Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Pliek u dalam Menghambat Pertumbuhan Beberapa Mikroorganisme Patogen

(1)

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI

PLIEK U DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN

TESIS

Oleh

ANNISA AMMALIA KITI

117030033/BIO

PROGRAM PASCASARJANA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

M E D A N

2 0 1 3

(2)

PENGESAHAN TESIS

Judul Tesis : POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG

DIISOLASI DARI PLIEK U DALAM

MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BEBERAPA

MIKROORGANISME PATOGEN

Nama Mahasiswa : ANNISA AMMALIA KITI

Nomor Induk Mahasiswa : 117030033

Program Studi : Magister Biologi

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Sumatera Utara

Menyetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP Dr. It Jamilah, M.Sc

NIP.131420019 NIP.19631012 199103 1 001

Ketua Program Studi, Dekan,

Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed Dr. Sutarman, M.Sc

(3)

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI

PLIEK U DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister

Sains dalam Program Studi Magister pada Program Pascasarjana

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Sumatera Utara

Oleh

ANNISA AMMALIA KITI

117030033/BIO

PROGRAM PASCASARJANA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

M E D A N

2 0 1 3

(4)

PERNYATAAN ORISINALITAS

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI

PLIEK U DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN

TESIS

Dengan ini saya nyatakan bahwa saya mengakui semua karya tesis ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali kutipan dan ringkasan yang tiap satunya telah di jelaskan sumbernya dengan benar.

Medan, 23 Agustus 2013

Annisa Ammalia Kiti 117030033

(5)

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Sumatera Utara, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Annisa Ammalia Kiti

NIM : 117030033

Program Studi : Magister Biologi Jenis Karya Ilmiah : Tesis

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Sumatera Utara Hak Bebas Royalti Non-Eksklusif (Non-Exclusive Royalty Free Right) atas Tesis saya yang berjudul :

Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Pliek u dalam Menghambat Pertumbuhan Beberapa Mikroorganisme Patogen

Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). DenganHak Bebas Royalti Non-Eksklusif ini, Universitas Sumatera Utara berhak menyimpan, mengalih data, menformat, mengelola dalam bentuk data-base, merawat dan mempublikasikan Tesis saya tanpa meminta izin dari saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis dan sebagai pemegang dan atau sebagai pemilik hak cipta.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan sebenarnya.

Medan, 23 Agustus 2013

(6)

Telah diuji pada

Tanggal : 23 Agustus 2013

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP Anggota : 1. Dr. It Jamilah, M.Sc

2. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc 3. Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc

(7)

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

DATA PRIBADI

Nama lengkap berikut gelar : Annisa Ammalia Kiti, S.Si, M.Si Tempat dan Tanggal Lahir : Sigli, 17 Juli 1983

Agama : Islam

Nama Ayah : Zuki Sofyan, HA

Nama Ibu : Zuhairaty, AR, S.Pd

Nama Adik : Ghammatiki Perdana, SP

Nama Suami : Muhammad Yudi, SE

Nama Anak : Hanifah Dinny Aliyah

Alamat : Jl. Cempaka No. 3 D KPR BTN Dusun Indah Garot

Keutapang, Aceh Besar

e-mail : nissa_atjeh@yahoo.com

RIWAYAT PENDIDIKAN

SD : MIN Teladan Banda Aceh Tamat : 1995

SMP : SLTP Negeri 7 Banda Aceh Tamat : 1998

SMA : SMU Negeri 4 Banda Aceh Tamat : 2001

Strata-1 : FMIPA Biologi Unsyiah Banda Aceh Tamat : 2007

(8)

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillahirabbil’alamiiin, penulis panjatkan kehadirat Allah SWT., atas segala karunia dan rahmat-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang

berjudul “Potensi Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari Pliek U dalam Menghambat Pertumbuhan Beberapa Mikroorganisme Patogen” dengan baik.

Salawat dan salam bagi junjungan Rasulullah Muhammad SAW., beserta keluarga dan para sahabat yang telah membimbing kita dari alam jahiliyah ke alam yang berilmu pengetahuan.

Penyusunan tesis ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains (M.Si) dalam Program Pascasarjana bidang studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Universitas Sumatera Utara (USU).

Dalam penyusunan tesis ini, berbagai pihak telah banyak memberikan bantuan, saran serta doa kepada penulis, sehingga pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa hormat dan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya, kepada :

Ibu Dr. It Jamilah M.Sc dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP selaku dosen pembimbing serta Bapak Prof. Dr. Erman Munir M.Sc dan Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto M.Sc selaku dosen penguji yang dengan penuh kesabaran telah banyak memberikan bimbingan, pengetahuan kepada penulis selama proses penelitian dan penyusunan tesis ini.

Kepala Laboratorium Mikrobiologi USU, Direktur Balai Teknis Kesehatan Lingkungan dan Penanggulangan Penyakit Menular (BTKL-PPM) Kelas I Medan dan Kepala Laboratorium Biologi BTKL-PPM Medan serta staf Laboratorium Biologi, Kimia dan Parasitologi pada instansi tersebut atas segala bantuan dan kemudahan yang telah diberikan selama penelitian.

Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed selaku Ketua Program Studi Pascasarjana Biologi dan Ibu Dr. Suci Rahayu, M.Si selaku Wakil Program Studi Pascasarjana Biologi beserta seluruh staf atas segala bantuan dan kemudahan yang telah diberikan selama pendidikan.

Bunda dan Ayah yang penulis cintai, Zuhairaty, AR, S.Pd dan Zuki Sofyan, HA beserta adikku tersayang Ghammatiki Perdana yang selalu memberikan dukungan baik moril dan materil sehingga tugas akhir ini dapat terlaksana dengan baik.

Abi Muhammad Yudi atas segala cinta, doa, kesabaran, motivasi, perhatian, dan kebersamaannya dalam suka maupun duka selama bunda menuntut ilmu lagi, serta putri kecilku Hanifah Dinny Aliyah yang keceriaan dan kehangatan senyumnya selalu terpatri di hatiku walaupun sering terpisah oleh jarak dan waktu.

Sahabat-sahabat seperjuangan, Ika Rostika, Ummi Mardhiah BB, Nikmah Ridha BB, Netti Irawati, Kabul Warsito, Jane Melita Keliat, Siti Maimunah, Rahmiati, Widya Lestari, Dewi Rulia, Ulfayani Mayasari, Diannita Harahap, Pak Selamat Riadi, Diah

(9)

Atika Ningrum, Pak Samirin, kak Endang S. Gultom serta semua teman-teman Biologi angkatan 2011 atas motivasi dan doanya.

Kepada semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat disebutkan satu persatu, penulis mengucapkan terima kasih.

Dengan keterbatasan pengalaman, pengetahuan maupun pustaka yang ditinjau, penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangan dan perlu pengembangan lebih lanjut agar dapat bermanfaat. Oleh sebab itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar tesis ini lebih sempurna serta sebagai masukan bagi penulis untuk penelitian dan penulisan karya ilmiah di masa yang akan datang. Akhir kata, penulis berharap tesis ini memberikan manfaat bagi kita semua terutama untuk pengembangan ilmu pengetahuan. Aamiiin Ya Rabbal’alamiiin.

Wassalamu’alaikum Wr. Wb.

(10)

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI PLIEK U

DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN

ABSTRAK

Pliek u merupakan bahan pangan khas Provinsi Aceh, Indonesia yang dibuat dengan proses fermentasi tanpa penambahan kultur starter bakteri. Bakteri asam laktat (BAL) secara alami diduga berperan dalam fermentasi tersebut. Keberadaan BAL dalam bahan pangan fermentasi menghasilkan senyawa metabolit yang berperan sebagai antimikroba, sehingga dapat menghambat atau mengontrol pertumbuhan mikroorganisme lain seperti bakteri patogen dan perusak bahan pangan. Penelitian ini bertujuan untuk isolasi, karakterisasi isolat yang diperoleh dari pliek u dan mengetahui potensinya dalam menghambat mikroba patogen. Karakterisasi isolat dilakukan secara fenotipik dengan mengamati sifat morfologi dan fisiologi tiap isolat dan pengujian daya hambat terhadap mikroba patogen dilakukan secara invitro. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli

ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923, namun tidak dapat menghambat isolat klinis Candida albicans. Penghambatan tertinggi terhadap E. coli dan Staph. aureus berturut-turut ditunjukkan oleh isolat NQ2 dengan diameter zona bening sebesar 8,5 mm dan 4 mm, sedangkan penghambatan terendah ditunjukkan oleh isolat NQ3 dan NQ4, masing-masing sebesar 1,5 mm dan 1,2 mm. Berdasarkan karakterisasi sifat morfologi dan fisiologinya, isolat NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 memiliki beberapa perbedaan dengan BAL pada umumnya yaitu katalase positif, motil. Karakteristik lain dari isolat ini memiliki endospora dan Gram positif basil sehingga diduga digolongkan ke dalam genus Bacillus. Kelima isolat tersebut toleran terhadap asam dan kadar NaCl 10% serta memiliki aktivitas proteolitik, amilolitik, dan kitinolitik. Berdasarkan hal tersebut dapat disimpulkan bahwa pliek u dapat dijadikan sebagai makanan fungsional dan isolat bakteri yang diperoleh dapat dijadikan sebagai kandidat dalam formulasi probiotik dan fermentasi makanan.

(11)

POTENCY OF LACTIC ACID BACTERIA WHICH IS ISOLATED FROM PLIEK U IN INHIBITING THE GROWTH OF SEVERAL

PATHOGEN MICROORGANISMS

ABSTRACT

Pliek u is one of a distinctive food from Aceh Province, Indonesia. The fermentation process of pliek u was done without adding starter culture of bacteria. Lactic acid bacteria (LAB) naturally alleged involved in this fermentation. The presence of LAB in a fermented food produced some metabolites compound that act as antimicrobial agent, which can inhibits or control the growth of pathogenic bacteria or food spoilage. The aims of this research were to isolate, characterize bacteria isolated from pliek u and to determine their potential activity in inhibiting pathogenic microbes. The phenotypic characterization of isolates were conducted by observing the morphology and physiology of each isolate and the inhibition zone against pathogens microbial which were carried in vitro. The results showed that NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, and NQ5 isolates have inhibited activities towards the growth of Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923, but could not inhibit clinical isolate Candida albicans. The highest inhibition against E. coli and Staph. aureus was consecutively shown by NQ2 isolates as much as 8.5 mm and 4 mm, while the lowest inhibition shown by NQ3 and NQ4 isolates, respectively 1.5 mm and 1.2 mm. Based on cells morphological characterization and physiological properties, five isolates NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5 were quite different from known LAB generally, i.e. catalase positive and motile. The other characteristics are they have endospores and Gram-positive bacilli, so it is alleged classified into the genus Bacillus. All isolates were tolerant to acid and 10% NaCl concentration and they have proteolytic, amylolytic, and chitinolytic activities. In conclusion, pliek u could be used as a functional food and the isolates that has been found could be used as candidates in probiotics formulation and fermentation foods.

(12)

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR i

ABSTRAK iii

ABSTRACT iv

DAFTAR ISI v

DAFTAR TABEL vii

DAFTAR GAMBAR viii

DAFTAR LAMPIRAN ix

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1.2 Perumusan Masalah 1.3 Tujuan Penelitian 1.4 Hipotesis

1.5 Manfaat Penelitian

1 1 3 4 4 4 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Fermentasi Pliek U

2.2 Senyawa Antimikroba Pliek U

2.3 Bakteri Asam Laktat (BAL)

2.4 Peran BAL dalam Menghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen 5 5 8 9 10

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2 Alat dan Bahan

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Pengukuran Total Asam

3.3.2 Penghitungan Populasi BAL dan Non BAL 3.3.3 Isolasi BAL

3.3.4 Uji Antagonis BAL Terhadap Mikroorganisme Patogen

3.3.5 Karakterisasi Isolat Potensial 3.4 Prosedur Analisis

3.4.1 Pewarnaan Gram 3.4.2 Pewarnaan Spora 3.4.3 Uji Katalase 3.4.4 Uji Motilitas

12 12 12 13 13 14 15 15 16 16 16 17 17 17

(13)

3.4.5 Uji Pembentukan H2S dan Fermentasi gula

3.4.6 Pengaruh Suhu dan pH terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih

3.4.7 Pengaruh NaCl terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih 3.4.8 Uji Produksi Gas dari Glukosa

3.5 Identifikasi Isolat yang Diduga BAL Sampai Tingkat Genus 3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Protease, Amilase, dan Kitinase

3.7 Pengukuran Total Asam Supernatan Isolat BAL Terpilih

18 18 19 19 19 20 20 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Persentase Total Asam pada Bahan Pangan Pliek u

4.2 Isolasi BAL dari Pliek U

4.3 Seleksi Isolat Potensial Berdasarkan Uji In vitro

4.4 Karakterisasi Morfologi, Biokimia, dan Fisiologi Sel Isolat Terpilih

4.5 Populasi BAL dan Non BAL dari Sampel Pliek U

4.6 Pengaruh Suhu dan PH yang Berbeda Terhadap Pertumbuhan 5 Isolat BAL Terpilih Hasil Isolasi dari Pangan Pliek U

4.6.1 Pengaruh Suhu 4.6.2 Pengaruh pH

4.7 Pertumbuhan pada MRSA+NaCl dengan Konsentrasi Berbeda

4.8 Aktivitas Enzim Protease, Amilase, dan Kitinase Secara Kualitatif

4.9 Total Asam Supernatan Isolat BAL Terpilih

22 22 23 25 29 38 40 40 43 45 46 48 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 5.2 Saran

51 51 52

DAFTAR PUSTAKA 53

LAMPIRAN L-1

(14)

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

3.1 Reaksi-reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA 18

4.1 Karakteristik morfologi Koloni bakteri yang diduga BAL 24 4.2 Karakteristik morfologi dan fisiologi sel isolat terpilih 35 4.3 Perbedaan dan persamaan karakteristik utama antar genus

Bacillus, Lactobacillus, dan Sporolactobacillus dengan kelima isolat yang diisolasi dari pliek u

(15)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

2.1 Tahap proses pembuatan pliek u. 7

4.1 Persentase total asam pada tiga tahapan pengolahan

pliek u

22 4.2 Diameter zona hambat (mm) 5 isolat BAL terhadap

E. coli ATCC 25922 dan Staph. aureus ATCC 25923

25 4.3 Uji in vitro 5 isolat BAL terpilih terhadap E. coli ATCC

dan Staph. aureus ATCC 25923

4.4 Pewarnaan Gram isolat BAL terpilih 30

4.5 Pewarnaan spora isolat BAL terpilih 32

4.6 Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan 5 isolat BAL terplilih

41 4.7 Pengaruh pH terhadap pertumbuhan5 isolat BAL

terpilih

4.8 Pertumbuhan isolat BAL terpilih pada MRSA+NaCl 4% 46

4.9 Zona hidrolis protease, amilase, dan kitinase 47

(16)

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

A Diagram Alir Proses Pembuatan Pliek U L-1

B Diagram Alir Prosedur Penelitian L-2

C Komposisi Media Susu Skim dan Media MGMK L-3

(17)

POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI PLIEK U

DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BEBERAPA MIKROORGANISME PATOGEN

ABSTRAK

(18)

POTENCY OF LACTIC ACID BACTERIA WHICH IS ISOLATED FROM PLIEK U IN INHIBITING THE GROWTH OF SEVERAL

PATHOGEN MICROORGANISMS

ABSTRACT

(19)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Pohon kelapa (Cocos nucifera L.) telah dikenal sejak ratusan tahun yang lalu sebagai pohon kehidupan karena telah menyediakan berbagai macam kebutuhan penting bagi manusia. Kelapa sudah dimanfaatkan sebagai makanan, minuman, bahan untuk membangun rumah, bahan bakar dan penggunaannya dalam industri. Selain itu juga dapat dimanfaatkan sebagai obat (Conrado, 2000). Di daerah Provinsi Aceh, masyarakat mengolah daging buah kelapa menjadi minyak pliek u (minyeuk simplah dan minyeuk brok) yang residu akhirnya menjadi pliek u.

Pliek u merupakan bahan pangan khas yang berasal dari Provinsi Aceh yang secara turun-temurun telah digunakan sebagai bumbu masak, sambal dan pakan ternak. Secara tradisional pliek u diolah dari daging buah (mesocarp)kelapa yang difermentasi selama 15 – 20 hari. Pada umumnya pembuatan produk tersebut meliputi beberapa tahapan seperti proses fermentasi, pemerasan dan penjemuran di bawah sinar matahari (Nurliana et al., 2002; Nurliana et al., 2008, 2009, Nurliana, 2009; Nurliana dan Sudirman, 2009; Darsono et al., 2011a, 2011b; dan Mustaqimah et al., 2011). Makanan tradisional ini dihasilkan melalui fermentasi tanpa penambahan kultur starter atau terfermentasi secara spontan atau tanpa disengaja.

(20)

Berdasarkan penelitian Nurliana (2002), diduga fermentasi pada bahan makanan ini disebabkan oleh bakteri asam laktat. Supernatan isolat BAL yang diperoleh diduga menghasilkan senyawa bioaktif (bakteriosin) karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Listeria monocytogenes.

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu mikroorganisme yang berperan dalam fermentasi berbagai jenis makanan. BAL telah lama dikenal dan digunakan oleh manusia dalam proses pengolahan pangan yang menghasilkan produk akhir dengan kualitas yang dapat lebih diterima daripada bahan bakunya. Bakteri ini memberikan kontribusi terhadap karakteristik yang khas seperti aroma, rasa, tekstur dan masa simpan produk yang lebih lama. Bila ditinjau dari nilai gizinya, produk fermentasi menghasilkan komponen-komponen nutrisi yang lebih mudah dicerna melalui perombakan serta diproduksinya senyawa-senyawa yang bermanfaat oleh mikroorganisme yang terlibat di dalamnya (Wirawati, 2002; Jay et al., 2005; Hutkins, 2006).

BAL yang diisolasi dari berbagai makanan tradisional telah dilaporkan dapat menghambat pertumbuhan mikroba patogen. Lactobacillus plantarum ATCC 25927 yang diisolasi dari ogi, makanan tradisional yang difermentasi dari jagung dapat menghambat Candida albicans dengan zona hambatan 22 mm (Oluwafemi dan Adetunji, 2011). Bettache et al. (2012) menyatakan bahwa hasil isolasi BAL pada dhan,

mentega susu fermentasi tradisional yang berasal dari Negara Algeria Barat ditemukan genus Leuconostoc sebanyak 8 isolat, Lactococcus 13 isolat dan 35 isolat Lactobacillus.

Ketiga genus tersebut mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Listeria innocua. Selanjutnya BAL yang diisolasi dari berbagai makanan tradisional di Indonesia seperti gatot, growol, tempoyak, peda, bekasam, tape, tempe, wadi dan terasi umumnya didominasi oleh L. plantarum, Streptococcus thermophillus, dan Pediococcus acidilactici. Dari hasil skrining, diketahui

(21)

yang dapat menghambat berbagai jenis bakteri patogen yang diujikan (Rahayu et al.,

1996, 2000; Wirawati, 2002; Rahayu, 2003; Wikandari et al., 2012; dan Putri et al.,

2012).

Keberadaan BAL dalam bahan pangan yang mengalami fermentasi menghasilkan senyawa metabolit yang berperan sebagai antimikroba, sehingga dapat menghambat atau mengontrol pertumbuhan mikroorganisme lain seperti bakteri patogen dan perusak bahan pangan. BAL menghasilkan komponen antimikroba seperti asam organik (asam laktat, asam asetat, asam propionat), hidrogen peroksida dan bakteriosin (Ray dan Bhunia, 2008; Amezquita dan Brashears, 2002; dan Vuyst dan Leroy, 2007). Sampai saat ini belum ada informasi yang jelas mengenai jenis BAL yang berperan dalam fermentasi pliek u. Oleh karena itu berdasarkan uraian di atas, peneliti tertarik untuk mengisolasi dan mengidentifikasi BAL dari pliek u dan menguji potensinya dalam menghambat pertumbuhan beberapa mikroorganisme patogen.

1.2Perumusan Masalah

Berdasarkan hasil penelitian Nurliana (2009), melalui ekstraksi menggunakan pelarut etanol dan heksan telah diketahui bahwa pliek u mengandung senyawa antimikrob serta berpeluang sebagai makanan kesehatan. Namun belum diketahui secara pasti mikroba yang berperan dalam fermentasi pliek u, khususnya jenis bakteri asam laktat. Oleh karena itu telah dikaji lebih lanjut mengenai jenis bakteri asam laktat yang berperan dalam proses fermentasi pliek u dan pengujian aktivitas antagonisnya terhadap beberapa mikroorganisme patogen.

(22)

1.3Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk (1) mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL dari

pliek u pada beberapa tahapan pengolahan (2) mengetahui potensi BAL yang diisolasi dari pliek u dalam menghambat beberapa mikroorganisme patogen seperti Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan isolat klinis Candida albicans (3) mengetahui Total Plate Count (TPC) BAL dan Non-BAL dari pliek u.

1.4Hipotesis

Hipotesis yang diajukan ialah bakteri asam laktat yang diisolasi dari pliek u

berpotensi menghambat pertumbuhan beberapa mikroorganisme patogen.

1.5Manfaat Penelitian

Melalui penelitian ini diharapkan dapat memperoleh jenis-jenis bakteri asam laktat asal pliek u yang berpotensi untuk menghambat pertumbuhan beberapa mikroorganisme patogen. Informasi yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat mendukung upaya pengembangan dan konsumsi makanan tradisional Aceh, khususnya

(23)

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Fermentasi Pliek u

Selama lebih kurang sepuluh ribu tahun manusia telah mengkonsumsi makanan fermentasi. Sepanjang sejarah, fermentasi merupakan salah satu teknik untuk memproduksi makanan yang diawetkan dengan baik dan aman dikonsumsi. Sampai saat ini, fermentasi makanan masih menjadi salah satu teknik yang paling populer. Sekitar sepertiga makanan yang dikonsumsi ialah makanan yang difermentasi. Fermentasi bertujuan untuk mengawetkan makanan yang mudah rusak sehingga diperoleh produk dengan kualitas yang lebih baik dari bahan bakunya (Hutkins, 2006). Sejak fermentasi makanan bermula, nenek moyang kita mengakui bahwa makanan fermentasi tidak hanya memiliki rasa yang segar dan khas, tetapi juga tahan lebih lama selama penyimpanan serta mengurangi kemungkinan terserangnya penyakit yang disebabkan oleh kontaminasi mikroorganisme melalui makanan. Melalui proses fermentasi, berbagai jenis bahan pangan dapat diawetkan secara alami menjadi beragam produk yang kualitasnya lebih baik daripada bahan bakunya, sehingga hal ini menjadi alasan utama makanan fermentasi begitu populer di kalangan masyarakat peradaban dahulu yang berlokasi di daerah bertemperatur tinggi (Ray dan Bhunia, 2008).

Menurut Ray dan Bhunia (2008), pengetahuan mengenai keamanan dan stabilitas makanan fermentasi telah digunakan selama berabad-abad dan membantu peneliti untuk memahami dasar-dasar ilmiahnya. Saat ini telah diketahui bahwa mikroba yang terkait dengan fermentasi makanan dapat menghasilkan beberapa jenis metabolit yang memiliki

(24)

sifat antimikroba seperti asam organik, aldehid, keton, alkohol, diasetil, etanol, hidrogen peroksida, reuterine, dan bakteriosin, serta adanya senyawa-senyawa lain yang belum dapat diidentifikasi. Semakin meningkatnya minat penggunaan antimikroba dalam makanan nonfermentasi (nonfermented foods) yang bertujuan untuk meningkatkan stabilitas dan keamanan pangan. Beberapa hasil fermentasi mikroba seperti asam laktat dan asam asetat (cuka) telah sejak lama digunakan dalam berbagai jenis makanan. Selain itu beberapa jenis khamir telah ditemukan dapat menghambat pertumbuhan kapang pada buah-buahan dan sayur.

Pliek u merupakan salah satu makanan khas dari Aceh yang dihasilkan dari fermentasi daging buah kelapa secara tradisional. Selama berabad-abad pengetahuan mengenai teknologi fermentasi tradisional biasanya diturunkan dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Produk fermentasi pliek u menjadi bagian yang tidak terpisahkan dari menu makanan sehari-hari masyarakat Aceh, biasanya pliek u dimanfaatkan sebagai bumbu untuk memasak sayur (gulé pi’u), sambal dan bumbu rujak. Diduga selama proses pengolahannya terjadi berbagai perubahan sehingga menghasilkan berbagai metabolit yang mempunyai aktivitas antimikrob. Senyawa tersebut dapat terbentuk dari bahan baku ataupun juga dihasilkan oleh mikroba selama proses fermentasi, karena proses fermentasi makanan erat kaitannya dengan mikroorganisme atau enzim. Senyawa- senyawa yang dihasilkan secara alami oleh mikroba tersebut dapat diekstraksi dan dipurifikasi, serta dapat digunakan untuk mengawetkan makanan dan sebagai bahan antimikroba (Nurliana, 2009).

Berdasarkan penelitian Nurliana (2009), proses pembuatan pliek u (Gambar 2.1) dilakukan selama lebih kurang 20 hari dengan cara pemeraman (fermentasi secara tradisional) daging buah kelapa tanpa menambahkan mikroba apapun. Menurut masyarakat Aceh, produk ini diajarkan secara turun-temurun dari orang tua mereka dan terjadi tanpa disengaja. Proses fermentasi ini terdiri dari tiga tahap fermentasi, yaitu

(25)

pemeraman buah kelapa, pemeraman daging buah kelapa, dan pemeraman serta penjemuran daging buah kelapa.

Pada tahap pertama, buah kelapa dibelah (tidak sampai terbuka) dan airnya dibuang, kemudian dibiarkan selama 4 – 5 hari. Setelah itu daging buah kelapa dikukur dan ditempatkan dalam wadah tertutup. Selanjutnya dibiarkan selama 4 – 5 hari pada suhu kamar (29 – 36 ºC) yang tidak terpapar cahaya. Tahap ini merupakan tahap kedua. Minyak yang terbentuk pada tahap ini diambil, minyak tersebut dikenal dengan minyeuk simplah atau minyeuk reutek. Tahap selanjutnya adalah tahap ketiga. Pada tahap ini

Gambar 2.1 Tahap proses pembuatan pliek u. (A) buah kelapa yang sudah

dibuang airnya dan dibiarkan selama 4-5 hari; (B,C,D) daging buah kelapa yang sudah dikukur dan dibiarkan 5 hari sampai keluar minyak (minyeuk simplah); (E,F,G,H,I) proses penjemuran, pemeraman dan pemerasan untuk memperoleh minyak (minyeuk brok) dan pliek u (Nurliana, 2009)

A

B

C

D

E

F

(26)

dilakukan penjemuran, pemeraman (fermentasi) dan pengepresan terhadap residu yang dihasilkan pada tahap kedua, yang dilakukan selama lebih kurang 5 hari pada suhu kamar (29 – 36 ºC). Minyak yang diperoleh pada tahap ini disebut minyeuk brok, sedangkan residu yang diperoleh disebut pliek u atau patarana, namun masyarakat umumnya menyebut pliek u. Secara organoleptik pliek u ini mudah dikenal karena warna, bau dan rasanya yang khas (Nurliana, 2009). Secara singkat proses pembuatan

pliek u dapat dilihat pada Lampiran A. Menurut Nurliana (2009), pliek u masih mengandung lemak, walaupun kadar lemaknya lebih rendah dibandingkan kadar lemak dalam daging buah kelapa. Berdasarkan analisis proksimat, komposisi kimia yang terdapat pada pliek u terdiri dari air 18.97%, lemak 4.94%, protein 23.56%, karbohidrat 47.44%, serat kasar 15.72% dan total abu 8.34%.

2.2 Senyawa Antimikroba Pliek U

Berdasarkan penelitian Nurliana et al. (2002), diketahui bahwa ekstrak metanol pliek u

kering dan pliek u basah menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan empat strain enteropatogenik E. coli (EPEC) dengan aktivitas tergolong sedang dan sangat aktif berturut-turut yaitu 6.67 – 10.33 mm dan 6.00 – 7.33 mm. Selanjutnya Nurliana (2009) menyebutkan bahwa ekstrak kasar etanol pliek u berpotensi sangat aktif

sebagai senyawa antimikrob dalam menghambat beberapa strain bakteri seperti

B. subtilis, Stap. aureus, E. coli, Salmonella enteritidis, B. cereus, Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens dan khamir C. albicans.

Nurliana (2009) menyatakan bahwa, berdasarkan hasil uji GC-MS dapat diidentifikasi 22 komponen senyawa kimia dari ekstrak kasar etanol pliek u. Hampir sebagian besar senyawa yang terkandung dalam ekstrak kasar etanol adalah asam lemak dan derivatnya, seperti asam kaprat, asam laurat, asam mirisitat, asam palmitat, asam palmitoleat, asam stearat, asam oleat, asam linoleat, 7-10-13-asam heksadekatienoat, 9-12-15-asam oktadekatrienoat dan asam tetradekanedioat serta ester dan alkohol.

(27)

Nurliana juga menambahkan bahwa ekstrak kasar etanol (EEP) pliek u berpotensi sebagai senyawa antimikrob dengan konsentrasi hambatan minimal (MIC) EEP adalah 2.5 – 10 mg/ml dan konsentrasi mikrobisida (MMC) EEP adalah 10 – 20 mg/ml.

2.3 Bakteri Asam Laktat (BAL)

Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai sekelompok bakteri Gram positif batang dan kokus yang memproduksi asam laktat, yang memiliki berbagai karakteristik biokimia, fisiologis dan genetik yaitu bersifat anaerob fakultatif, katalase negatif, fermentatif, tidak membentuk spora (non-sporeforming), low mol % G + C, non-motile, dan toleran terhadap asam. Selain itu dalam hal memperoleh energi, BAL diklasifikasikan sebagai

heterotrophic chemoorganotrophs, yang berarti bahwa BAL membutuhkan karbon organik sebagai sumber karbon dan energinya (Hutkins, 2006).

Bakteri asam laktat sering digambarkan sebagai sekelompok bakteri yang tergolong rewel (fastidious), hal ini disebabkan karena persyaratan untuk pertumbuhannya harus memenuhi nutrisi yang kompleks. Ada spesies BAL tertentu yang dapat tumbuh hanya pada lingkungan yang kaya nutrisi, yaitu pada media yang diperkaya dengan kondisi optimal. Namun, ada juga spesies BAL yang cukup fleksibel sehubungan dengan lingkungan pertumbuhannya yang tetap dapat tumbuh cukup baik bahkan ketika komposisi nutrisinya kurang ideal. Selain itu, sebenarnya ada beberapa BAL yang dikenal mempunyai kemampuan untuk tumbuh pada lingkungan yang tidak ramah (inhospitable), termasuk yang sering dijumpai dalam makanan fermentasi. Hal ini menunjukkan bahwa BAL dapat tumbuh dan menempati berbagai macam habitat yang meliputi tidak hanya material tanaman, susu dan daging, tetapi juga garam (salt brines), makanan dengan pH rendah, maupun lingkungan yang mengandung etanol (Hutkins, 2006).

(28)

Karakteristik BAL yang paling relevan kemungkinan yang berkaitan dengan metabolisme nutrien. Secara khusus, alasan utama mengapa BAL digunakan dalam makanan yang difermentasi ialah karena kemampuannya untuk memetabolisme gula yang menghasilkan asam laktat dan produk akhir lainnya. Ada dua jalur fermentasi yang terjadi, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Pada jalur homofermentatif, lebih dari 90% substrat berupa gula diubah secara eksklusif menjadi asam laktat. Sebaliknya hasil dari jalur heterofermentatif menghasilkan sekitar 50% asam laktat, dan sisanya ialah asam asetat, etanol, dan karbon dioksida. Metabolisme BAL dapat terjadi melalui salah satu jalur, yaitu BAL yang bersifat homofermentatif atau obligat heterofermentatif, meskipun ada beberapa jenis BAL yang memiliki sarana metabolisme untuk melakukan keduanya (fakultatif homofermentatif) (Hutkins, 2006).

Spesies-spesies anggota BAL tidak bersifat patogen, hanya sedikit spesies saja yang dapat menyebabkan penyakit. BAL merupakan mikroba yang tergolong ke dalam

Generally Recognized as Safe status. Jenis-jenis BAL tergolong ke dalam genus

Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus,

dan Leuconostoc (Mozzi et al., 2010).

2.4 Peran BAL dalam Menghambat Mikroba Patogen

Menurut Ray dan Bhunia (2008), BAL berperan sebagai pengawet bahan pangan. Proses ini melibatkan penambahan sel bakteri BAL dalam jumlah besar seperti Lactococcus lactis, beberapa jenis Lactobacillus, dan beberapa spesies Pediococcus yang bersifat mesofilik untuk mengendalikan bakteri pembusuk dan patogen selama penyimpanan di dalam lemari es pada suhu 5 ºC atau di bawah 5 ºC. Pertumbuhan bakteri pembusuk dan patogen psikotrofik dilaporkan dapat dikendalikan dengan adanya BAL mesofilik tersebut. Pertumbuhan beberapa bakteri pembusuk dan patogen pada suhu yang sedikit lebih tinggi (10-12 °C) juga berkurang. Studi dilakukan dengan menambahkan BAL pada daging segar, seafood, telur, dan beberapa produk olahan daging seperti daging

(29)

asap untuk menghambat bakteri Clostridium botulinum, Salmonella serovars, dan Stap. aureus. Pada susu mentah, daging, telur dan makanan laut yang disimpan dalam lemari pendingin ditambahkan beberapa jenis BAL seperti Lactobacillus, Lactococcus, dan

Leuconostoc untuk mengontrol pertumbuhan dari bakteri pembusuk psikrofilik seperti

Pseudomonas spp. Pada beberapa penelitian dilaporkan bahwa pertumbuhan bakteri psikotrof dihambat oleh 90% atau lebih BAL selama 4 – 10 hari penyimpanan dalam lemari pendingin. Penambahan BAL dalam susu mentah juga meningkatkan produksi keju dan memperpanjang umur simpannya. Kemampuan penghambatan ini disebabkan pelepasan senyawa antimikroba intraseluler, seperti asam organik, bakteriosin dan hidrogen peroksida dari sel BAL.

Berdasarkan penelitian Petrova et al. (2009), BAL dari genus Lactobacillus

memiliki kemampuan potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen, termasuk isolat-isolat yang resisten terhadap antibiotik seperti Staphylococcus aureus

MRSA. Selanjutnya Muhialdin et al. (2012) menyebutkan bahwa, 3 isolat BAL yang terdiri dari L. fermentum Te007, P. pentosacues Te010, L. pentosus G004 yang diisolasi dari tempe, tempoyak, guava dan pisang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti B. subtilis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, E.coli,

Stap. aureus, S. epidermidis, Shigella sonnei, Klebsiella pneumonia, dan

S. tyhpimurium. Ketiga isolat BAL tersebut memiliki aktivitas penghambatan dengan spektrum yang bervariasi dari sedang hingga kuat. Isolat-isolat bakteri patogen tersebut resisten terhadap antibiotik vankomisin dan nalidixic acid.

(30)

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan Agustus 2013 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Biologi Universitas Sumatera Utara (USU) dan Laboratorium Biologi Balai Teknis Kesehatan Lingkungan dan Pemberantasan Penyakit Menular (BTKL dan PPM) Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah pliek u tahap I, II dan III yang sudah berumur 2 hari yang diperoleh dari industri rumah tangga yang berlokasi di Desa Geundering Kecamatan Darul Imarah, Aceh Besar. Pliek u tersebut dibuat melalui 3 tahapan berdasarkan penelitian Nurliana (2009), namun setiap tahapan masing-masing dilakukan selama 4 hari. Medium untuk isolasi, identifikasi, uji antagonis serta uji biokimia lainnya terdiri dari medium de man rogosa sharpe agar (MRSA), nutrient broth (NB), triple sugar iron agar (TSIA), sulfide indole motility (SIM) dan mueller hinton agar (MHA), melacyt green, media agar susu skim, media garam minimum kitin (MGMK), starch agar (SA). Komposisi dan cara pembuatan media MGMK dan susu skim dapat dilihat pada Lampiran C. Bahan untuk pewarnaan Gram ialah kristal violet, akuades, lugol, alkohol 95%, dan safranin. Kultur mikroorganisme uji yang digunakan ialah E. coli ATCC 25922, Staph. aureus ATCC 25923, dan isolat klinis C. albicans

(31)

acetate buffer pH 3.5, pH 4, pH 4.5, pH 5, pH 5,5, dan phosphate buffer pH 6, pH 6.5, pH 7, pH 7.5, dan pH 8. Pembuatan buffer dapat dilihat pada Lampiran D.

Alat-alat yang digunakan terdiri dari jarum ose, labu erlenmeyer, silinder ukur, gelas kimia, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung, pipet serologi (ukuran 0.1 ml, 1 ml, dan 10 ml), propipet, corong, kaca benda, bunsen, autoklaf (STURDY SA-300VF),

blank disc (OXOID), mikroskop (OLYMPUS), timbangan digital (OHAUS), lemari pendingin (DENPOO), oven (MEMMERT), BR-2000 vortexer (BIO-RAD), hot plate stirrer (LabTech), inkubator (LabTech) dan Laminar Air Flow (ESCO), cary 50 uv-visible spectrophotometer (VARIAN Inc.), mechanical hand counter, dan sentrifus (SORVALL Biofuge Primo R).

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini terbagi menjadi 7 tahapan, yaitu : (1) Pengukuran total asam pada sampel

pliek u tahap pemerosesan I, II, dan III, (2) Penghitungan populasi BAL dan non-BAL (3) Isolasi BAL dari pliek u tahap I, II, dan III (4) Uji antagonis BAL terhadap mikroorganisme patogen (5) Karakterisasi isolat bakteri potensial berdasarkan sifat morfologis, fisiologis dan biokimia (6) Identifikasi BAL sampai tingkat genus menggunakan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (7) Uji kualitatif enzim protease, amilase, dan kitinase. Diagram alir prosedur kerja dapat dilihat pada lampiran B.

3.3.1 Pengukuran Total Asam yang Diduga Asam Laktat

Pengukuran total asam dilakukan dengan metode Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C) (Akmar, 2006; Candra, 2006). Sebanyak 10 g sampel pliek u tahap I, II dan III dihancurkan dengan menggunakan mortar. Sampel yang telah homogen dilarutkan dengan akuades dalam gelas piala sampai tanda tera 100 ml. Setelah itu

(32)

sampel didiamkan selama 30 menit dan diaduk. Larutan yang berisi sampel tersebut disaring dan dipipet sebanyak 10 ml yang kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 2-3 tetes fenolftalein dan dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai warna berubah menjadi merah muda. Konsentrasi total asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat yang dihitung berdasarkan rumus:

% Total Asam = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% Bobot sampel x 1000

Keterangan :

V NaOH = Volume NaOH yang terpakai

N NaOH = Normalitas NaOH (0,1 N)

90 = Berat molekul asam laktat

FP = Faktor Pengenceran (10)

Bobot sampel = 10 g

3.3.2 Penghitungan Populasi BAL dan Non BAL

Penghitungan jumlah BAL dan non BAL dilakukan dengan metode cawan sebar (Lay,1994; Cappucino dan Sherman, 1999) dengan modifikasi. Dibuat pengenceran 10-1 sampai dengan 10-7 untuk sampel pliek u tahap III. Sebanyak 0.1 ml dari pengenceran 10-3 sampai 10-7 disebar ke dalam cawan petri, untuk BAL ditumbuhkan pada media MRSA dan untuk non BAL pada media PCA yang diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C. Dihitung koloni pada cawan yang mempunyai 30-300 koloni dengan menggunakan mechanical hand counter. Setelah itu dihitung jumlah sel mikroorganisme hidup dengan mengalikan faktor pengenceran dengan jumlah koloni yang dinyatakan dengan CFU/ml.

(33)

3.3.3 Isolasi BAL

Isolasi BAL dilakukan dengan metode cawan sebar, yaitu dengan mensuspensikan 1 g

pliek u ke dalam 9 ml NaCl fisiologis 0.85% secara aseptis, kemudian pengenceran 10-4 -10-7, diambil 0.1ml dan disebar ke cawan petri steril yang berisi media MRSA dengan dua kali ulangan. Setelah itu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37° C dan diamati pertumbuhan koloninya (Cappuccino dan Sherman, 1999) .

Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda diambil menggunakan jarum ose steril dan digoreskan pada MRSA padat dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 hari. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni yang seragam. Koloni yang telah murni dipilih berdasarkan sifat morfologi koloninya sebagai karakterisasi awal. Selanjutnya kultur dipindahkan ke dalam 1 tabung NB yang mengandung 0.2% agar dan CaCO3 untuk digunakan sebagai kultur stok, sedangkan

kultur kerja dibuat dalam agar miring yang disimpan dalam lemari es. Kultur stok diperbaharui setiap 3 bulan sekali.

3.3.4 Uji Antagonis BAL Terhadap Mikroorganisme Patogen

Isolat-isolat yang telah murni diujikan daya hambatnya terhadap mikroorganisme patogen secara in vitro. Pada uji ini lempengan agar MHA disemai dengan suspensi mikroorganisme yang akan diuji (E. coli ATCC 25922, Staph. aureus ATCC 25923, dan

C. albicans) dengan konsentrasi 108 sel/ml menggunakan cotton swab steril. Isolat yang sudah ditandai diinokulasi dengan cara ditotolkan menggunakan tusuk gigi steril pada medium MHA. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 72 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur zona bening menggunakan jangka sorong (Lay, 1994; dan Santoso, 2008).

(34)

3.3.5 Karakterisasi Isolat Potensial

Isolat-isolat yang memiliki daya hambat terhadap mikroba patogen selanjutnya dikarakterisasi sifat morfologis selnya dengan pewarnaan Gram (diamati bentuk dan penataan selnya) dan pewarnaan spora, uji fisiologis (pertumbuhan pada pH, suhu, dan toleransi terhadap konsentrasi NaCl yang berbeda), dan uji biokimia (uji katalase, motilitas, uji H2S, fermentasi gula dan pembentukan gas dari glukosa) (Wirawati, 2002;

Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007; Putri et al.2012).

3.4 Prosedur Analisis 3.4.1 Pewarnaan Gram

Suspensi bakteri diambil secara aseptis dan dibuat ulasan tipis di atas gelas benda yang sebelumya sudah ditetesi akuades dan dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan preparat ulas di atas api. Pada lapisan tipis tersebut ditetesi zat warna kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades selama 5 detik dengan cara menjepit gelas benda dengan pinset pada posisi miring. Sisa air yang tertinggal pada gelas benda dibuang dan ditetesi dengan lugol serta dibiarkan selama 1 menit, dicuci kembali dengan akuades selama 5 detik, kemudian dengan alkohol 95% dan dibiarkan selama 10 – 20 detik. Setelah itu dicuci kembali dengan akuades selama 5 detik dan ditetesi dengan zat warna safranin, dibiarkan selama 15 detik. Gelas benda dibilas dengan akuades selama 5 detik dan dikering anginkan. Preparat kemudian diamati di bawah mikroskop yang telah diolesi dengan minyak immersi. Melalui pengamatan secara mikroskopik ini, maka dapat ditentukan bentuk sel bakteri dan pengelompokannya. Bakteri Gram positif akan ditunjukkan dengan warna ungu dan bakteri Gram negatif akan ditandai dengan warna merah atau merah muda (Seeley dan VanDemark, 1962; Lay, 1994; Cappuccino dan Sherman, 1999).

(35)

3.4.2 Pewarnaan Spora

Pewarnaan spora dilakukan dengan membuat preparat ulas dari isolat berumur 72 jam. Dipanaskan preparat ulas yang sudah diberi zat warna hijau malakit, kemudian dilakukan pemanasan dengan menempatkan kertas saring di atas preparat ulas, diberi zat warna malakit hijau kemudian didinginkan selama 1 menit, dibuang kertas saring kemudian dicuci dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi dengan zat warna safranin selama 60 detik. Terakhir dilakukan pencucian preparat dengan air, dikeringkan, diamati di bawah mikroskop (Lay, 1994 dan Waluyo, 2010).

3.4.3 Uji Katalase

Satu loop isolat bakteri diambil secara aseptis dan dipindahkan pada gelas benda. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Adanya enzim katalase ditandai

dengan terbentuknya gelembung-gelembung seperti busa yang menandakan uji katalase positif, sebaliknya bila tidak terbentuk gelembung seperti busa, maka uji katalase negatif. Reaksi ini mengindikasikan ada tidaknya pembentukas gas CO2 (Wirawati,

2002; Morello et al., 2003).

3.4.4 Uji Motilitas

Pengujian motilitas bakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis dengan menggunakan jarum ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam media SIM. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 48 jam. Bila pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bersifat motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja (hanya tumbuh terbatas pada bekas tusukan jarum inokulasi), maka bakteri tersebut bersifat non motil (Lay, 1994; Morello

(36)

3.4.5 Uji Pembentukan H2S dan Fermentasi Gula

Pengujian ini menggunakan media triple sugar iron agar (TSIA). Uji tersebut bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa atau sukrosa dan pembentukan gas dari glukosa dan produksi H2S. Isolat yang akan diuji

diinokulasikan pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada media agar miring tersebut dan selanjutnya ditusukkan sampai ke bawah agar. Inkubasi pada suhu 37 °C selama 48 jam (Lay, 1994). Reaksi-reaksi yang terjadi pada media TSIA dapat dilihat pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Reaksi-reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA Bagian bawah agar Bagian atas agar

Keterangan

Reaksi Warna Reaksi Warna

Basa Asam Asam

Merah Kuning Kuning

- Basa Asam

Oranye Merah Kuning

Tidak memfermentasi glukosa Fermentasi glukosa Fermentasi laktosa atau sukrosa

Bagian bawah Bagian atas

Agar pecah/terangkat ke atas Agar berwarna hitam

- -

Produksi gas Produksi H2S

3.4.6 Pengaruh Suhu dan pH Terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih

Pengaruh suhu: isolat bakteri terpilih diinokulasikan pada tabung berisi media NB dan diinkubasikan pada suhu 10, 30, 45 dan 50°C selama 3 hari. Adanya pertumbuhan ditandai dengan kekeruhan pada tabung dan diukur optical density (OD) pada 600 dengan spektrofotometer (Lay, 1994; Wirawati, 2002 dengan modifikasi).

(37)

Pengaruh pH: sebanyak 1 ml kultur ditumbuhkan pada medium NB dengan penambahan acetate buffer pH 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, dan phosphate buffer pH 6, 6.5, 7, 7.5, 8, diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. Adanya pertumbuhan ditandai dengan kekeruhan pada tabung dan diukur optical density (OD) pada 600 dengan

spektrofotometer (Lay, 1994; Wirawati, 2002; Santoso, 2008 dengan modifikasi).

3.4.7 Pengaruh NaCl terhadap Pertumbuhan Isolat Terpilih

Toleransi isolat terpilih terhadap NaCl dilakukan dengan menotolkan isolat yang diperoleh pada media MRSA yang sudah ditambahkan NaCl dengan konsentrasi yang berbeda yaitu 2%, 4%, 6%, 6,5%, 8%, dan 10%. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam dan diamati pertumbuhannya dengan mengamati besar kecilnya koloni (Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007).

3.4.8 Uji Produksi Gas dari Glukosa

Pengujian ini dilakukan untuk membedakan antara BAL homofermentatif dan BAL heterofermentatif. Sebanyak 1 ml kultur BAL yang berumur 24 jam dipipetkan ke dalam tabung reaksi berisi tabung Durham dan media NB yang ditambahkan 2% glukosa. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 5 hari. Tabung Durham digunakan untuk melihat terbentuknya gas atau tidak. Tabung yang menghasilkan gas menunjukkan adanya produksi gas dari glukosa yang menandakan isolat tersebut bersifat heterofermentatif, tabung yang tidak terbentuk gas menandakan isolat bersifat homofermentatif (Bulut, 2003; Yavuzdurmaz, 2007).

3.5 Identifikasi Isolat yang Diduga BAL Sampai Tingkat Genus

Data yang telah diperoleh dari hasil pengujian karakterisasi, isolat bakteri selanjutnya diidentifikasi dengan menduga jenis BAL yang telah diisolasi dari pliek u.

(38)

Pendugaan jenis bakteri dilakukan dengan menggunakan metode profile matching

berdasarkan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Vos, 2009 dan Helen, 2012).

3.6 Uji Kualitatif Aktivitas Protease, Amilase dan Kitinase

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas proteolitik, amilolitik, dan kitinolitik dari isolat yang diperoleh. Analisis hidrolisis protein, amilum, dan kitin dilakukan dengan menumbuhkan isolat yang diperoleh pada medium susu skim (Lay, 1994; Smita et al., 2012), SA (Putri et al. 2012), dan MGMK (Dewi, 2008). Selanjutnya diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Isolat-isolat yang menghasilkan protease, amilase dan kitinase akan menunjukkan zona bening pada masing-masing permukaan media. Diameter zona bening yang terbentuk diukur untuk melihat besarnya aktivitas enzim tersebut secara kualitatif.

3.7 Pengukuran Total Asam Supernatan Isolat BAL Terpilih

Isolat yang telah disegarkan pada media MRSA kemudian diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam media NB sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi pada suhu 37°C pada shaker water bath selama 18 jam. Sebanyak 10% inokulum dimasukkan ke dalam media produksi dengan volume kerja 100 ml, kemudian diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37° C selama 24 jam. Pemanenan supernatan dilakukan dengan cara sentrifugasi media kultivasi pada suhu 4° C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisah dari biomassa untuk diukur total asam yang dinyatakan sebagai persen asam laktat (AOAC, 1995; Purnama, 2009; Mardiana, 2010; Nielsen, 2010; Omemu et al., 2011; Saputra, 2011 dengan Modifikasi).

Pengukuran total asam tertitrasi merupakan penentuan konsentrasi total asam. Pada supernatan, asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat. Pengukuran asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan

(39)

ke dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 3 tetes indikator phenolphtalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda yang merupakan titik akhir titrasi. Volume titran yang digunakan, normalitas basa standar, volume contoh digunakan untuk menghitung total asam tertitrasi. Perhitungan total asam tertitrasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

Total Asam (%) = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% V sampel x 1000

Keterangan :

V NaOH = Volume NaOH yang terpakai (ml) N NaOH = Normalitas NaOH (0,1 N)

90 = Berat molekul asam laktat

FP = Faktor pengenceran

(40)

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Persentase Total Asam pada Bahan Pangan Pliek U

Sebelum dilakukan tahapan isolasi, setiap sampel pliek u tahap I, II, dan III diukur total asam yang diduga sebagai asam laktat. Dari hasil pengukuran diketahui bahwa setiap tahapan dari proses pembuatan pliek u menghasilkan persentase total asam yang berbeda. Berdasarkan Gambar 4.1 dapat dilihat kadar asam tertinggi berasal dari pliek u

tahap III yaitu sebesar 4,92%, sedangkan yang terendah ialah pada pliek u tahap I yaitu sebesar 1,07%. Hal ini dapat dihubungkan dengan adanya perbedaan jenis dan jumlah BAL yang ditemukan di setiap tahapan pengolahan pliek u, sehingga kadar asam yang dihasilkan juga bervariasi.

0 1 2 3 4 5 6

asam

(%)

PT1 PT2 PT3

Gambar 4.1 Persentase total asam pada tiga tahapan pengolahan pliek u (PT1: pliek u tahap I, PT2: pliek u tahap II, PT3: pliek u tahap III)

(41)

Telah diketahui bahwa pliek u diolah dari daging buah kelapa (C. nucifera) yang terfermentasi secara spontan, dan daging kelapa tersebut tersusun oleh berbagai jenis komponen, salah satunya ialah karbohidrat. Sumber karbohidrat tersebut akan diuraikan oleh BAL menjadi senyawa-senyawa lain menjadi produk yang berbeda dari bahan bakunya. Menurut Fardiaz (1992), karbohidrat merupakan substrat utama yang dipecah dalam proses fermentasi. Polisakarida terlebih dahulu akan diurai menjadi gula sederhana sebelum difermentasi, sebagai contoh hidrolisis pati menjadi unit-unit glukosa. Glukosa selanjutnya akan diurai menjadi senyawa-senyawa lain. Pada BAL, asam piruvat yang yang terbentuk dari jalur glikolisis bertindak sebagai penerima hidrogen, dimana reduksi asam piruvat oleh NADH2 menghasilkan asam laktat.

Fermentasi ini disebut fermentasi homolaktat, karena satu-satunya produk yang dihasilkan ialah asam laktat dan BAL yang berperan dalam fermentasi tipe ini dikenal dengan BAL homofermentatif.

4.2 Isolasi BAL dari Pliek U

Sebanyak 8 isolat yang diduga BAL telah diisolasi dari sampel pliek u tahap I, II, dan III. Kedelapan isolat yang berbeda tersebut yaitu NSP1, MY2, MY3, NQ2, NQ3, NQ4, NQ5, dan NQ6, masing-masing isolat mempunyai profil yang beragam. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap sifat morfologi koloni dapat diketahui bahwa dari sampel

pliek u tahap I, dimulai dari pemupukan ke media MRSA yang berasal dari pengenceran 10-3 sampai dengan pengenceran 10-7 keseluruhannya hanya ditumbuhi oleh isolat NSP1. Isolat tersebut memiliki ciri-ciri koloni berbentuk bulat, berwarna putih susu dengan tepi halus dan elevasi konveks.

Pada pliek u tahap II, ditemukan 3 koloni yang berbeda yaitu MY1, MY2, dan MY3. MY1 mempunyai ciri-ciri morfologis yang sama dengan NSP1, sedangkan MY2 dan MY3 berbeda. Pada pliek u tahap III, diperoleh 6 koloni yang berbeda yaitu NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, NQ5, dan NQ6. Pada tahap ini ditemukan satu koloni yang sama dengan MY2 yaitu NQ1. Adanya koloni yang berbeda ini diduga karena proses

(42)

pengolahan daging buah kelapa menjadi pliek u yang berbeda di setiap tahapnya (Lampiran A) sehingga menyebabkan ditemukannya ciri-ciri koloni bakteri yang berbeda. Keseluruhan sifat-sifat morfologis dari setiap isolat disajikan pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Karakteristik morfologi koloni bakteri yang diduga BAL Tahapan

Pengolahan

Pliek u

Kode Isolat

Sifat Morfologi Koloni

Bentuk Warna Tepi Elevasi Keterangan

I NSP1 bulat putih

susu

halus konveks -

II NSP1 bulat putih

susu

halus konveks isolat sama

dengan NSP1

MY2 tidak

beraturan

Krem lobat umbonat -

MY3 tidak

beraturan

Krem bergelombang datar -

III NQ1 tidak

beraturan

Krem lobat umbonat isolat sama

dengan MY2

NQ2 tidak

beraturan

Krem bergelombang umbonat -

NQ3 tidak

beraturan

krem bergelombang datar -

NQ4 tidak

beraturan

Krem bergelombang tumbuh ke

dalam media

NQ5 tidak

beraturan

Krem lobat datar -

NQ6 tidak

beraturan

Krem filamen umbonat -

Menurut Wirawati (2002), pada fermentasi bahan pangan tradisional yang berlangsung secara spontan, mikroorganisme yang secara alami ada di dalam bahan pangan akan tumbuh dan mengakibatkan suksesi atau pergantian mikroba yang

(43)

dominan pada proses selanjutnya. Fardiaz (1992) juga menambahkan bahwa populasi mikroba yang ditemukan pada setiap makanan, bila diamati jumlah dan jenisnya, sangat bervariasi. Hal ini disebabkan karena adanya pengaruh selektif terhadap jumlah dan jenis mikroba awal yang terdapat pada makanan. Sumber-sumber mikrobiota yang terdapat pada makanan dapat berasal dari tanah, air permukaan, debu, kotoran hewan atau manusia, lingkungan, udara dan sebagainya. Berbagai pengaruh selektif menyebabkan satu atau beberapa jenis mikroba mungkin menjadi dominan dibandingkan dengan jenis mikroba lainnya.

4.3 Seleksi Isolat Potensial Berdasarkan Uji In vitro

Diantara 8 isolat yang telah diisolasi, hanya 5 isolat yang memiliki kemampuan menghambat bakteri patogen E. coli ATCC 25922 dan Staph. aureus ATCC 25923, namun tidak dapat menghambat C. albicans. 5 isolat tersebut yaitu NQ1, NQ2, NQ3, NQ4 dan NQ5. Penghambatan tersebut diduga disebabkan karena adanya aktivitas antimikroba yang dihasilkan oleh 5 isolat tersebut.

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

E. coli ATCC 25922 Staph. aureus ATCC 25923

mat

amb

(

)

NQ1 NQ2 NQ3 NQ4 NQ5

Gambar 4.2 Diameter zona hambat (mm) 5 isolat BAL terpilih terhadap E. coli ATCC 25922 dan Staph. aureus ATCC 25923

(44)

Diameter zona hambat yang dibentuk oleh 5 isolat terhadap E. coli ATCC 25922 bervariasi (Gambar 4.1) yaitu 1,5 mm hingga 8,5 mm, sedangkan untuk patogen Staph. aureus ATCC 25923 juga bervariasi dari 1,2 mm hingga 4 mm. Penghambatan tertinggi terhadap E. coli dan Staph. aureus berturut-turut ditunjukkan oleh isolat NQ2 yaitu sebesar 8,5 mm dan 4 mm. Penghambatan terendah ditunjukkan oleh isolat NQ3 dan NQ4, masing-masing sebesar 1,5 mm dan 1,2 mm.

Adanya aktivitas antimikroba dapat diketahui dengan timbulnya zona bening di sekitar koloni isolat-isolat BAL setelah diinkubasi selama 24-48 jam pada uji antagonis (Gambar 4.2). Terbentuknya zona bening menyebabkan bakteri E. coli dan Staph. aureus tidak dapat tumbuh. Hal tersebut mengindikasikan bahwa senyawa asam ataupun komponen metabolit dari isolat NQ1 sampai NQ5 menghambat pertumbuhan bakteri uji tersebut. Penghambatan yang ditunjukkan oleh 5 isolat BAL tersebut diduga disebabkan terjadinya perubahan pH medium karena dihasilkannya asam-asam organik selama fermentasi. Menurut Salminen et al. (2007), fermentasi oleh BAL mengurangi jumlah karbohidrat yang tersedia dan menghasilkan komponen organik dengan bobot molekul rendah yang menunjukkan aktivitas antimikroba.

Penelitian yang dilakukan oleh Trimulyono et al., (2011) menyebutkan bahwa kultur sel dan supernatan BAL mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. coli ATCC 35218 dan Staph. aureus ATCC 25923. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa isolat yang diperoleh tidak memproduksi bakteriosin, namun mampu menghambat bakteri uji sehingga diduga antimikroba yang berperan ialah asam organik yang dihasilkan oleh isolat-isolat yang diperoleh. Bakteri uji yang digunakan merupakan bakteri yang tidak tahan asam sehingga produksi asam organik yang tinggi dari isolat BAL mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji. Produksi asam organik yang tinggi didukung oleh hasil titrasi asam yang menunjukkan bahwa asam tertitrasi masing-masing isolat di atas 90%. Namun demikian, senyawa antimikroba lain juga ikut berperan dalam efek antimikroba yang terjadi karena senyawa antimikroba yang

(45)

dihasilkan oleh BAL saling bersinergi dalam memberikan efek antimikroba yang hingga kini belum diketahui mekanismenya secara pasti. Penelitian lain yang dilakukan oleh Mansilla (2008) juga melaporkan bahwa BAL yang diisolasi dari berbagai macam buah dan sayur dapat menghambat pertumbuhan berbagai mikroorganisme patogen. Komponen antimikroba yang terdeteksi dari isolat-isolat yang diperoleh ialah asam organik, hidrogen peroksida dan bakteriosin yang berperan utama dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji.

Gambar 4.3 Uji in vitro 5 isolat terpilih terhadap E. coli ATCC 25922 (A, B, C) dan Staph.

aureus ATCC 25923 (D, E, F)

De Vuyst dan Vandamme (1994) menyatakan asam laktat merupakan salah satu senyawa inhibitor yang dihasilkan BAL dan merupakan produk akhir utama dari katabolisme karbohidrat, karena dari proses konversi sumber karbon ini dihasilkan setidaknya 50% asam laktat, sehingga kelompok bakteri ini dinamakan bakteri asam laktat. Asam yang dihasilkan selama proses metabolisme oleh BAL akan menyebabkan

NQ2

A B C

D _E F

NQ1

NQ4

NQ4 NQ3

NQ3

NQ5 _NQ5

NQ5 NQ5

NQ1 NQ2

NQ2

NQ1 _NQ3

NQ3 NQ4

(46)

penurunan pH dan menyebabkan mikroba patogen maupun perusak bahan pangan yang umumnya tidak tahan suasana asam akan terhambat. Akumulasi produk akhir asam mengakibatkan turunnya pH dan akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Aktivitas asam-asam lipofilik seperti asam laktat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba, dan pada pH intraseluler yang lebih tinggi, berdisosiasi menghasilkan ion-ion hidrogen dan mengganggu fungsi metabolit esensial, translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif sehingga mereduksi pH intraseluler.

Selain itu mekanisme penghambatan lain terhadap mikroba uji diantaranya ialah penghambatan terhadap sintesis dinding sel. Komposisi dinding sel dari ketiga mikroba yang diujikan berbeda sehingga menyebabkan sensitivitas yang berbeda pula.

S.aureus merupakan bakteri Gram positif yang dinding selnya tersusun oleh beberapa komponen seperti peptidoglikan yang tebal, asam teikoat, protein dan polisakarida. E. coli merupakan bakteri Gram negatif yang mempunyai komponen dinding sel peptidoglikan yang lebih tipis dibandingkan dengan bakteri Gram positif tetapi bakteri Gram negatif mempunyai dua membran yaitu membran luar dan membran dalam, membran luar tidak terdapat pada bakteri Gram positif. Membran luar bakteri Gram negatif mengandung protein, lipid, lipoprotein dan lipopolisakarida (Jawetz et al., 2005; Madigan et al., 2012). Garraway dan Evans, 1984; Griffin, 1994 menyatakan bahwa dinding sel C. albicans terdiri dari kitin, selulosa, β-glukan, mannan, khitosan, protein, lemak dan ion anorganik. Senyawa antimikroba yang dapat menghambat biosintesis dinding sel fungi pada umumnya menghambat biosintesis kitin.

Senyawa antimikroba juga dapat merusak membran sel dengan mendenaturasi protein serta lemak yang menyusun memban sel mikroba, sehingga mengganggu pertukaran zat yang dibutuhkan oleh mikroba tersebut. Sitoplasma semua sel hidup dibatasi oleh membran sitoplasma yang berperan sebagai barir permeabilitas selektif, membawa fungsi transpor aktif, dan kemudian mengontrol komposisi internal sel. Jika

(47)

fungsi integritas membran sitoplasma dirusak, makromolekul dan ion keluar dari sel yang menyebabkan kerusakan pada sel. Membran sel pada fungi dan bakteri mempunyai struktrur yang berbeda, membran sel pada fungi mengandung sterol sedangkan bakteri tidak. Jadi antimikroba yang dapat berikatan dengan sterol yang akan mampu merusak membran sel fungi (Jawetz et al., 2005). Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa kedelapan isolat BAL yang diujikan tidak mampu menghambat C. albicans yang dapat disebabkan oleh tidak adanya senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan oleh isolat-isolat tersebut yang dapat berikatan dengan komponen penyusun dinding maupun membran sel fungi tersebut.

Penelitian yang dilakukan oleh Kariptas et al., (2010) dan Lertcanawanichakul (2005) juga menunjukkan rendahnya aktivitas antifungal dari BAL terhadap C. albicans, bahkan tidak ada sama sekali. Hal tersebut diduga karena C. albicans yang diisolasi dari manusia lebih resisten terhadap zat antimikroba karena pemakaian obat antifungal.

4.4 Karakterisasi Morfologi, Biokimia dan Fisiologi Sel Isolat Terpilih

Isolat-isolat yang menunjukkan zona penghambatan terhadap bakteri patogen kemudian dikarakterisasi lebih lanjut untuk mengetahui sifat morfologi, biokimia dan fisiologi selnya. Ada 5 isolat yang telah diamati yaitu NQ1, NQ2, NQ3, NQ4, dan NQ5. Pemeriksaan diawali dengan pewarnaan Gram yang selanjutnya diamati di bawah mikroskop cahaya pembesaran 1000x. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kelima isolat tersebut berbentuk basil Gram positif (Gambar 4.4).

(48)

Gambar 4.4 Pewarnaan Gram isolat BAL terpilih

Pewarnaan Gram dilakukan terhadap isolat yang berumur 20 jam. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kelima isolat tersebut berbentuk basil, namun dapat dilihat masing-masing isolat mempunyai perbedaan dari segi ukuran dan penataan selnya. Isolat NQ1 merupakan basil pendek (kokobasil) yang tidak berpasangan atau membentuk rantai, basil ini dikenal dengan monobasil, sedangkan isolat NQ2 terlihat berpasangan dan ukurannya lebih besar daripada isolat NQ1. Isolat NQ3 terlihat lebih panjang dan ramping juga ada yang terlihat berpasangan (diplobasil), sedangkan isolat NQ4 merupakan basil pendek yang menyerupai rantai (streptobasil). Isolat NQ5 terlihat bergerombol dan ada yang membentuk rantai.

Menurut Waluyo (2010), pewarnaan Gram merupakan slah satu prosedur yang penting dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan Gram merupakan tahapan yang penting dalam identifikasi bakteri dan termasuk ke

NQ1 NQ2 NQ3

(49)

dalam pewarnaan diferensial. Prescott, (2002) menambahkan bahwa, pewarnaan Gram dapat membedakan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur, terutama komponen penyusun dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut. Bakteri Gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks warna kristal violet-iodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut sewaktu pencucian dengan aseton alkohol dan kemudian menyerap zat warna kedua yang berwarna merah.

Kriteria selanjutnya ialah pewarnaan spora. Hasil pengamatan menunjukkan kelima isolat membentuk spora dengan letak yang bervariasi, diantaranya yaitu oval subterminal dan oval sentral atau oval memanjang (Gambar 4.5). Menurut Lay (1994) dan Waluyo (2005), spora mempunyai bentuk yang beragam, ada yang bulat dan ada juga yang bulat memanjang bergantung pada spesiesnya. Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang kurang menguntungkan. Spora terbentuk di dalam sel bakteri sehingga sering disebut sebagai endospora dan hanya terdapat 1 spora saja. Endospora ada yang lebih kecil dan ada juga yang lebih besar daripada diameter sel induknya. Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sulit diwarnai. Oleh sebab itu sel bakteri harus dipanaskan, karena pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang dan menyebabkan zat warna masuk.

(50)

Gambar 4.5 Pewarnaan spora isolat BAL terpilih

Isolat-isolat tersebut selanjutnya diuji aktivitas katalasenya dengan meneteskan larutan H2O2 3% pada masing-masing isolat. Hasil pengamatan menunjukkan hasil

positif dengan terbentuknya gelembung udara. Lay (1994) menyatakan bahwa, katalase merupakan suatu enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini

menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut.

NQ1 NQ2 NQ3

(51)

Kriteria yang diamati selanjutnya ialah motilitas dan reaksi pada media TSIA. Hasil menunjukkan bahwa kelima isolat bersifat motil, hal ini ditunjukkan adanya pertumbuhan di sekitar tusukan ose dan permukaan media SIM. Reaksi yang terlihat pada media TSIA ialah bagian butt berwarna kuning dan bagian slant berwarna merah, tidak adanya terbentuk gas maupun H2S. Hal ini mengindikasikan bahwa hanya glukosa

yang dapat difermentasikan oleh kelima isolat tersebu dan tidak memfermentasikan laktosa maupun sukrosa. Menurut Lay (1994), komposisi media TSIA diantaranya ialah 3 jenis gula yang berbeda yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Bila slant berwarna merah berarti bersifat basa dan butt berwarna kuning berarti bersifat asam. Selain itu hasil uji terhadap kelima isolat menunjukkan bahwa pada medium TSIA tidak terbentuk endapan berwarna hitam di bagian bawah tabung. Hal ini berarti, semua isolat bakteri tersebut tidak mempunyai enzim desulfurase yang berfungsi untuk memecah sistin dan tidak menghasilkan H2S, sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri yang terdapat pada

produk pliek u tidak mampu menggunakan asam amino sistin sebagai sumber energinya. Kemampuan 5 isolat terpilih menghasilkan asam (yang diduga asam laktat) dengan memfermentasikan glukosa menunjukkan bahwa bakteri-bakteri yang diisolasi dari pliek u tergolong ke dalam BAL homofermentatif. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya pembentukan gas CO2 pada tabung Durham dari fermentasi glukosa pada

pengujian produksi gas dari glukosa. Wirawati (2002); Yavuzdurmaz (2007); Jay et al. (2005) menyatakan bahwa, BAL dibagi menjadi dua grup berdasarkan hasil akhir metabolisme glukosa. BAL yang hanya menghasilkan asam laktat pada fermentasi glukosa termasuk dalam golongan homofermentatif. BAL yang menghasilkan asam laktat, CO2 dan etanol dari heksosa termasuk dalam golongan heterofermentatif. BAL

yang tergolong homofermentatif dapat mengubah 95% glukosa atau heksosa lainnya menjadi asam laktat. Karbondioksida dan asam-asam volatil lainnya juga dihasilkan, namun dalam jumlah yang sangat kecil.

(52)

Pengujian pertumbuhan 5 isolat BAL terpilih pada suhu dan toleransi pada pH, serta MRSA + konsentrasi NaCl yang berbeda telah dilakukan. Pengamatan dilakukan selama 3 hari. Hasil pengamatan menunjukkan kelima isolat mampu tumbuh pada suhu 30, 40 dan 50°C, namun tidak mampu tumbuh pada suhu 10°C. Selain itu kelima isolat juga mampu bertahan pada kisaran pH 3,5 sampai 8 dan memiliki toleransi terhadap NaCl 2% sampai 10%. Kriteria pendukung lainnya ialah kelima isolat mempunyai aktivitas amilolitik, proteolitik, dan kitinolitik yang ditandai dengan terbentuknya zona bening pada permukaan medium SA, susu skim dan MGMK. Keseluruhan data karaktersitik kelima isolat dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Berdasarkan pengamatan sifat morfologi, biokimia, dan fisiologinya serta uraian di atas dapat diketahui bahwa BAL yang sudah diisolasi dari sampel pliek u bukan merupakan kelompok BAL pada umumnya. Hal ini dapat dilihat dari adanya perbedaan maupun kesamaan karakteristik antara BAL yang sudah diisolasi dari pliek u dengan BAL yang pernah diteliti sebelumnya. Kelima isolat yang diperoleh dari pliek u, selnya berbentuk basil Gram positif dengan katalase positif, bersifat motil, dan membentuk endospora. Berdasarkan ciri dan karaktersitik yang telah diamati kelima isolat tersebut termasuk ke dalam genus Bacillus.

(53)

Tabel 4.2 Karakteristik morfologi dan fisiologi sel isolat terpilih

Karakteristik Isolat

NQ1 NQ2 NQ3 NQ4 NQ5

Sifat morfologi sel

Bentuk Basil Basil Basil Basil Basil

Gram + + + + +

Endospora + + + + +

Sifat biokimia dan fisiologi sel

Katalase + + + + +

Motilitas TSIA :

Slant Butt

Gas H2S

Pembentukan asam Tipe Fermentasi Fermentasi Karbohidrat + M K - - + Homofer Glu + M K - - + Homofer Glu + M K - - + Homofer Glu + M K - - + Homofer Glu + M K - - + Homofer Glu

Pertumbuhan pada suhu :

10°C 30°C 45°C 50C - + + + - + + + - + + + - + + + - + + +

Pertumbuhan pada MRSA + NaCl :

2% 4% 6% 6,5% 8% 10% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Pertumbuhan pada pH :

3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Produksi Enzim :

Amilase Protease Kitinase + + + + + + + + + + + + + + + Keterangan:M : merah, K : kuning, Homofer : homofermentatif, Glu : glukosa

(1)

Trimulyono, G., L. Sembiring, E.S. Rahayu. 2011. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat penghasil antimikrobia pada tanaman sayur. Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus. P. 51-57.

Utami, L.S., S. Syukur, dan Jamsari. 2012. Isolasi bakteri probiotik penghasil protease dan laktase dari fermentasi kakao varietas hijau. Chem. Prog. 5 (2): 109-114. Vecchi, E.D. dan L. Drago. 2006. Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans;

Misidentification or mislabelling? Int. J. of Probiotics and Prebiotics. 1 (1):3-10. Vos, P.D., G.M. Garrity, D.J.N.R. Krieg, W. Ludwig, F.A. Rainey, K-H. Schleifer dan

W.B. Whitman. 2009. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Second Edition, Vol. 3. London, Springer.

Vuyst, L.D dan F. Leroy. 2007. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 13 (4):194-199. Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi umum. Malang, UMM Press.

. 2010. Teknik dan metode dasar dalam mikrobiologi. Malang, UMM Press. Widodo, R. 2001. Mempelajari daya absorpsi khitin terhadap bakteri Escherichia coli.

Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Bogor, IPB.

Wikandari, P.R., Suparmo, Y. Marsono, dan E.S. Rahayu. 2012. Karakterisasi bakteri asam laktat proteolitik pada bekasam. J. Natur Indonesia. 14 (2): 120-125.

Wirawati, C.U. 2002. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari tempoyak sebagai probiotik. Tesis. Bogor, IPB.

Yavuzdurmaz, H. 2007. Isolation, characterization, determination of probiotic properties of lactic acid bacteria from human milk. Master Thesis. Izmir, Turkey, Izmir Institute of Technology.

(2)

Lampiran A. Diagram Proses Pembuatan Pliek u (Nurliana, 2009)

Dibelah (kelapa tetap utuh)

Difermentasi (4 – 5 hari) pada suhu kamar (29 –

36°C)

Airnya dibuang Kelapa

Tahap I

Daging buah dikukur

Difermentasi (4 – 5 hari) pada suhu kamar (29 – 36°C) tanpa terpapar sinar

matahari

Minyeuk simpah

(diambil setiap hari)

Ampas tanpa minyeuk simplah (warna

keabu-abuan)

Fermentasi dan penjemuran (terbuka). Pengepresan dilakukan setelah minyak terlihat keluar. (Proses ini

berlangsung ≥ 5 hari)

Minyeuk brok

(diambil setiap hari) Tahap II

(3)

Lampiran B. Diagram Alir Prosedur Penelitian

Isolasi BAL dari pliek u tahap I, II, III Pengukuran total asam pliek u

Penghitungan populasi BAL dan non-BAL

Uji antagonis BAL terhadap mikroorganisme patogen

E. coli ATCC 25922 Staph. aureus ATCC C. albicans

Isolat potensial

Karakterisasi isolat bakteri terpilih

Sifat morfologis sel

Pewarnaan Gram (diamati bentuk dan pengelompokannya)

Sifat fisiologis

Pertumbuhan pada pH, suhu yang berbeda dan toleransi terhadap konsentrasi NaCl yang

berbeda

Sifatbiokimia

Uji katalase, uji motilitas, uji H2S, fermentasi gula

dan pembentukan gas dari glukosa

Uji kualitatif enzim protease, amilase, dan kitinase Identifikasi BAL sampai tingkat

genus menggunakan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology

(4)

Lampiran C. Komposisi Media Susu Skim dan Media Garam Minimum Kitin (MGMK)

1. Media susu skim

Media agar susu skim (pH 6,5) mengandung 20 g susu skim dan 24 g agar per liter. 20 g susu skim dilarutkan dalam 400 ml aquadest kemudian dipasteurisasi (70oC selama 1 jam). 24 g agar ditambah 600 ml aquadest, disterilkan dan dicampur dengan larutan susu pada waktu masih panas.

2. Medium MGMK

 K2HPO4 0,7 g

 KH2PO4 0,3 g

 MgSO4.7H2O 0,5 g

 FeSO4.7H2O 0,01 g

 ZnSO4 0,001 g

 MnCl2 0,001 g

 Koloidal kitin 12,5% (b/v) 72,7 ml

 Agar 20 g

 pH 6,8

Cara Pembuatan:

Semua bahan dicampur dan ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi satu liter. Diatur pH sampai 6,8 dengan menambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1N. Setelah dicapai pH yang diinginkan, medium disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.

(5)

Lampiran D. Pembuatan pH Buffer

1. Acetate Buffer pH 3,5