BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini bersifat eksperimental yaitu dilakukan pengujian efek antidiabetes ekstrak yang diperoleh dari n-heksan, etil asetat, dan etanol kelopak
bunga rosela Hibiscus sabdariffa L. terhadap mencit yang diinduksi streptozotocin STZ. Pada penelitian ini terdapat dua variabel yaitu ekstrak yang
diperoleh dari n-heksan, etil asetat, etanol kelopak bunga rosela Hibiscus sabdariffa L., glibenklamid sebagai variabel bebas dan kadar glukosa darah
mencit mgdl sebagai variabel terikat. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan meliputi pengambilan dan pengolahan sampel, penapisan fitokimia pemeriksaan
alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, dan tanin, pembuatan ekstrak, preparasi hewan percobaan, dan pengujian efek antidiabetes. Penelitian ini dilakukan di
Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi USU dan Akademi Farmasi Yayasan T.P. Arjuna, Laguboti, Sumatera Utara.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, alat pemanas air, aluminium foil, blender, glukometer dan glukotest
strip Accu chek, kertas saring, mortir dan stamfer, neraca hewan, neraca kasar, neraca listrik, oral sonde, Syringe Terumo.
3.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah kelopak bunga rosela Hibiscus sabdariffa L., streptozotocin Merck Sdn Bhd. Semua bahan kimia yang
digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisa yaitu CMC
Universitas Sumatera Utara
Carboxy Metil Cellulose, etanol 96, n-heksan, etil asetat, Na sitrat, asam asetat, amoniak, HCl, pereaksi Dragendorf, pereaksi Mayer, H
2
SO
4
, FeCl
3
3.3 Hewan Percobaan
, serbuk Mg, kloroform, pereaksi Liebermen-Bouchardat, asetat anhidrida,
glibenklamid Indofarma, larutan NaCl 0,9.
Penelitian ini menggunakan hewan uji mencit jantan strain BALBC berumur 3-4 bulan dengan bobot antara 25-35 gram. Sebelum dilakukan
percobaan mencit terlebih dahulu dipelihara selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan dengan lingkungannya.
3.4 Pengumpulan dan Pembuatan Simplisia 3.4.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan dalam
penelitian ini adalah kelopak bunga rosela Hibiscus sabdariffa L. yang masih segar berwarna merah dan cukup tua yang diperoleh dari Pasar I Kampung
Tapanuli, Kecamatan Percut Sei Tuan, Kabupaten Deli Serdang.
3.4.2 Pembuatan simplisia
Sampel kelopak bunga rosela yang masih segar dikumpulkan, dibersihkan disortasi basah, dicuci dengan air sampai bersih, kemudian ditiriskan lalu
disebarkan, setelah itu dikeluarkan bijinya, lalu kelopak ditimbang sebagai berat basah. Kemudian kelopak dikeringkan dengan cara dikering-anginkan sampai
kelopak kering dan rapuh, berat kelopak yang kering ditimbang. Kemudian disimpan di tempat yang terlindung dari sinar matahari.
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Pembuatan Ekstrak Pembuatan ekstrak kelopak bunga rosela Hibiscus sabdariffa L.
dilakukan secara perkolasi bertingkat. Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 1 kg serbuk simplisia dibasahi dengan n-heksan dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian
dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari n-heksan sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut
tabung perkolator ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan
perkolat diatur 1 mlmenit, perkolat ditampung. Perkolasi dihentikan sampai tetesan ekstrak jernih tidak berwarna, dan diambil setetes ekstrak dikeringkan
maka tidak akan meninggalkan noda, kemudian dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Ampas dikeringkan lalu diekstraksi dengan menggunakan pelarut
berturut-turut etil asetat dan etanol dengan prosedur yang sama dengan di atas Ditjen POM, 1986.
3.5 Penapisan Fitokimia Masing-masing Ekstrak 3.5.1 Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 1 gram ekstrak n-heksan ditambahkan 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan
disaring. Filtrat dipakai untuk uji alkaloid sebagai berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah 2 tetes larutan pereaksi Meyer akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
Universitas Sumatera Utara
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Alkaloid positif jika terdapat endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga
percobaan diatas Ditjen POM, 1995. Dilakukan percobaan yang sama terhadap ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
3.5.2 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g ekstrak n-heksan dilarutkan dalam 10 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966. Dilakukan percobaan yang sama terhadap ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
3.5.3 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak n-heksan dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10
detik, jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995. Dilakukan percobaan yang sama terhadap ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
3.5.4 Pemeriksaan steroidtriterpenoida
Sebanyak 1 gram ekstrak n-heksan dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya
ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi
Universitas Sumatera Utara
Liebermann-Bouchardat. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda, atau ungu menunjukkan
adanya triterpenoida Harborne, 1987. Dilakukan percobaan yang sama terhadap ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
3.5.5 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 gram ekstrak n-heksan disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Ditjen POM,
1995. Dilakukan percobaan yang sama terhadap ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
3.5.6 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 gram ekstrak n-heksan disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam,
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat
disari denga 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur
tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam
tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Mollish. Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml
asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu
Universitas Sumatera Utara
pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida Ditjen POM, 1995. Dilakukan percobaan yang sama terhadap ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
3.6 Pembuatan Bahan Uji 3.6.1 Pembuatan suspensi CMC 0,5
Sebanyak 500 mg CMC, ditaburkan dalam cawan porselen yang berisi 10 ml air suling panas. Didiamkan selama 30 menit hingga diperoleh massa yang
transparan. Setelah itu digerus sambil diencerkan dengan sedikit air suling. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer yang telah dikalibrasi 100 ml.
Volumenya dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.6.2 Pembuatan suspensi ekstrak
Masing-masing ekstrak yang diperoleh dari n-heksan, etil asetat dan etanol, dibuat dengan cara menimbang 600 mg ekstrak kelopak bunga rosela
Hibiscus sabdariffa L., digerus di dalam lumpang, ditambahkan suspensi CMC sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, lalu dimasukkan dalam labu
tentukur 10 ml dan dicukupkan volumenya sampai garis tanda. Suspensi ekstrak tersebut dibuat sebagai larutan induk, yang kemudian diencerkan untuk
mendapatkan konsentrasi suspensi ekstrak yang berbeda-beda. Suspensi ekstrak untuk uji diberikan dengan volume yang sama.
Volume cairan yang dapat diberikan peroral pada mencit adalah 1 dari bobot mencit. Takaran konversi dosis dari manusia ke mencit adalah 0,0026.
Dosis kelopak bunga rosela yang digunakan adalah dosis yang biasa dipakai masyarakat, yaitu 3-4 kuntum bunga rosela ± 10 gram. Maka dosis untuk
mencit: Korelasi dosis mencit x dosis rosela untuk manusia = 0,0026 x 10 gram
Universitas Sumatera Utara
Pada penelitian ini dosis ekstrak yang diberikan pada mencit-mencit diabetes dibuat dalam tiga kelompok uji yaitu:
Kelompok uji I: Dosis rendahdosis 1 = 200 mgkg BB Kelompok uji II: Dosis sedangdosis 2 = 400 mgkg BB
Kelompok Uji III: Dosis tinggidosis 3 = 600 mgkg BB
3.6.3 Pembuatan suspensi glibenklamid
Ditimbang glibenklamid sebanyak 0,65 mg, digerus di dalam lumpang, ditambahkan suspensi CMC sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen,
lalu dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan hingga mencapai
batas tanda.
Dosis terapi glibenklamid pada manusia adalah 5 mg. Takaran konversi dosis dari manusia ke mencit, yaitu: 0,0026 x 5 mg = 0,013 mg = 100020 x 0,013
= 0,65 mgkg BB
3.6.4 Pembuatan larutan streptozotocin STZ dalam larutan NaCl 0,9
Sebanyak 55 mg streptozotocin STZ dimasukkan ke dalam labu tentukur
10 ml kemudian dicukupkan dengan larutan NaCl 0,9.
Streptozotocin adalah senyawa yang dihasilkan dari Streptomyces acromogenes yang merupakan suatu senyawa nitroso urea analog glukosa.
Streptozotocin mudah larut dalam air, sedikit larut dalam alkohol dan keton. Dalam penelitian digunakan sebagai penginduksi diabetes pada hewan coba. Obat
ini mempunyai spesifitas yang tinggi terhadap sel β. penyuntikan secara intraperitoneal dosis 40-60 mgkg BB, dosis tunggal akan menyebabkan
hiperglikemia setelah 2-4 hari Abeeleh, et al., 2009.
Universitas Sumatera Utara
3.7 Penggunaan Glukometer 3.7.1 Prosedur penggunaan
Alat yang digunakan untuk mengukur KGD adalah Glukometer Accu Chek. Hasil pengukuran secara otomatis akan terbaca ketika strip dimasukkan dan
akan mati ketika strip dicabut. Dengan menyentuhkan setetes darah ke strip melalui aksi kapiler. Ketika wadah terisi penuh oleh darah, alat akan mengukur
kadar glukosa darah.
3.7.2 Prinsip pengukuran
Konsentrasi glukosa dalam sampel uji diukur dengan metode amperometrik: glukosa dioksidasi pada daerah reaktif pada strip uji oleh
dehidrogenasi glukosa dioksidoreduktase glukosa, selama hal tersebut terjadi heksasianoferat III direduksi menjadi heksasianoferat II. Heksasianoferat II
yang dihasilkan kemudian direoksidasi oleh salah satu elektroda-elektroda yang mengandung palladium. Arus elektron yang sebanding dengan konsentrasi
glukosa pada sampel, yang kemudian diukur oleh pengukur ACCU-CHEK. Prinsip pengukuran ini diilustrasikan pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1.
Prinsip pengukuran glukosa darah dengan alat Accu Chek Glukosa
Glukonolakton Glukosa Dehidrogenasi
PQQ PQQH
2
FerosianidaII FerosianidaIII Arus
Elektroda Palladium e
-
Universitas Sumatera Utara
3.8 Pengujian Kadar Glukosa Darah Mencit 3.8.1 Pengujian kadar glukosa normal mencit
Sebelum diberikan perlakuan, kadar glukosa darah mencit diukur terlebih dahulu, yaitu mencit dipuasakan selama 18 jam. Kemudian berat badan ditimbang
dan diukur kadar glukosa darah KGD puasa dengan cara mengambil darah melalui vena bagian ekor yang dilukai menggunakan alat suntik. Darah yang
keluar disentuhkan pada Glukostrip yang terpasang pada Glukotest. Alat akan langsung bekerja secara otomatis, angka yang tampil pada layar alat dicatat
sebagai kadar glukosa darah mgdl.
3.8.2. Penentuan kadar glukosa darah KGD
Sebelum percobaan dilakukan, mencit dipuasakan tidak makan tetapi tetap minum selama 18 jam, lalu ditimbang berat badan mencit masing-masing
dan diberi tanda pada ekor. Kemudian masing-masing mencit diukur kadar glukosa darah puasa. Ekor mencit dibersihkan dengan alkohol, lalu diambil
darahnya melalui pembuluh darah vena dibagian ekor yang ditusuk dengan jarum suntik. Darah yang keluar disentuhkan pada glukotest strip yang telah terpasang
pada alat glukometer Accu Chek dan dibiarkan alat mengukur kadar glukosa darah secara otomatis. Angka yang tampil pada layar alat dicatat sebagai kadar glukosa
darah mgdl.
3.8.3 Uji toleransi glukosa oral
Pada metode toleransi glukosa oral ini, 48 ekor mencit diaklimatisasi terlebih dahulu sebelum dilakukan eksperimental. Kemudian dibagi menjadi 8
kelompok dan dipuasakan selama 18 jam air minum tetap diberikan. Kelompok 1 diberikan CMC 0,5 sebagai kontrol negatif, kelompok 2 diberikan
Universitas Sumatera Utara
glibenklamid 0,65 mgkg BB sebagai kontrol positif, kelompok 3,4,5 diberikan larutan ekstrak etanol masing-masing 200 mgkg BB, 400 mgkg BB, 600 mgkg
BB dan kelompok 6,7,8 diberikan ekstrak etil asetat masing-masing 200 mgkg BB, 400 mgkg BB, dan 600 mgkg BB. Satu jam setelah perlakuan diberikan
larutan glukosa dosis 500 g10 ml sebanyak 0,2 ml kepada masing-masing kelompok. Satu jam setelah pemberian sediaan jam ke-0 segera dilakukan
pengambilan darah mencit melalui vena ekor, dan pengambilan darah diulangi setiap pada menit ke-30, 60, 90, dan 120. Darah yang diambil diukur dengan
menggunakan glukometer Accu Chek.
3.8.4 Penginduksian diabetes
Mencit yang akan diinduksi diabetes dipuasakan selama 18 jam air minum tetap diberikan, diinjeksi dengan larutan streptozotocin secara
intraperitoneal dengan dosis 55 mgkg BB. Pada hari ke-3 ditentukan kadar glukosa darah mencit, dianggap diabetes jika kadar glukosa darahnya 200 mgdl.
3.8.5 UJi aktivitas ekstrak
Uji antidiabetes dilakukan terhadap masing-masing ekstrak yaitu ekstrak n-heksan, etil asetat, dan etanol yang dibuat dengan 3 dosis yaitu 200 mg, 400 mg
dan 600 mg ekstrak, masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor mencit, yaitu: Kelompok 1: kelompok kontrol, mencit yang telah diabetes diberikan suspensi
CMC 0,5. Kelompok 2: kelompok kontrol positif, mencit yang telah diabetes diberikan
pembanding glibenklamid 0,65 mgkg BB. Kelompok 3: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak n-heksan
kelopak bunga rosela dosis 200 mgkg BB.
Universitas Sumatera Utara
Kelompok 4: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak n-heksan kelopak bunga rosela dosis 400 mgkg BB.
Kelompok 5: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak n-heksan kelopak bunga rosela dosis 600 mgkg BB.
Kelompok 6: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak etil asetat kelopak bunga rosela dosis 200 mgkg BB.
Kelompok 7: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak etil asetat kelopak bunga rosela dosis 400 mgkg BB.
Kelompok 8: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak etil asetat kelopak bunga rosela dosis 600 mgkg BB.
Kelompok 9: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak etanol kelopak bunga rosela dosis 200 mgkg BB.
Kelompok 10: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak etanol kelopak bunga rosela dosis 400 mgkg BB.
Kelompok 11: kelompok mencit yang telah diabetes diberikan ekstrak etanol kelopak bunga rosela dosis 600 mgkg BB.
Pemberian perlakuan dimulai setelah hewan uji positif diabetes, yang dilakukan setiap hari di mana setiap selang tujuh hari diadakan pengukuran kadar glukosa
darah. Pengujian dihentikan sampai salah satu kelompok pengujian memiliki kadar glukosa darah normal.
3.9 Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis menggunakan analisis variansi ANAVA pada tingkat kepercayaan 95. Analisis statistik ini menggunakan program SPSS
Statiscal Product and Service Solution versi 16.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Ekstraksi
Ekstraksi kelopak bunga rosela dilakukan secara perkolasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan etanol, dengan maksud agar
kandungan kimia yang terdapat dalam kelopak bunga rosela dapat dipisahkan berdasarkan kelarutannya dengan sempurna dalam cairan penyari. Hasil dari 1000
g serbuk simplisia diperoleh total ekstrak 74,2 g 7,42 di mana ekstrak n- heksan yang diperoleh sebanyak 28,4 g, ekstrak berwarna hijau pekat; ekstrak etil
asetat 12,6 g, ekstrak berwarna hijau; dan ekstrak etanol 33,2 g, ekstrak berwarna merah kehitaman.
4.2 Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak N-heksan, Ekstrak Etil Asetat dan Ekstrak Etanol Kelopak Bunga Rosela
Kandungan kimia dari kelopak bunga rosela dipisahkan berdasarkan kelarutannya dengan menggunakan teknik perkolasi bertingkat. Tahap ekstraksi
dimulai dengan menggunakan pelarut non polar yaitu n-heksan kemudian dilanjutkan dengan menggunakan pelarut semi polar yaitu etil asetat, terakhir
dengan menggunakan pelarut polar yaitu etanol. Tabel 4.1 menunjukkan kandungan kimia yang terdapat pada masing-masing ekstrak kelopak bunga
rosela.
Universitas Sumatera Utara
Kategori