
6
Analisis Homologi Asam Amino COI Trigona
9
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni
10
SIMPULAN
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
18
DAFTAR TABEL
1. Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Trigona berdasarkan M.
bicolor dan T. laeviceps
2. Data sampel ingroup Trigona dan outgroup Melipona dan
Tetragonisca yang digunakan untuk analisis gen COI
3. Homologi tertinggi gen COI T. fuscobalteata dan T. laeviceps
dengan database nukleotida pada Genbank menggunakan BLAST-N
(www.ncbi. nlm.nih.gov/blastn)
4. Homologi tertinggi asam amino protein COI T. fuscobalteata dan T.
laeviceps dengan database asam amino pada Genbank menggunakan
BLAST-P (www.ncbi. nlm.nih.gov/blastp)
5. Jarak genetik asam amino gen COI tiga spesies Trigona hasil
penelitian ini dengan outgroup Melipona
4
5
9
9
11
DAFTAR GAMBAR
1. Susunan sarang pada koloni T. laeviceps di ruas bambu (Wati 2013)
2. Morfologi Trigona: a. T. fuscobalteata, b. T. laeviceps (Soegiarso
2013)
3. Pita DNA T. laeviceps.
4. Amplikon pita DNA gen COI lebah Trigona
5. Sekuen gen COI T. fuscobalteata dan deduksi asam amino.
6. Sekuen gen COI T. laeviceps dan deduksi asam amino.
7. Penyejajaran asam amino putative gen COI tiga spesies Trigona dan
M. bicolor.
8. Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Neighbour Joining (NJ) dengan model JonesTaylor-Thornton (JTT).
9. Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Maximum Parsimony (MP).
2
2
4
6
7
8
10
11
11
DAFTAR LAMPIRAN
1. Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T.
fuscobalteata menggunakan primer forward Trg.COI.F
2. Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T.
fuscbalteata menggunakan primer reverse Trg.COI.R
16
17
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Lebah Trigona (Hymenoptera: Apidae) merupakan spesies lebah yang
tergolong dalam stingless bee atau lebah tak bersengat. Trigona tergolong dalam
kelompok serangga sosial tingkat tinggi karena terdapat pembagian kasta yang
jelas pada koloni (Michener 2000). Pada setiap koloni Trigona berjumlah 300
sampai 800.000 lebah. Trigona membuat sarang pada tempat berongga seperti
celah-celah dinding, ruas bambu di dalam rumah atau pada rongga pada pohon
yang hidup (Free 1982). Pada tanaman stroberi, penyerbukan oleh lebah Trigona
laeviceps dan Apis cerana dapat meningkatkan pembentukan buah dan
menurunkan persentase buah abnormal (Harahap 2010). Peran Trigona lainnya
yakni pemanfaatan propolis sebagai anti mikrobial telah digunakan secara luas
oleh masyarakat (Fatoni et al. 2008).
Distribusi Trigona tersebar di wilayah dataran rendah tropis dan beberapa
subtropis yaitu sebagian besar Afrika Selatan, Amerika Selatan, dan Asia
Tenggara (Free 1982). Distribusi Trigona yang luas mengindikasikan adanya
keragaman spesies Trigona pada masing-masing wilayah. Beberapa penelitian di
Indonesia menunjukkan adanya keragaman Trigona, yaitu 23 spesies Trigona
ditemukan di Sumatra Barat (Sakagami et al. 1990) dan 10 spesies dari 23
spesies Trigona ditemukan di Jambi di antaranya Trigona fuscobalteata dan
Trigona laeviceps (Gambar 2) (Soegiarso 2013).
Gen Cytochrome Oxydase subunit I (COI) merupakan gen mtDNA yang
telah digunakan secara luas dalam teknik identifikasi molekular dalam Kingdom
Animalia. Genom mtDNA memiliki pewarisan yang bersifat maternal dalam
jumlah kopi salinan yang banyak dan memiliki bagian yang konservatif,
sehingga banyak digunakan dalam analisis variasi genetik (Simon et al. 2006).
Teknik identifikasi molekular menggunakan gen COI sebagai DNA barkode
dengan standar panjang basa nukleotida sebesar 648 pb (Hebert et al. 2003a;
Hebert dan Gregory 2005; Hajibabaei et al. 2006). Bagian yang konservatif pada
gen COI dapat dikenali pada hampir semua filum dari divisi Animalia, sehingga
dapat digunakan sebagai DNA barkode (Hebert et al. 2003a, 2003b).
Trigona merupakan salah satu serangga penting, yakni sebagai polinator
dalam rantai makanan ekosistem dan sebagai bioindikator adanya transformasi
ekosistem. Lebah Trigona merupakan salah satu serangga penyerbuk yang sangat
potensial pada tanaman pertanian dan perkebunan. Trigona pada umumnya
menjadi serangga polinator utama pada bunga yang berukuran kecil (Michener
2000). Usaha konservasi Trigona perlu dilakukan secara berdampingan baik
secara fisik maupun molekuler.
Pendekatan molekuler untuk identifikasi keragaman spesies Trigona
sangat penting dilakukan karena belum banyak data yang tersedia. Pendekatan
molekuler Trigona dapat dilakukan dengan melakukan pendataan terhadap
variasi gen COI. Data molekuler variasi gen COI Trigona dapat digunakan
sebagai data parsial pendukung dalam teknik bioidentifikasi DNA barkode.
Penggunaannya sebagai DNA barkode diharapkan dapat mempermudah proses
identifikasi apabila terjadi keterbatasan berupa perolehan spesimen yang tidak
lengkap atau hanya berupa salah satu organ, misal tungkai dan perolehan
2
spesimen pada fase hidup tertentu, misal telur, larva, pupa, atau imago (Herbert
et al. 2003a). Pendataan terhadap keragaman gen COI Trigona baru dilakukan
pada tiga spesies, diantaranya T. amalthea (No. Akses AF214669.1) (Tanaka et
al. 2001), T. chancamayeonsis (No. Akses KC853315.1) dan T. spinipes (No.
Akses KC853314.1) (Francoso dan Arias 2013).
Gambar 1 Susunan sarang pada koloni T. laeviceps di ruas bambu (Wati 2013)
a
b
Gambar 2 Morfologi Trigona: a. T. fuscobalteata, b. T. laeviceps (Soegiarso
2013)
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis kekerabatan antar spesies Trigona
dan mempelajari variasi gen Cytochrome Oxidase I (COI) pada lebah Trigona di
Desa Batu Kucing dan Desa Bungku, Jambi .
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan meliputi sampel lebah T. fuscobalteata dan T.
laeviceps hasil koleksi Dr Ir Rika Raffiudin, MSi dari pedesaan di sekitar Taman
Nasional Bukit Duabelas, yakni Desa Batu Kucing dengan koordinat lokasi
S02.15084 – E102.80189 dan Hutan Hujan Harapan di Desa Bungku 2 dengan
koordinat lokasi S01.90878–E103.26059. Hasil koleksi Trigona diawetkan
dalam etanol absolut. Jumlah sampel yang dianalisis sebanyak dua individu pada
masing-masing spesies. Identifikasi spesies Trigona dilakukan oleh Soegiarso
(2013) berdasarkan Sakagami et. al (1990).
3
Tahapan Analisis DNA
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode Cetyl Trimethyl
Ammonium Brommida (CTAB) berdasarkan Sambrook et al. (1989) dengan
modifikasi presipitasi etanol berdasarkan Raffiudin dan Crozier (2007). Jumlah
sampel yang diekstraksi ialah 2 individu pada masing-masing spesies Trigona.
Persiapan ekstraksi, sampel dimasukkan ke dalam 400 µl larutan Tris-HCL
EDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; EDTA 0.2 M; air destilata) sebanyak 3 kali
pergantian selama selang waktu 4 jam untuk menghilangkan etanol absolut yang
terdapat dalam jaringan.
Sumber DNA yang diekstraksi berasal dari bagian toraks Trigona. Sampel
dipisahkan menggunakan scalpel steril dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml.
Kemudian sampel direndam dalam nitrogen cair (20 menit) dan digerus sampai
hancur menggunakan penggerus steril. Larutan buffer CTAB 0.2% (b/v) (7.5 ml
1M Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air
hingga 75 ml) sebanyak 500 µl ditambahkan pada tabung untuk mendegradasi
membran sel. Tabung yang berisi sampel ditambahkan 10 µl Proteinase-K
(5mg/ml), kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C (2 jam). Setelah inkubasi,
tabung disentrifugasi pada 12.000 rpm (10 menit). Supernatan dipindahkan ke
tabung baru, lalu ditambahkan 250 µl larutan PCI (Phenol: Chloroform: Isoamyl
alcohol = 25: 24: 1). Tabung digoyang perlahan (1 menit), kemudian
disentrifugasi pada 12 000 rpm (5 menit). Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan
atas yang berisi DNA dan lapisan bawah atau lapisan PCI. Lapisan yang berisi
DNA dipindahkan ke dalam tabung baru, lalu ditambahkan 400 µl larutan CIAA
(Chloroform: Isoamyl alcohol = 24: 1) dan digoyang perlahan (5 menit). Tabung
disentrifugasi pada 12.000 rpm (3 menit). Lapisan bagian atas yang berisi DNA
dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 600 µl larutan isopropanol,
selanjutnya disimpan pada suhu -4 °C selama (kurang lebih) 12 jam.
Presipitasi DNA dilakukan pada suhu 4 °C dan disentrifugasi pada
kecepatan 13.000 rpm (30 menit). Isopropanol yang terdapat dalam tabung
dibuang, kemudian ditambahkan etanol 70%. Sentrifugasi kembali dilakukan
pada kecepatan dan suhu yang sama (10 menit). Selanjutnya, etanol 70% pada
tabung dibuang dan dilakukan pengeringan pelet DNA dengan vakum (30 menit).
Tabung berisi DNA murni ditambahkan 20 µl larutan TE 0.5 mM dan disimpan
pada suhu 4 °C.
Amplifikasi DNA
DNA hasil esktraksi diamplifikasi dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC 1).
Fragmen DNA yang diamplifikasi ialah gen COI pada Trigona. Desain primer
dilakukan oleh peneliti berdasarkan genom lengkap mitokondria Melipona
bicolor (Silvestre et al. 2008) dengan kode akses Genbank AF466146.1.
Pasangan primer hasil desain ialah primer forward F1.Tg_Jmb_COI dan primer
reverse R2.Tg_Jmb_COI (Tabel 1).
Amplifikasi pertama dilakukan pada dua individu T. laeviceps
menggunakan primer forward F1.Tg_Jmb_COI dan reverse R2.Tg_Jmb_COI.
Hasil amplifikasi dikirim ke perusahaan jasa sekuen dan menunjukkan adanya
pita ganda sehingga perlu dilakukan klon (Gambar 3). Proses klon dilakukan
4
pada pita DNA yang berukuran lebih besar (bagian atas). Desain primer
dilakukan untuk kedua kalinya berdasarkan sekuen hasil klon yaitu sekuen T.
laeviceps. Hasil desain primer berupa pasangan primer forward Trg.COI.F dan
primer reverse Trg.COI.R (Tabel 1).
Total pereaksi yang digunakan dalam amplifikasi adalah 20 µl, terdiri atas
6.8 µl akuades steril, 0.8 µl primer forward, 0.8 µl primer reverse, 10 µl Kapa
Taq Ready Mix DNA Polymerase buffer (buffer Mg2+1.5 mM, dNTP 0.4 mM,
Kapa Taq DNA Polymerase 0.05 U/ µl) dengan penambahan 0.6 µl MgCl2 1.5
mM, dan 1 µl DNA hasil ekstraksi. Amplifikasi dilakukan dengan PCR dalam 5
tahapan dengan kondisi; predenaturation pada suhu 95 °C (2 menit),
denaturation DNA pada suhu 95 °C (2 menit), annealing pada suhu 50 °C (30
detik), elongation pada suhu 72 °C (1 menit), dan post-elongation pada suhu
72 °C (2 menit).
Tabel 1 Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Trigona berdasarkan M.
bicolor dan T. laeviceps
No
Urutan basa (5’-3’)
Primer
Posisi primer
pada mtDNA
M. bicolor (No.
Akses
AF466146.1
Primer didesain berdasarkan M. bicolor
F1.Tg_Jmb_COI TGCTTTATGATCAGGAATAATTGG
60-83
R2.Tg_Jmb_COI TAAAATATGCTCGTGTATCAATAT
886-910
Primer didesain berdasarkan T. laeviceps
Trg.COI.F
CTCTCTAGTTACAGGTCATGCA
25-46
Trg.COI.R
CTCGTGTATCAATATCGAGTCC
871-892
A
Keterangan :
A
: single band yang
dilakukan clone
M
: marker
Tl.1.2 : T. laeviceps koloni 1
individu ke 2
Gambar 3 Pita DNA T. laeviceps.
Visualisasi DNA
Amplikon gen COI Trigona dimigrasikan menggunakan Polyacrilamyde
Gel Electrophoresis (PAGE) konsentrasi 6% dengan komposisi berupa; 12 ml
akuades; 4 ml TBE 5x ((Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M); 4 ml
acrylamide 30%; 15 µl Tetramethyl Ethylene Diamine (TEMED); 150 µl
5
Amonium Peroxo Sulfat (APS) 10%. Migrasi dilakukan pada tegangan 200 V
selama 55 menit. DNA divisualisasi dengan metode pewarnaan perak nitrat
(Byun et al. 2009).
Sekuen dan Analisis Bioinformatika
Variasi genetik COI untuk T. fuscobalteata dan T. laeviceps dianalisis
menggunakan metode sekuensing pada perusahaan jasa sekuen. Hasil sekuen
diedit dan dianalisis menggunakan program Bioedit Sequence Alignment dan
Genetyx Win Version 4.0. Sekuen DNA forward dan reverse di-alignment
menggunakan program Clustal X untuk mendapatkan hasil sekuen DNA utuh.
Hasil sekuen dilakukan Basic Local Alignment Search Tool–Nucleotide
(BLAST-N) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) sebagai pembanding antara sekuen
nukleotida hasil penelitian ini dengan nukleotida database Genbank untuk
mengetahui nilai persentase homologi, e-value, dan persentase query cover.
Nilai e-value merupakan parameter yang menggambarkan tingkat harapan secara
eksponensial saat proses pencarian database (McEntyre & Ostell 2002).
Semakin rendah nilainya, maka semakin signifikan dan dapat dipercaya. Nilai
query cover merupakan persentase dari kecocokan yang meliputi sekuen input
dengan sekuen yang terdapat dalam database (McEntyre & Ostell 2002)
Sekuen DNA ditranslasikan menjadi asam amino putative menggunakan
program Genetyx Win Version 4.0. Hasil sekuen asam amino dilakukan atau
Basic
Local
Alignment
Search
Tool
–
Protein,
BLAST-P
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)
Analisis Jarak Genetik dan Filogeni
Hasil sekuen DNA di-alignment dengan program Clustal X2.1 dan MEGA
5 untuk memperoleh variasi asam amino masing-masing spesies dan analisis
pohon filogeni (Tamura et al. 2011). Penentuan jarak genetik dan analisis
filogeni dilakukan berdasarkan hasil penjajaran sekuen asam amino T.
fuscobalteata, T. laeviceps, T. chanchamayoensis sebagai ingroup dengan M.
bicolor sebagai outgroup (Tabel 2) menggunakan model Jones-Taylor-Thornton
(JTT). Penggunaan outgroup dilakukan untuk mengetahui spesies yang paling
primitif. Selanjutnya, konstruksi filogeni gen COI dilakukan dengan metode
Maximum Parsimony (MP) menggunakan tingkat kepercayaan bootstrap 1000x.
Tabel 2 Data sampel ingroup Trigona dan outgroup Melipona dan Tetragonisca
yang digunakan untuk analisis gen COI
No
Sampel
Ingroup
1.
T. fuscobalteata
2.
T. laeviceps
3.
T. chanchamayoensis
Outgroup
4.
M. bicolor
Lokasi/ Asal
No. Akses Genbank
Jambi
Jambi
Brazil
KC853315.1
Brazil
AF466146.1
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA Gen COI Trigona
Hasil amplifikasi gen COI Trigona menunjukkan ukuran pita DNA yang
sama, yakni ± 800 pasang basa (pb) (Gambar 4). Hasil amplikon T. laeviceps
pada sumur 5-8 (Gambar 4) dengan ukuran pita DNA 800 pb sesuai dengan
prediksi gen target COI Trigona sebesar 827 bp dengan primer forward
F1.Tg_Jmb_COI dan reverse R2.Tg_Jmb_COI berdasarkan genom mitokondria
M. bicolor (AF466146.1) (Silvestre et al. 2008). Sama halnya dengan amplikon
pita DNA gen COI T. fuscobalteata pada sumur 1-4 (Gambar 4) sesuai dengan
prediksi gen target COI berdasarkan gen COI T. laeviceps sebesar 846 bp
menggunakan primer forward Trg.COI.F dan reverse Trg.COI.R.
pb M
900
800
700
600
1
2
3
4
5
6
7
8
Keterangan :
1-4 : T. fuscobalteata
5-8 : T. laeviceps
M : marker dengan ladder
100 pb
Gambar 4 Amplikon pita DNA gen COI lebah Trigona
Sekuen DNA Gen COI Trigona dan Analisis Bioinformatika
Hasil sekuen gen COI yang diperoleh berupa kromatogram dengan
panjang basa nukleotida yang beragam yakni T. fuscobalteata sebesar 724 pb
dan T. laeviceps sebesar 908 pb (Gambar 5 dan 6, Lampiran 1 dan 2). Hasil
sekuen menunjukkan komposisi AT yang tinggi pada kedua spesies yakni T.
fuscobalteata sebesar 66.35% dan T. laeviceps sebesar 67.58%. Hal ini
menunjukkan adanya kesesuaian dengan komposisi AT yang tinggi pada DNA
mitokondria lebah (Crozier 1989). Namun, kedua spesies Trigona memiliki
komposisi AT yang lebih rendah dibandingkan dengan Apis, yakni Apis cerana
74.57% dan A. koschevnikovi 75.5 % (Dzulfaqor 2011 dan Nugroho 2011).
Analisis bioinformatika dengan BLAST-N dan BLAST-P dilakukan
sebagai dasar dalam menentukan tingkat ketepatan suatu sekuen. Hasil BLASTN pada T. laeviceps menunjukkan sekuen yang homolog adalah dengan gen COI
M. bicolor dengan nilai kesamaan (identity) sebesar 82%, nilai e-value 0.0 dan
query cover sebesar 95%, sedangkan homologi tertinggi pada T. fuscobalteata
ialah Tetragonisca angustula MP100 gen COI dengan nilai kesamaan 83%, nilai
e-value 2e-165 dan query cover sebesar 95% (Tabel 3).
Nilai e-value BLAST-N pada T. laeviceps dan T. fuscobalteata yang
mendekati nol menandakan ketepatan yang signifikan dan bukan karena
kebetulan. Nilai query cover mendekati 95% pada T. laeviceps dan T.
fuscobalteata menunjukan tingginya presentase kecocokan antara sekuen
tersebut dengan sekuen yang terdapat dalam database. Ketiga hal tersebut dapat
digunakan sebagai dasar untuk menyatakan bahwa sekuen tersebut sebagai
sekuen yang tepat berdasarkan nilai persentase homologi, nilai e-value, dan
persentase query cover (McEntyre & Ostell 2002).
7
[1]
10
20
30
40
50
60
[2] ACAGGTCATGCATTTTTAATAATTTTTTTTATAGTTATACCCTTTATAATTGGGGGATTT
[3] T G H A F L M I F F M V M P F M I G G F
70
80
90
100
110
120
GGGAATTTTCTTATTCCTCTAATGCTAGGTTCTCCTGATATAGCTTTTCCGCGTATAAAT
G N F L I P L M L G S P D M A F P R M N
130
140
150
160
170
180
AATATCAGATTTTGACTCTTGCCTCCCTCTTTATTGCTTCTTCTTTTTAGAAATTTTTTT
N I S F W L L P P S L L L L L F S N F F
190
200
210
220
230
240
TTTCCTAGATCAGGTACTGGTTGAACAGTTTACCCCCCCTTATCTTCATACCTATATCAT
F P S S G T G W T V Y P P L S S Y L Y H
250
260
270
280
290
300
CCTTCTCCTTCTGTAGATTTTACTATCTTTTCAATTCACATAACTGGAATTTCGTCTATT
P S P S V D F T I F S I H M T G I S S I
310
320
330
340
350
360
TTAGGATCTTTAAATTTTATTGTAACTATTTTTATAATAAAAAATATTTCTCTTGACTAT
L G S L N F I V T I F M M K N I S L D Y
370
380
390
400
410
420
GATCGAATTAGGTTATTTTCCTGGTCTATCTCAGTTACTGTAATTTTACTAATTTTGTCC
D R I S L F S W S I S V T V I L L I L S
430
440
450
460
470
480
TTACCTGTATTGGCTGGAGCAATTACAATACTTTTGTTTGATCGAAACTTTAATACATCT
L P V L A G A I T M L L F D R N F N T S
490
500
510
520
530
540
TTTTTTGATCCAATAGGAGGAGGAGATCCAATTCTTTACCAGCATCTTTTCTGATTTTTT
F F D P M G G G D P I L Y Q H L F W F F
550
560
570
580
590
600
GGACATCCGGAAGTTTATATTCTTATTCTTCCCGGGTTTGGACTAATTTCACAAATTATT
G H P E V Y I L I L P G F G L I S Q I I
610
620
630
640
650
660
ATAAACGAGAGTGGAAAGAAAGAGGTGTTTGGAAACTTGAGAATGATCTATGCAATAGTA
M N E S G K K E V F G N L S M I Y A M V
670
680
690
700
710
720
GGTATTGGGTTTCTTGGATTTATTGTTTGAGCTCATCACATATTTACGGTCGGACTCGAT
G I G F L G F I V W A H H M F T V G L D
730
ATTG
I
Keterangan :
[1] : nomor nukleotida
[2]: sekuen nukleotida T. laeviceps
[3] : deduksi asam amino dengan singkatan
satu huruf
Gambar 5 Sekuen gen COI T. fuscobalteata dan deduksi asam amino.
8
[1]
10
20
30
40
50
60
[2]
AGAGCGGCCGCCAGATCTTCCGGATGGCTCGAGTTTTTCAGCAAGATTGCTTTATGATCA
[3] S A A A S S S G W L E F F S K I A L W S
70
80
90
100
110
120
GGAATAATTGGATCCTCTTTTAGAATACTAATTCGTATAGAATTGAATAGACCCGGAATA
G M I G S S F S M L I R M E L N S P G M
130
140
150
160
170
180
TGAATTAGAAATGATCAAATCTACAACTCTCTAGTTACAGGTCATGCATTTCTAATAATC
W I S N D Q I Y N S L V T G H A F L M I
190
200
210
220
230
240
TTTTTCATGGTTATACCTTTTATAATTGGGGGGTTTGGAAACTTCTTAATTCCGTTAATA
F F M V M P F M I G G F G N F L I P L M
250
260
270
280
290
300
CTGGGATCTCCTGATATAGCTTTTCCTCGTATAAACAATATTAGATTTTGGTTACTTCCT
L G S P D M A F P R M N N I S F W L L P
310
320
330
340
350
360
CCAGCATTGATATTACTTCTATTCAGAAACTTTATTTTCCCTAGATCAGGAACTGGATGA
P A L M L L L F S N F I F P S S G T G W
370
380
390
400
410
420
ACTGTATATCCCCCCCTTTCATCTTATCTTTATCATCCTTCTCCTTCTGTAGATTTTACT
T V Y P P L S S Y L Y H P S P S V D F T
430
440
450
460
470
480
ATTTTTTCTATCCACATGACTGGAATTTCATCTATTTTAGGTTCACTAAACTTTATTGTA
I F S I H M T G I S S I L G S L N F I V
490
500
510
520
530
540
ACAATTTTTATAATAAAAAACTTTTCTCTTAATTACGACCAGATTGGGCTCTTTTCTTGA
T I F M M K N F S L N Y D Q I G L F S W
550
560
570
580
590
600
TCAATTTCAGTGACCGTAATTTTGTTAATTATTTCCTTACCTGTATTGGCAGGAGCTATT
S I S V T V I L L I I S L P V L A G A I
610
620
630
640
650
660
ACTATGCTCTTGTTTGATCGAAATTTCAACACATCATTTTTTGACCCAATAGGAGGAGGT
T M L L F D R N F N T S F F D P M G G G
670
680
690
700
710
720
GATCCAATTCTTTACCAGCATCTTTTCTGGTTTTTTGGACATCCAGAAGTCTATATCCTA
D P I L Y Q H L F W F F G H P E V Y I L
730
740
750
760
770
780
GTCCTTCCTGGATTTGGCCTTATCTCGCAAATTATCATAAACGAGAGAGGAAAAAAGGAA
V L P G F G L I S Q I I M N E S G K K E
790
800
810
820
830
840
GTTTTTGGAAATTTGAGAATGATCTACGCTATGCTAGGTATCGGATTTTTAGGATTTATT
V F G N L S M I Y A M L G I G F L G F I
850
860
870
880
890
900
GTATGAGCTCATCACATATTTACTGTAGGACTCGATATTGATACACGAGCATATTTTAAT
V W A H H M F T V G L D I D T R A Y F N
910
CTTTCTAG
L S
Keterangan :
[1] : nomor nukleotida
[2]: sekuen nukleotida T. laeviceps
[3] : deduksi asam amino dengan singkatan
satu huruf
Gambar 6 Sekuen gen COI T. laeviceps dan deduksi asam amino.
9
Tabel 3 Homologi tertinggi gen COI T. fuscobalteata dan T. laeviceps dengan
database nukleotida pada Genbank menggunakan BLAST-N
(www.ncbi. nlm.nih.gov/blastn)
Gen COI Trigona
T. fuscobalteata
T. laeviceps
Tetragonisca angustula
Melipona bicolor COI
Spesies
MP100 COI gene
gene
No. Akses
EU163097.1
AF370439
Famili
Apidae
Apidae
Sub Famili
Apinae
Apinae
Kesamaan (identity) (%)
83
82
e-value
2e-165
0.0
Query cover
95
95
Homologi tertinggi gen COI Trigona berdasarkan program BLAST-P
menunjukkan adanya kesamaan dengan data asam amino spesies lainnya yakni
sebesar 91% dengan M. melanoventer gen COI (AGO14935.1) dengan nilai
query cover sebesar 100%. Perolehan nilai e-value yang berbeda pada kedua
spesies yaitu T. laeviceps sebesar 2e-111 dan T. fuscobalteata sebesar 3e-111 tidak
memberikan hasil yang berbeda secara signifikan (Tabel 4). Berdasarkan hasil
BLAST-P menunjukkan bahwa sekuen asam amino dugaan (putative) T.
laeviceps dan T. fuscobalteata adalah tepat berdasarkan nilai persentase
homologi yang besar, nilai e-value yang kecil, dan persentase query cover yang
mendekati 100%.
Karakter
Tabel 4 Homologi tertinggi asam amino protein COI T. fuscobalteata dan T.
laeviceps dengan database asam amino pada Genbank menggunakan
BLAST-P (www.ncbi. nlm.nih.gov/blastp)
Karakter
Spesies
No. Akses
Famili
Sub Famili
Kesamaan (identity) (%)
e-value
Query Cover
Gen COI Trigona
T. fuscobalteata
T. laeviceps
Melipona
Melipona melanoventer
melanoventer COI
COI gene
gene
AGO14935.1
AGO14935.1
Apidae
Apidae
Apinae
Apinae
91
91
-111
3e
2e-111
100
100
Analisis Homologi Asam Amino COI Trigona
Penyejajaran sekuen asam amino dugaan gen COI Trigona dilakukan
antara ingroup Trigona (T. fuscobalteata, T. laeviceps, T. chanchamayoensis)
dan outgroup M. bicolor. Sekuen asam amino dugaan gen COI Trigona
dilakukan pensejajaran untuk mengetahui adanya kesamaan maupun perbedaan
sekuen asam amino antara ingroup dan outgroup. Panjang sekuen asam amino
dugaan gen COI adalah 180 pb dengan conserve sites sebanyak 161 pb dan situs
10
variabel sebanyak 19 pb (singelton sites 4 pb dan parsimoni informative sites 15
pb) (Gambar 7).
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
TGHAFLMIFF
..........
.S........
.S.....L..
MVMPFMIGGF
..........
..........
.....L....
GNFLIPLMLG
..........
..........
..Y.V.....
SPDMAFPRMN
..........
..........
..........
[
[
[
[
40]
40]
40]
40]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
NISFWLLPPA
.........S
.........S
.........S
LMLLLFSNFI
.L.......F
.F...L..LF
.....L..MF
FPSSGTGWTV
..........
..........
..N.......
YPPLSSYLYH
..........
..........
.....L....
[
[
[
[
80]
80]
80]
80]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
PSPSVDFTIF
..........
S.........
S.........
SIHMTGISSI
..........
..........
..........
LGSLNFIVTI
..........
..........
..........
FMMKNFSLNY
.....I..D.
..........
..........
[120]
[120]
[120]
[120]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
DQIGLFSWSI
.R.S......
...N......
...N......
SVTVILLIIS
........L.
.I......L.
.I......L.
LPVLAGAITM
..........
..........
..........
LLFDRNFNTS
..........
..........
..........
[160]
[160]
[160]
[160]
T.
T.
T.
M.
laeviceps
fuscobalteata
chanchamayoensis
bicolor
FFDPMGGGDP
..........
..........
..........
ILYQHLFWFF
..........
..........
..........
[180]
[180]
[180]
[180]
Keterangan :
Simbol (.) : kesamaan sekuen asam amino dalam kolom yang sama.
Nomor Aksesi Genbank T. chanchamayoensis dan M. bicolor sesuai dengan Tabel 2.
Gambar 7 Penyejajaran asam amino putative gen COI tiga spesies Trigona dan
M. bicolor.
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni
Analisis jarak genetik dilakukan sebagai input awal untuk mengetahui
pengelompokan kekerabatan terdekat berdasarkan asam amino dugaan gen COI.
Hasil analisis dengan metode NJ diperoleh jarak genetik tertinggi sebesar 0.023
(Tabel 5) antara M. bicolor dengan T. laeviceps dengan T. fuscobalteata,
sedangkan jarak genetik terendah yaitu 0.016 antara T. laeviceps dengan T.
fuscobalteata dan M. bicolor dengan T. chancamayoensis. Semakin tinggi nilai
jarak genetik maka kekerabatan antar keduanya semakin jauh, begitu juga
sebaliknya. Hal ini menunjukkan bahwa antara T. laeviceps dengan T.
fuscobalteata memiliki kekerabatan yang paling dekat.
Konstruksi filogeni dilakukan antara T. fuscobalteata, T. laeviceps dan T.
chanchamayoensis dengan M. bicolor digunakan sebagai outgroup berdasarkan
metode Maximum Parsimony (MP) dan Neighbour Joining (NJ) dengan model
subtitusi Jones-Taylor-Thornton (JTT). Penggunaan outgroup dilakukan untuk
mengetahui spesies ingroup yang paling primitif. Panjang cabang pada pohon
filogeni dengan metode NJ merefleksikan jarak genetik antar sekuen. Berbeda
dengan metode MP, panjang cabang mengindikasikan posisi sekuen yang
memiliki kemiripan. Hasil konstruksi filogeni dengan metode NJ menunjukkan
terdapat dua kelompok utama (Gambar 8). Kelompok pertama dengan nilai ialah
ingroup Trigona, yaitu T. fuscobalteata dan T. laeviceps dengan nilai bootstrap
11
sebesar 98%. Kelompok berikutnya yaitu T. chanchamayoensis mengelompok
dengan outgroup M. bicolor. Konstruksi filogeni dengan MP dilakukan untuk
mengetahui prediksi posisi sekuen yang memiliki kemiripan. Berdasarkan
metode MP, konstruksi filogeni menunjukkan adanya kelompok ingroup
Trigona yang mengelompok pada satu kelompok utama (Gambar 9); T.
fuscobalteata dan T. laeviceps memiliki kekerabatan yang lebih dekat
dibandingkan dengan T. chanchamayoensis. Hasil dari kedua konstruksi filogeni
menunjukkan adanya kesamaan, yakni bahwa T. laeviceps memiliki kekerabatan
yang dekat dengan T. fuscobalteata dibandingkan dengan T. chanchamayoensis.
Tabel 5 Jarak genetik asam amino gen COI tiga spesies Trigona hasil penelitian
ini dengan outgroup Melipona
T. laeviceps
T. fuscobalteata
T. chanchamayoensis
M.bicolor
[1]
[2]
[3]
0.016
0.019
0.023
0.018
0.023
0.016
[4]
Keterangan :
[1] T. laeviceps
[3] T. chanchamayoensis
[2] T. fuscobalteata
[4] M. bicolor
Angka dalam kotak menunjukkan nilai terendah (0,000) dan nilai tertinggi (1,000)
T.laeviceps
T.fuscobalteata
98
T.chanchamayoensis
M.bicolor
0.01
0.02
0.03
0.04
Keterangan :
(→ ) : skala jarak genetik.
Angka pada nodus menyatakan nilai hasil bootstrap 1000x
Gambar 8 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Neighbour Joining (NJ) dengan model JonesTaylor-Thornton (JTT).
100
T.laeviceps
T.fuscobalteata
T.chanchamayoensis
M.bicolor
Keterangan :
(→ ) : skala kemiripan sekuen. Arah panah menunjukkan tingkat kemiripan
semakin tinggi
Angka pada nodus menyatakan nilai hasil bootstrap 1000x
Gambar 9 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan sekuen asam amino gen COI
menggunakan metode Maximum Parsimony (MP).
12
SIMPULAN
Hasil sekuen gen COI secara parsial menghasilkan panjang nukleotida T.
fuscobalteata sebesar 724 pb dan T. laeviceps sebesar 908 pb dengan komposisi
AT yang lebih tinggi dibandingkan GC. Analisis bioinformatika dengan
BLAST-N dan BLAST-P pada kedua spesies menunjukkan nilai persentase
homologi yang tinggi, nilai e-value yang kecil, dan persentase query cover
mendekati 100%. Ketiga hal tersebut dapat digunakan sebagai dasar untuk
menyatakan bahwa sekuen tersebut sebagai sekuen yang tepat.
Analisis jarak genetik tertinggi diperoleh antara M. bicolor dengan T.
laeviceps, sedangkan jarak genetik terendah antara T. laeviceps dengan T.
fuscobalteata. Hasil konstruksi filogeni dengan metode MP, konstruksi filogeni
menunjukkan nahwa ketiga spesies Trigona membentuk satu kelompok.
Konstruksi filogeni berdasarkan NJ menunjukkan terdapat dua kelompok yaitu T.
fuscobalteata dan T. laeviceps dengan nilai bootstrap sebesar 98%. Kelompok
berikutnya yaitu T. chanchamayoensis mengelompok dengan outgroup M.
bicolor. Hasil dari kedua konstruksi filogeni menunjukkan adanya kesamaan,
yakni bahwa T. laeviceps memiliki kekerabatan yang dekat dengan T.
fuscobalteata dibandingkan dengan T. chanchamayoensis.
DAFTAR PUSTAKA
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for
silverstaining DNA in large numbers of polyacrilamide gels. Anal Biochem.
385:174-175.
Crozier RH, Crozier YC, Mackinlay AG. 1989. The CO-I and CO-II Region of
Honeybee Mitochondrial DNA: Evidence for Variation in Insect
Mitochondrial Evolutionary Rates. Mol Biol Evol 6:399-411
Dzulfaqor.2011. Cytochrome oxidase subunit I (COI) gene variations in
mitochondrial DNA of Apis koschevnikovi [Skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor
Fatoni A, Artika IM, Hasan AEZ, Kuswandi. 2008. Antibacterial Activity of
Propolis Produced by Trigona spp. Against Campylobacter spp. HAYATI J
Biosci. 15:161-164
Francoso E, Arias MC. 2013. Cytochrome c oxidase I primers for corbiculate
bees: DNA barcode and mini-barcode. Mol Ecol Res. 5: 844-850
Free JB. 1982. Bees and mankind. London (UK): George Allen and Unwind.
Hajibabaei et al. 2006. DNA barcode distinguish species of tropical
Lepidopteran. PNAS. 103: 968-971.
Harahap KK. 2010. Efektivitas polinasi Apis cerana Fabricus dan Trigona
laeviceps Smith (Hymenoptera: Apidae) pada Fragaria x annanassa kultivar
earlibrite [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003a. Biological
identifications through DNA Barcodes. Proc R Soc Lond B. 270 : 313-321.
13
Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR. 2003b. Barcoding animal life:
cythochrome c oxidase subunit 1 divergence among closely related species.
Proc R Soc Lond B. 270 : S96–S99.
Hebert PDN, Gregory TR. 2005. The promise of DNA Barcoding for Taxonomy.
Syst Biol. 54: 852-859.
Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup analysis and
parsimony. Syst Zool 33: 83-103.
McEntyre J, Ostell J. 2002. The NCBI Handbook. National Center for
Biotechnology Information Bethesda (MD): National Center for
Biotechnology Information (US)
Michener CD. 2000. The Bees of The World. Baltimore: The John Hopkins Univ
Pr.
Nugroho C. 2011. Variasi gen cytochrome oxidase subunit I (COI) DNA
mitokondira pada lebah Apis cerana [Skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor
Raffiudin R, Crozier RH. 2007. Phylogentic analysis of honey bee behavioural
evolution. Mol Phy Evol. 43: 543-552.
Sakagami SF, Ohgushi R, Roubik DW. 1990. Natural History of Social Wasps
and Bees in Equatorial Sumatra. Sapporo (JP): Hokkaido Univ. Press.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratorium
Manual Second Edition. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
Silvestre D, Downton M, Arias MC.2008.The mitochondrial genome of the
stingless bee Melipona bicolor (Hymenoptera, Apidae, Meliponini): Sequence,
gene organization and a unique tRNA translocation event conserved across
the tribe Meliponini. Gen Mol Biol 31: 451-460
Simon C, Buckley TR, Frati F, Stewart JB, Beckenbach AT. 2006. Incorporating
molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of
conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA.
Annu Rev Ecol Evol Syst. 37: 545-579.
Soegiarso ATP. 2013. Keanekaragaman ordo Hymenoptera di perkebunan
kelapa sawit, perkebunan karet dan hutan karet di Jambi [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Tanaka H, Roubik DW, Kato M, Liew F, Gunsalam G. 2001. Phylogenetic
position of Apis nuluensis of nothern Borneo and phylogeography of Apis
cerana as inferred from mitochondrial DNA sequences. Insectes Soc. 48: 4451
Wati DL. 2013. Aktivitas Terbang Harian dan Mencari Polen Trigona laeviceps
Smith di Perkebunan Karet (Hevea braziliensis) dan Kelapa Sawit (Elaeis
guineensis) [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14
15
LAMPIRAN
16
16
Lampiran 1 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T. fuscobalteata menggunakan primer forward Trg.COI.
17
Lampiran 2 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria lebah T. fuscbalteata menggunakan primer reverse Trg.COI.R
17
18
18
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta tanggal 21 Februari 1993
dari pasangan Bangar Sianipar dan Nanih Suherni. Penulis
merupakan anak pertama dari dua bersudara. Menyelesaikan
pendidikan menengah atas di SMAN 33 Jakarta pada tahun
2009, penulis melanjutkan pendidikan tinggi pada tahun yang
sama di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan IPA
Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI).
Selama perkuliahan, penulis memiliki pengalaman sebagai asisten
praktikum Anatomi dan Morfologi Tumbuhan (2012/2013) dan Biologi Dasar
(2012/2013). Penulis juga telah melakukan penelitian mengenai Keanekaragaman
Tanaman Pekarangan di Desa-desa Sekitar Gunung Walat dalam rangka program
studi lapangan Departemen Biologi tahun 2011. Selain itu penulis juga telah
melakukan praktik lapangan di PT. Alam Desa Tapos Salaca mengenai
Pembesaran Ikan Hias Koi (Cyprinus carpio L.) di PT. Alam Desa Tapos Dalaca
Kecamatan Tenjolaya Kabupaten Bogor.