3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Uji klarifikasi kitinolitik isolat A7 secara semikuantitatif
Bakteri kitinolitik isolat A7 diinokulasikan pada media agar kitin. Kemudian diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk diamati dengan cara ditetesi dengan larutan iodine. Indeks aktivitas enzim merupakan rasio
diameter zona bening yang terbentuk dengan diameter koloni.
3.4.2 Degradasi tepung cangkang udang oleh bakteri kitinolitik isolat A7 a. Pembuatan Tepung Cangkang Udang
Cangkang udang dicuci dengan air sampai bersih kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 60
o
C sampai beratnya konstan. Setelah kering, cangkang udang dihaluskan sampai menjadi serbuk menggunakan blender. Serbuk
tersebut merupakan tepung cangkang udang yang digunakan sebagai media produksi N-asetilglukosamin.
b. Inokulum Bakteri Kitinolitik b.1 Pola Pertumbuhan Bakteri Kitinolitik
Isolat bakteri A7 diinokulasikan pada 50 ml LB dan diinkubasi pada suhu 30
o
C diatas shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam. Pengukuran pertumbuhan dilakukan setiap selang waktu 4 jam selama 24 jam. Pengukuran
pertumbuhan diawali dengan seri pengenceran kultur sampai dengan 10
-8
menggunakan garam fisiologis steril NaCl 0,85. Sebanyak 5 µl kultur dari masing-masing pengenceran diinokulasikan secara drop plate pada media NA dan
diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni dihitung sebagai jumlah selml yang ditentukan berdasarkan rumus sebagai berikut:
b.2 Pembuataan Inokulum
Inokulum yang digunakan adalah inokulum yang berada pada fase eksponensial. Sebanyak 1 ose isolat A7 diinokulasikan ke dalam media LB kemudian
diinkubasi sampai fase eksponensial. Selanjutnya dilakukan subkultur dengan menginokulasikan 10 inokulum dari kultur pada LB kemudian diinkubasi kembali
sesuai dengan fase eksponensialnya.
c. Daya Degradasi Kitin pada Tepung Cangkang Udang Menggunakan Bakteri Kitinolitik Isolat A7 pada Berbagai Konsentrasi Inokulum
Tepung cangkang udang sebanyak 500 mg disuspensikan ke dalam 20 ml akuades. Sebanyak 2 ml suspensi tersebut dimasukkan ke dalam 10 tabung reaksi
terpisah. Suspensi tersebut kemudian disterilisasi 121
o
C, 15 menit. Setelah didinginkan pada suhu ruang, diinokulasikan isolat bakteri kitinolitik 1 ml, 2 ml, 3
ml, 4 ml, 5 ml. Inokulum tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 6 jam. Setelah waktu inkubasi berakhir, disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit.
Supernatan hasil sentrifugasi diukur kadar N-asetilglukosamin dengan metode Schales
. Sebanyak 0,5 ml supernatan ditambah dengan 0,5 ml akuades steril kemudian
direaksikan dengan 1 ml reagen Schales dan selanjutnya diinkubasi pada air
mendidih selama 10 menit. Setelah diinkubasi, selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya dibuat
kurva regresi hubungan antara konsentrasi N-asetilglukosamin dan absorbansinya dengan persamaan y=a+bx.
3.4.3 Degradasi Tepung Cangkang Udang oleh Crude Enzim Kitinase Produksi Bakteri Isolat A7
a. Produksi Enzim Kitinase Isolat A7 Menggunakan Media Tepung Cangkang Udang pada Beberapa Waktu Inkubasi
Sebanyak 2,5 ml inokulum dari isolat A7 diinokulasikan ke dalam 22,5 ml media produksi kitinase tepung udang; 0,1 K
2
HPO
4
; 0,01 MgSO
4
.7H
2
O; 0,05 Ekstrak yeast; 0,1 Trypton. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30ºC dengan waktu
inkubasi selama 24 jam. Ekstraksi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan kitinase ekstrak
kasar.
b. Uji Aktivitas Enzim Kitinase
Pada uji aktivitas enzim digunakan koloidal kitin 1 sebagai substrat. Koloidal kitin dibuat dengan cara melarutkan 1 gram koloidal kitin dalam 100 ml
akuades steril, lalu disimpan dalam botol gelap kemudian disimpan dalam lemari pendingin. Untuk sampel, 600 µl koloidal kitin 1 ditambahkan dengan 300 µl
buffer fosfat pH 7 dan 300 µl enzim. Untuk kontrol, 600 µl koloidal kitin 1 ditambahkan dengan 300 µl buffer pH 7. Kedua suspensi tersebut kemudian
diinkubasi di dalam waterbath 40
o
C, 30 menit. Pada kontrol ditambahkan 300 µl enzim, lalu didihkan bersamaan dengan sampel pada suhu 100
o
C selama 5 menit. Setelah didihkan, suspensi dibiarkan dingin terlebih dahulu dengan cara direndam
dengan air. Setelah dingin, masing-masing suspensi sampel dan kontrol diendapkan sampai muncul endapan di dasar tabung reaksi lalu diambil sebanyak 500 µl.
Kemudian keduanya ditambahkan 500 µl akuades steril dan 1000 µl reagen Schales. Sebagai blanko, dibuat suspensi yang terdiri atas 1000 µl akuades steril dan 1000 µl
reagen Schales. Ketiga suspensi tersebut sampel, kontrol, dan blanko didihkan pada suhu 100
o
C selama 10 menit kemudian didinginkan. Setelah dingin, diukur absorbansinya dengan spektrofotometer menggunakan panjang gelombang 420 nm.
Aktivitas kitinase
dihitung berdasarkan
selisih antara
kadar N-
asetilglukosamin yang dibebaskan pada saat perlakuan dengan kadar N-
asetilglukosamin yang terdapatpada kontrol. Aktivitas kitinase dihitung berdasarkan N-asetilglukosamin yang terbentuk dari hidrolisis kitin. Satu unit aktivitas kitinase
didefinisikan sebagai
jumlah enzim
yang membebaskan
1 μmol N-
asetilglukosaminmenit Singh et al., 1999.
c. Daya Degradasi Kitin pada Tepung Cangkang Udang Menggunakan Crude Enzim Kitinase Hasil Produksi Bakteri Kitinolitik Isolat A7 pada Berbagai
Konsentrasi Enzim
Tepung cangkang udang sebanyak 500 mg disuspensikan ke dalam 20 ml akuades. Sebanyak 2 ml suspensi tersebut dimasukkan ke dalam 10 tabung reaksi
terpisah. Suspensi tersebut kemudian disterilisasi 121
o
C, 15 menit. Setelah didinginkan pada suhu ruang, diinokulasikan isolat bakteri kitinolitik 1 ml, 2 ml, 3
ml, 4 ml, 5 ml. Setelah didinginkan pada suhu ruang, diinokulasikan isolat bakteri kitinolitik 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 6 jam. Setelah waktu inkubasi berakhir, disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit.
Supernatan hasil sentrifugasi diukur kadar N-asetilglukosamin dengan metode Schales
. Sebanyak 0,5 ml supernatan ditambahkan 0,5 ml akuades steril kemudian direaksikan dengan 1 ml reagen Schales
dan selanjutnya diinkubasi pada air mendidih selama 10 menit. Setelah diinkubasi, selanjutnya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 420 nm menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya dibuat kurva regresi hubungan antara konsentrasi N-asetilglukosamin dan absorbansinya
dengan persamaan y=a+bx.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Uji Klarifikasi Kitinolitik Isolat A7 secara Semikuantitatif
Uji klarifikasi dilakukan untuk memastikan kembali aktivitas kitinolitik bakteri isolat A7. Aktivitas kitinase isolat A7 secara semikuantitatif ditentukan
berdasarkan Indeks Aktivitas Enzim IAE. IAE merupakan hasil perbandingan antara diameter zona bening yang terbentuk dan diameter koloni. Hasil uji aktivitas
kitinolitik secara semikuantitatif menunjukkan bahwa bakteri isolat A7 memiliki IAE sebesar 4.29 saat diinokulasikan pada media kitin Gambar 4.1. Zona bening yang
terbentuk di sekitar koloni menunjukkan bahwa isolat A7 mampu mensekresikan kitinase yang mendegradasi senyawa kitin yang terkandung di dalam media agar
kitin. Kitinase merupakan kelompok enzim yang mengkatalis reaksi hidrolisis kitin menjadi senyawa yang memiliki berat molekul yang lebih rendah Jholapara et al.,
2013. Menurut Apriani 2008, enzim kitinase yang disekresikan menyebabkan kandungan kitin pada media agar kitin berkurang. Hal ini disebabkan karena partikel
kitin berikatan dengan enzim kitinase kemudian didegradasi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan terbentuk zona bening di sekitar koloni.
Gambar 4.1 Hasil analisis aktivitas kitinolitik bakteri isolat A7 pada media agar kitin
