Bahan Tanaman, Reagen, dan Sel yang digunakan

Bahan dan asam kojik sigma, USA sebagai kontrol positif dilakukan uji pada rentang konsentrasi 7,8125 hingga 2.000 µg mL -1 . Pada 96-sumur pelat, setiap 70 µL sediaan larutan ditambahkan dengan 30 µL enzim tirosinase sigma, 333 Units mL -1 dalam phosphate buffer dalam triplicate, kemudian dilakukan inkubasi pada suhu ruangan selama lima menit. Selanjutnya ditambahakan 110 µL substrat 2 mM L-tyrosine atau 2 mM L-DOPA ke dalam setiap sumur, dan diinkubasi kembali selama 30 menit pada temperatur ruangan. Densitas optikal sumur diukur pada panjang gelombang 492 nm dengan multi-well plate reader. Konsentrasi ekstrak etanol 96 daun nangka muda, mature serta fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat daun nangka muda pada inhibition concentration IC 50 ditentukan untuk setiap bahan uji. 3.6. Persiapan Uji pada Kultur Mouse Melanoma B-16 Cell Penelitian kultur mouse melanoma B-16 cell dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata IPB. Pada sel yang telah tumbuh konfluen harus dilakukan subkultur. Media sel dibuang kemudian ditambahkan PBS sebanyak 10 mL untuk membersihkan botol kultur dari sisa media, lalu PBS dibuang. Trypsin 0.25 ditambahkan ke dalam botol kultur sebanyak 5 mL, dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 5 menit. Sel yang telah lepas dari substratnya dimasukkan ke dalam tabung 15 mL kemudian disentrifus 500g selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Perhitungan sel menggunakan hemositometer kemudian disiapkan sel sesuai dengan kepentingan untuk uji. Sel diinkubasi kembali di dalam inkubator CO 2 dengan konsentrasi 5. 3.7. Uji Micro Culture Tetrazolium Technique MTT Sel lestari yang telah ditumbuhkan pada botol kultur T 25 disubkultur. Kultur dimulai dalam pelat 96 sumur kultur jaringan dengan 5000 selsumur. Inkubasi pelat dilakukan di kelembaban atmosfer 5 CO 2 pada suhu 37 C selama 24 jam. Senyawa bioaktif pada masing-masing konsentrasi ditambahkan sebanyak 100µLsumur, sel tanpa perlakuan disertakan sebagai kontrol. Sel selanjutnya diinkubasi kembali selama 48 jam. Senyawa MTT ditambahkan dan diinkubasi selama empat jam pada suhu 37 o C dan CO 2 5. Supernatan sel dibuang, kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan etanol 70. Pembacaan densitas optik OD dilakukan menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 565 nm. Dosis perlakuan yang digunakan pada uji MTT dimulai dari dosis 800 ppm yang diturunkan hingga dosis 6,25 ppm. 3.8. Aktivitas Inhibisi Biosintesis Melanin oleh Isolat dalam Kultur Mouse Melanoma B-16 Cell Kultur konfluen melanoma B-16 cell dibilas dalam phosphate-buffered saline PBS dan dilepaskan dari plastik menggunakan trypsin 0.25. Sel diletakkan dalam pelat enam sumur pada densitas 1×10 5 selsumur dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam media diganti dengan 900 μl media baru dan 2 μl DMSO digunakan sebagai kontrol serta sampel uji dengan konsentrasi 3, 1,5, dan 0,75 ppm. Sel diinkubasi kembali selama 48 jam, dan media diganti dengan media baru yang mengandung masing-masing sampel. Setelah 24 jam, pada sel yang masih melekat dilakukan uji.