PENENTUAN KONSENTRASI DAN NILAI LC

IV. PENENTUAN KONSENTRASI DAN NILAI LC

50 EKSTRAK KASAR ETANOL PLIEK U, MAKANAN FERMENTASI TRADISIONAL ACEH Determination of Concentration and LC 50 value of Crude Ethanol Extract of Pliek u, Aceh fermented traditional food Abstract Pliek u has been consumed as spices and ingredient of hot sauce sambal and also used as poultry feed. These foods obtained from home industry in Reudep village at Aceh Besar, Nanggroe Aceh Darussalam. The crude ethanol extract of pliek u was obtained by extraction of pliek u with ethanol 96. The concentration of crude ethanol extract of pliek u EEP was determined with the dilution method against five bacterial strains Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella Enteritidis and Pseudomonas aeruginosa, and one fungal strain Candida albicans. The initial test of toxicity has been detected by using Artemia salina L. Lethality Test is conducted to determine the toxic concentration based on the LC 50 value of EEP. The results indicated that crude EEP showed antimicrobial activity at a minimal inhibitory concentration MIC and a minimal microbicidal concentration MMC at 2.5-10 mgml and 10-20 mgml, respectively. The lethality concentration of crude EEP resulted the LC 50 value at 3.36 mgml. The research concluded that crude EEP was not toxic for A. salina L and needed further evaluation for characterization antimicrobial compound of crude EEP. Keywords: pliek u, Aceh fermented coconut, MIC, toxicity. Pendahuluan Ekstrak alami yang berbahan dasar tumbuh-tumbuhan seperti herbal, rempah- rempah lebih banyak dimanfaatkan sebagai makanan, bumbu bahkan sebagai obat. Salah satu jenis tumbuh-tumbuhan yang sudah dimanfaatkan oleh masyarakat sejak ratusan tahun yang lalu adalah kelapa Cocos nucifera L. Daging buah dan minyak kelapa digunakan sebagai makanan dan obat untuk mengobati penyakit kulit, saluran pencernaan, penyakit kelamin hingga influenza Fife 2005. Komponen terbesar asam lemak jenuh pada daging buah dan minyak kelapa adalah asam laurat 48-50, yang sangat berperan dalam makanan karena berkaitan dengan fungsinya sebagai antibakteri, antijamur, antivirus dan antiprotozoa Enig 2000 serta tidak toksik terhadap mukosa Kabara 2000. Indonesia merupakan salah satu negara penghasil beragam makanan fermentasi, seperti tempe, oncom, tempoyak. Tempe merupakan produk fermentasi tradisional yang mengandung senyawa antimikrob Winarno 1982; Ginandjar 2000. Pliek u merupakan salah satu produk fermentasi asal Aceh. Pliek u diperoleh dari daging buah kelapa yang difermentasi tanpa disengaja selama beberapa hari untuk mendapatkan minyak pliek u Bakar et al. 1985; komunikasi langsung. Berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak kasar etanol dari pliek u mempunyai aktivitas antimikrob terhadap bakteri Gram positif, bakteri Gram negatif dan Candida albicans Nurliana et al. 2009, sedang proses publikasi di Forum Pascasarjana. Aktivitas suatu antimikrob tidak berarti apabila antimikrob tersebut tidak efektif pada saat diaplikasikan, sehingga diperlukan pengujian efektivitas bahan tersebut. Salah satu pengujian tahap awal yang sangat penting dilakukan adalah mengetahui efikasinya secara invivo Cowan 1999. Metode pengujian toksisitas dengan menggunakan larva Artemia salina L merupakan uji yang sangat sederhana dan cepat serta dapat dijadikan sebagai uji awal untuk mengetahui toksisitas senyawa antimikrob Khrisnaraju et al. 2005. Kemampuan bahan uji membunuh larva Artemia salina L berdasarkan 50 kematian larva Kanwar 2007. Metode tersebut juga memberikan hasil yang sangat baik untuk menguji toksisitas bahan kimia, ekstrak tumbuh-tumbuhan dan produk- produk alami, limbah, ion-ion metal, bahan kimia pertanian, bahan tambahan makanan, produk-produk pembersih rumah dan obat-obatan Lieberman 1999; Carballo et al. 2002; Nunes et al. 2006; Kiviranta et al. 2007. Untuk mendukung manfaat pliek u sebagai makanan kesehatan dan peluangnya sebagai sumber antimikrob, maka perlu dilanjutkan kajian terhadap aktivitas senyawa antimikrob berdasarkan konsentrasi efektif dalam menghambat dan membunuh bakteri dan jamur. Penelitian ini dilakukan untuk melengkapi informasi terhadap karakterisasi ekstrak kasar etanol dari pliek u EEP yang memberikan aktivitas terbaik sebagai antimikrob. Metode Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi-Biokimia, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi PPSHB-Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian Bogor sejak Januari 2006 sampai September 2007. Tahap penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1. Pliek u Pliek u merupakan bahan utama dalam penelitian ini, diperoleh dari tempat produksi rumah tangga, berlokasi di Desa Redeup, Aceh Besar, Nanggroe Aceh Darussalam NAD. Kultur Mikrob Kultur mikrob terdiri dari Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, yang diperoleh dari Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Bogor. Salmonella Enteritidis, berasal dari Laboratorium pribadi milik J. Sri Poernomo, Cimanggu Bogor. Bacillus cereus BCC 2118 dan Pseudomonas aeruginosa BCC 2137 berasal dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB. Candida albicans, isolat klinik dari Laboratorium Mikologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Ekstraksi Pliek u Ekstraksi pliek u dikerjakan sesuai dengan prosedur Duraipandiyan et al. 2006 dan Sudirman 2005a. Ekstraksi dilakukan dengan menambahkan pliek u 20 g dalam 200 ml etanol 96 Bratachem. Campuran tersebut dikocok menggunakan refrigerated incubator shaker Innova 4230 New Branswick Scientific, Edison, USA dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 28 o C, kemudian di saring menggunakan fritted glass filter yang disambungkan dengan pompa vakum. Residu pliek u diekstraksi kembali sebanyak dua kali dengan cara yang sama. Filtrat yang diperoleh setiap 24 jam dipekatkan menggunakan evaporator putar Bütchi, Switzerland pada suhu 40- 50 o C dengan tekanan 175 mBAR untuk etanol. Ekstrak yang diperoleh dipekat ulang dengan kompresor udara menjadi ekstrak kasar etanol dari pliek u EEP. Penetapan Minimal Inhibitory Concentration MIC dan Minimal Microbicidal Concentration MMC Pengujian daya hambat senyawa antimikrob terhadap mikrob uji dilakukan dalam media cair berdasarkan prosedur Kim et al. 2004 yang sudah dimodifikasi. Untuk mendapatkan konsentrasi EEP 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 dan 80 mgml, maka prosedur pengujian dilakukan dengan menambahkan EEP masing-masing sebanyak 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160 dan 320 mg ke dalam 4 ml media cair Mueller-Hinton atau potato dextrose yang sudah mengandung mikrob uji 10 6 -10 8 cfuml, kemudian dikocok dengan vorteks selama 10 menit. Suhu inkubasi disesuaikan untuk masing- masing mikrob uji. Jumlah masing-masing mikrob jumlah mikrob awal dan jumlah mikrob akhir setelah waktu inkubasi dihitung berdasarkan metode hitung cawan menggunakan pengenceran desimal dari 1:10 1 – 1:10 9 Swanson et al. 1992. Nilai MIC dihitung menurut Kubo 1992 adalah konsentrasi terendah yang mampu menghambat mikrob 90, sedangkan MMC dihitung berdasarkan Courvalin et al. 1990, diacu dalam Canillac dan Mourey 2001 adalah konsentrasi ekstrak yang menyebabkan mikrob yang hidup hanya 0.01 – 0.1 . MIC dan MMC, dihitung dengan cara sebagai berikut : MIC = 100 - x 100 MMC = x 100 Penentuan Nilai LC 50 berdasarkan Uji Toksisitas menggunakan Artemia salina L Pengujian toksisitas tahap awal terhadap senyawa antimikrob EEP berdasarkan prosedur yang dilakukan oleh Khrisnaraju et al. 2005. Pengujian ini menggunakan telur A. salina L yang diperoleh dari toko penjual makanan ikan. Telur A. Salina L 1 gL diinkubasi selama 48 jam dalam bak air berisi air steril yang sudah dicampur dengan garam laut 35 gL dengan pH 8.5. Bak air dilengkapi dengan aerator. Setelah 48 jam larva yang aktif dilihat dibawah mikroskop stereo pembesaran 40x dilengkapi dengan Olympus optikal, kemudian diambil menggunakan pipet tetes sebanyak 10 ekor untuk setiap perlakuan dan dimasukkan dalam vial yang mengandung air garam laut. Perlakuan terdiri dari kontrol air garam, penambahan EEP dengan konsentrasi 1,25; 2,5; 5; dan 10 mgml. Jumlah larva yang mati dihitung setelah 24 jam inkubasi. Persentase kematian ditentukan berdasarkan Seen 2005, dengan rumus : kematian = x 100 Analisis Data Data dari hasil penentuan konsentrasi berdasarkan MIC dan MMC dianalisis secara deskriptif, sebelumnya data ditansformasikan terlebih dahulu menjadi log cfuml. Semua data ditampilkan sebagai rata-rata ± standar deviasi SD, ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar. Nilai LC 50 diplotkan menggunakan analisis persaman regresi linier menggunakan bantuan program excell for windows. Data yang diperoleh ditampilkan dalam bentuk grafik. jumlah mikrob akhir jumlah mikrob awal jumlah mikrob akhir jumlah mikrob awal jumlah larva yang mati jumlah larva hidup + jumlah larva mati Hasil dan Pembahasan Konsentrasi Ekstrak Kasar Etanol Pliek u EEP berdasarkan Minimal Inhibitory Concentration MIC dan Minimal Microbicidal Concentration MMC Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak kasar etanol dari pliek u EEP terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif serta C. albicans dapat dilihat pada Gambar 7 dan Lampiran 4. Gambar 7 Pengaruh berbagai konsentrasi EEP terhadap a B. cereus, b S. aureus, c S. Enteritidis d E. coli, e P. aeruginosa, f C. albicans. 0 jumlah mikrob awal tanpa perlakuan, 0 jumlah mikrob setelah inkubasi tanpa perlakuan, waktu inkubasi 24 jam untuk bakteri; waktu inkubasi 2 hari untuk C. albicans 7.25 11.57 7.47 7.46 7.9 6.44 2.07 1.47 2 4 6 8 10 12 14 0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 konse ntrasi e kstrak e tanol mgml Ju m la h S a lm o n e lla E n te r iti d is cf u m l lo g 1 6.14 9.44 9.83 9.25 8.2 4.5 3.74 3.87 2.57 2 4 6 8 10 12 0 0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 Konsentrasi ekstrak etanol mgml Ju m lah Ba c il lus c e re us cf u ml l o g 1 7.3 10.81 6.32 5.39 4.46 1.77 2 4 6 8 10 12 0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 Konsentrasi e kstrak etanol mgml Ju m lah P se u d o m o n a s a e ru g in o sa c fu m l log 10 5.39 9.43 5.8 5.14 3.44 2.56 1.3 2 4 6 8 10 0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 Konsentrasi e kstrak etanol mgml Ju m lah C an di da al bi c a n s cf u ml l og 10 7.41 12.55 10.79 8.41 4.51 3.54 2.54 2.07 0.9 2 4 6 8 10 12 14 0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 Konse ntrasi e kstrak e tanol mgml Ju m lah S ta p h yl o co ccu s a u reu s cf u ml lo g 1 8.39 10.46 7.75 6.46 3.54 3.64 2.93 2.98 2.82 2 4 6 8 10 12 0 1.25 2.5 5 10 20 40 80 Konse ntrasi e kstrak e tanol mgml Ju m la h E sc h er ic h ia co li cf u m l l o g 1 a b d c f e Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan terhadap aktivitas senyawa antimikrob EEP yang memberikan aktivitas antimikrob terbaik terhadap bakteri dan fungi. Penambahan berbagai konsentrasi EEP 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 dan 80 mgml menyebabkan penurunan yang bervariasi dari jumlah masing-masing mikrob uji dibanding kontrol. Penambahan konsentrasi EEP 20-80 mgml menyebabkan tidak ada pertumbuhan P. aeruginosa, sedangkan konsentrasi EEP 80 mgml menunjukkan tidak ada pertumbuhan S. Entiritidis dan konsentrasi EEP 40-80 mgml juga menunjukkan tidak ada pertumbuhan C. albicans Gambar 7. Konsentrasi MIC yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif adalah 10 dan 5 mgml untuk B.cereus dan S. aureus. Konsentrasi MIC terhadap bakteri Gram negatif S. Enteritidis, E. coli dan P. aeruginosa masing-masing 10, 2.5 dan 5 mgml dan konsentrasi MIC terhadap C. albicans adalah 5 mgml. Konsentrasi mikrobisida MMC yang menyebabkan kematian mikrob uji berkisar 10-20 mgml, yaitu pada konsentrasi 10 mgml untuk bakteri, sedangkan untuk C. albicans adalah 20 mgml. Berdasarkan penentuan MIC menunjukkan bahwa E. coli sangat sensitif terhadap EEP dibandingkan mikrob uji lainnya, sedangkan B. cereus dan S. Enteritidis sangat tahan, yang membutuhkan EEP dengan konsentrasi paling besar Tabel 5. Tabel 5 MIC dan MMC ekstrak kasar etanol EEP terhadap bakteri dan fungi Mikrob Jumlah mikrob awal log cfuml Jumlah mikroba akhir log cfuml MIC mgml MMC mgml MMCMIC B. cereus 1,4 x 10 6 3,2 x 10 4 4.5 10 8 6.14 3,8 x 10 2 2.57 80 S. aureus 2,6 x 10 7 3,28 x 10 4 4.51 5 2 7.41 3,5 x 10 3 3.54 10 S. Enteritidis 1,8 x 10 7 2,8 x 10 6 6.44 10 2 7.25 1,2 x 10 2 2.07 20 E. coli 2,5 x 10 8 2,9 x 10 6 6.46 2.5 8.39 4,4 x 10 3 3.54 10 4 P. aeruginosa 2,0 x 10 7 2,9 x 10 4 4.46 5 7.3 6,0 x 10 1 1.77 10 2 C. albicans 2,5 x 10 5 2,8 x 10 3 3.44 5 5.39 2,0 x 10 1 1.3 20 4 Apabila dianalogkan dengan antibiotik berdasarkan ratio MMCMIC ≤ 4 maka strain mikrob dikategorikan sensitif dan jika rationya 4 digolongkan lebih toleran Courvalin et al. 1990, diacu dalam Canillac dan Mourey 2001. Apabila 1 ratio MMCMIC 8 maka antimikrob digolongkan bersifat bakteriostatik. Berdasarkan klasifikasi tersebut B. cereus tergolong lebih toleran terhadap EEP, sedangkan S. aureus, S. Enteritidis, E. coli, P. aeruginosa dan C. albicans digolongkan strain mikrob yang rentan susceptible terhadap EEP, maka EEP dapat digolongkan antimikrob bersifat bakteriostatik. Sensitifitas mikrob bisa sangat dipengaruhi oleh jenis mikrob strain yang berbeda, jumlah awal dan bahan antimikrob yang digunakan serta fase pertumbuhan mikrob Entani et al. 1998. Senyawa antimikrob mempunyai pengaruh yang kecil pada saat proses sintesis sel selama fase statis, sehingga tidak semua mikrob akan menurun jumlahnya dengan dosis MIC. Hal tersebut juga dipengaruhi oleh komponen-komponen yang terkandung di dalam media pertumbuhan mikrob dan interaksinya dengan dinding sel dan membran mikrob. Pertumbuhan mikrob pada fase log atau fase eksponensial lebih sensitif dan lebih mudah dibunuh dibandingkan pada fase stasioner Corre et al. 1990, diacu dalam Carson et al. 2002. Menurut Kabara 2000, aktivitas antibakteri dari monogliserida dan asam lemak bebas adalah dengan merusak pertahanan permiabilitas membran sel dan menghambat pengambilan asam amino. Helicobacter pylori yang diinkubasi selama 1 jam dengan monogliserida lemak jenuh panjang karbon dari C10:0-C14:0 menunjukkan penurunan jumlah bakteri tersebut sebesar 4 log, namun tidak demikian dengan menambahkan C9:0, C15:0, dan C16. Interaksi dengan struktur hidrofobik merupakan kunci utama aksi antimikrob hidrokarbon Sikkema et al. 1995. Menurut Maguire 2000, secara umum kerja agen antimikrob bereaksi secara langsung dan tidak langsung ke target membran sel, walaupun secara detail mekanismenya belum begitu jelas. Efektivitas suatu antimikrob sangat tergantung pada kemampuannya mencapai target sasaran Hogan 2003, terutama terhadap bagian-bagian sel sasaran. Efek antibakteri dapat beraksi pada beberapa target sasaran pada membran bakteri, sehingga menyebabkan kerusakan atau autolisis dan juga terhambatnya pertumbuhan atau bahkan kematian sel Ahn et al. 2004. Maguire 2000, menambahkan bahwa sifat-sifat fisikokimia antimikrob, seperti tegangan dan hidrophobisitas merupakan faktor penentu utama keefektifan dari antimikrob. Penentuan Nilai LC 50 Ekstrak Kasar Etanol dari Pliek u EEP Berdasarkan Uji Toksisitas Menggunakan Artemia salina L Penelitian ini menggunakan organisme uji yaitu udang-udangan air asin Artemia salina L. Setelah 15 sampai 20 jam diinkubasi dalam air garam maka telur- telur udang-udangan akan menetas dan beberapa jam kemudian berenang dengan sempurna untuk mendapatkan nutrisi. Selanjutnya setelah inkubasi 48 jam menjadi bentuk nauplii larva tahap instar III atau IV. Bentuk dewasa akan terjadi pada hari kedelapan Treece 2000. Penelitian terhadap toksisitas ekstrak kasar etanol dari pliek u EEP menghasilkan uji yang cepat dan sangat sederhana. Sesuai pendapat Khrisnaraju et al. 2005, yang menguji bioaktivitas tumbuh-tumbuhan obat asal India dan sangat mendukung penggunaan obat-obat tersebut secara tradisional, sehingga metode ini bisa diandalkan untuk uji bioaktivitas dan toksisitas suatu bahan uji. Pengujian dengan brine shrimp bioassay menggunakan larva Artemia salina L merupakan metode alternatif yang dapat menggantikan penelitian yang menggunakan hewan-hewan besar, mengurangi angka kesakitan dan stres Kanwar 2007. Penentuan tahap awal suatu bahan yang diduga toksik terhadap konsentrasi moderat dan tinggi dapat dideteksi dengan bioassay menggunakan Artemia salina L, dimana suatu senyawa yang toksik bisa menjadi tidak toksik apabila digunakan hewan coba yang lebih besar Kiviranta et al. 2007. Pengamatan terhadap larva A. salina L yang diberikan EEP dalam media air garam menunjukkan bahwa larva yang mati terlihat berwarna coklat, kemungkinan larva memakan ekstrak pliek u, sedangkan yang masih hidup terlihat masih berwarna jingga Gambar 8. Gambar 8 Larva udang-udangan Artemia salina L yang digunakan pada uji toksisitas ekstrak kasar etanol dari Pliek u EEP. Hasil uji toksisitas ekstrak kasar etanol dari pliek u EEP terhadap larva A. Salina L setelah pengamatan 24 jam menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi EEP menyebabkan peningkatan persentase kematian larva Gambar 9. Nilai konsentrasi LC 50 EEP diperoleh berdasarkan analisis persamaan regresi linier adalah 3.36 mgml. Dosis EEP tersebut tidak toksik terhadap A. salina L. Suatu ekstrak dikatakan toksik jika memiliki nilai LC 50 konsentrasi yang mampu membunuh 50 larva A. Salina L 1000 µgml untuk ekstrak kasar dan 200 µgml untuk ekstrak murni setelah waktu kontak 24 jam Meyer et al. 1982. Gambar 9 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak kasar etanol dari Pliek u EEP terhadap larva Artemia salina L Toksisitas suatu bahan juga dipengaruhi oleh jenis ekstraknya. Penelitian yang dilakukan oleh Chaudhry et al. 2003, menunjukkan bahwa tumbuhan obat yang diekstrak dengan metanol tidak memperlihatkan aktivitas biologik pada uji brine shrimp bioassay dibandingkan dengan ekstrak diklorometan. Akan tetapi ekstrak air dari akar dan batang tumbuhan Terminalia brownii memiliki aktivitas toksik yang sangat tinggi Mbwambo et al. 2007. Simpulan Ekstrak etanol kasar dari pliek u EEP berpotensi sebagai senyawa antimikrob dengan konsentrasi penghambat minimal MIC EEP adalah 2.5-10 mgml dan konsentrasi mikrobisida MMC EEP adalah 10- 20 mgml. Nilai konsentrasi LC 50 EEP adalah 3.36 mgml dan tidak toksik terhadap A. salina L. 16.67 20 30 70.33 80.67 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1.25 2.5 5 10 Konsentrasi Esktrak Etanol dari Pliek u m gm l K e m a ti a n La rv a ud a n g Art e mi a sa li n a y = 17.83 x - 9.97

V. STABILITAS EKSTRAK KASAR ETANOL DARI PLIEK U TERHADAP PEMANASAN, PENYIMPANAN DAN pH SERTA