Desain penelitian Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Uji Sampel penelitian Definisi Operasional Tabel 3.1 Definisi Operasional Managemen Data

22

BAB III Metode Penelitian

3.1 Desain penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental deskriptif analitik untuk melihat pengaruh ekstrak daun Anredera cordifolia Tenore steenis terhadap re- epitelisasi epidermis pada kasus luka bakar.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Januari-Agustus 2014. Penelitian ini dilakukan di laboratorium farmakologi, laboratorium histologi dan laboratorium animal house Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan.

3.3 Bahan Uji

Daun Anredera cordifolia Tenore steenis didapatkan dari toko tanaman obat herbal binahong Jakarta sebanyak 4 Kg daun basah . Alamat jalan Palmerah Utara 2 Jakarta Barat Indonesia yang dijadikan ekstrak dengan metode maserasi di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat BALITTRO, kemudian dijadikan sediaan salep.

3.4 Populasi dan Besar Sampel Percobaan

Pada penelitian ini hewan percobaan yang digunakan sebagai objek penelitian adalah tikus jantan jenis Sparague dawley umur 2-3 bulan yang didapatkan dari Departemen Patologi Institut Pertanian bogor disertai surat keterangan sehat dari Rumah Sakit Hewan Institut Pertanian Bogor IPB. Hewan pecobaan dibagi kedalam lima kelompok. Yaitu kelompok I hewan uji diterapi salep dengan konsentrasi ekstrak 10, kelompok II hewan uji diterapi salep dengan konsentrasi ekstrak 20, kelompok III hewan uji diterapi salep dengan konsentrasi ekstrak 40 kelompok IV kontrol positif dan kelompok V kontrol negatif. Kelompok kontrol negatif adalah tikus normal dengan luka bakar diberikan basis salep. Kelompok kontrol positif adalah tikus yang normal dengan luka bakar diberikan terapi Silver Sulfatiazine. Jumlah sampel hewan percobaan pada penelitian ini diambil dari perhitungan rumus Federer sebagai berikut: Dari perhitungan rumus Federer didapatkan jumlah sampel 5 tikus untuk setiap kelompok. 25

3.4.1 Kriteria Inklusi

Tikus Sprague dawley sehat, jantan, usia 2-3 bulan dan berat 300-400 gram.

3.4.2 Kriteria Eksklusi

Tikus Sprague dawley yang mempunyai kecacatan pada kulit punggung

3.5 Sampel penelitian

Pertumbuhan epitel epidermis dalam penyembuhan luka bakar pada tikus Sprague dawley. 3.6 Identifikasi Variabel 3.6.1 Variabel bebas Salep ekstrak daun binahong dengan konsentrasi 10, 20, dan 40, basis salep, serta krim silver sulfadiazine. Rumus = n-1t-1 ≥ 15 Keterangan:  n : Jumlah sampel  t : Jumlah kelompok Jumlah kelompok ada 5  t = 5  n-1t-1 ≥ 15  n-15-1 ≥ 15  n-1 4 ≥ 15  4n-4 ≥ 15  4n ≥ 15 + 4  4n ≥ 19  n ≥ 194  n ≥ 4,75 Dibulatkan menjadi 5

3.6.2 Variabel Terikat

Ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermis yang terjadi setelah hari kelima perlakuan yang diamati secara mikroskopis

3.7 Definisi Operasional Tabel 3.1 Definisi Operasional

No. Variabel Defenisi Operasional Alat Ukur Hasil Ukur Skala Ukur 1 Re-epitelisasi epidermis Proses tahapan penyembuhan luka ditandai dengan epitel stratum basal sampai startum korneum yang tidak memiliki lapisan keratin Image J µm Numerik 2 Salep ekstrak daun binahong Salep ekstrak daun binahong dengan konsentrasi 10 20 dan 40 Tidak ada Tidak ada Kategorik 3 Salep Kontrol Negatif Basis salep mengandung vaselin album dan adaps lanae Tidak ada Tidak ada Kategorik 4 Silver Sulfatiazine Salep untuk luka bakar Tidak ada Tidak ada Kategorik 3.8 Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini lampiran 4, sebagai berikut:  kandang tikus  kawat untuk pembatas dan alas kandang  hard colar buat tikus terbuat dari kertas rontgen  tempat makan dan minum tikus  sarung tangan  alat pembersih kandang tikus sabun dan sikat  penangas air  plat besi pembuat luka bakar  benang  lumpang dan alu  timbangan  sendok  hot plate stirrer  tempat sampel jaringan  serbuk kayu  alat bedah minor  mikroskop cahaya  pencukur bulu  komputerlaptop  kotak tempat preparat  termometer  CD DVD RW

3.8.2 Bahan penelitian

Bahan-bahan penelitian yang diperlukan:  Daun Anredera cordifolia Tenore steenis  tikus jantan jenis Sprague dawley  formalin 10  gel pencukur bulu  eter  Vaseline Album  Adaps Lanae 3.9 Cara Kerja Penelitian 3.9.1. Tahap persiapan

3.9.1.1 Determinasi Anredera cordifolia Tenore steenis

Dilakukan dengan cara memberikan sampel daun berserta tangkainya kepada pihak Institus Pertanian Bogor bagian bidang konservasi ex-situ PKT kebun Raya Bogor – LIPI. Bertujuan untuk menentukan jenis dari sampel yang kita berikan apakah sesuai dengan ekstrak yang akan kita pakai saat penelitian. Determinasi dilakukan selama 3 hari.

3.9.1.2 Ektraksi Daun Anredera cordifolia Tenore steenis

Daun binahong yang basah kemudian dicuci dan dipotong kecil-kecil. Daun binahong yang basah digunakan pada penelitian ini sebanyak 4 Kg. Dikeringkan dibawah matahari selama 3 hari, ini masih tergantung dengan cuaca. Setalah dilakukan penjemuran, daun yang sudah kering dilakukan penimbangan. Didapatkan daun binahong yang sudah kering seberat 535 gr. Daun binahong ini diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96 pada suhu 27 o C Dari semua proses ekstraksi didapatkan ekstrak kental daun binahong sebanyak 26,2 g. Setelah itu ekstrak kental itu dibagi menjadi berbagai konsentrasi dalam sediaan salep dengan menggunakan vehiculum adaps lanae dan vaseline album. Dibagi menjadi 0 sebagai kontrol negatif, 10 untuk perlakuan 1, 20 untuk perlakuan 2, 40 untuk perlakuan 3 dan sebagai kontrol positif menggunakan silver sulfatiazin yang merupakan terapi dari guideline WHO tentang penatalaksanaan luka bakar.

3.9.1.3 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak

Basis salep menggunakan adeps lanae dan vaselin album. Lumpang dipanaskan beserta alu didalam oven dengan suhu 50 C sehingga panas. Kemudian keluarkan dari oven. Masukkan adaps lanae terlebih dahulu kemudian aduk hingga lebur , ditambahkan vaselin album dan diaduk secara konstan hingga homogen. Tambahkan ekstrak daun sesuai konsentrasi yang dibutuhkan dan diaduk hingga homogen. Formula standar dasar salep menurut Agoes Goeswin 2006 ialah: R Adeps Lanae 15 g Vaselin Album 85 g m.f salep 100 g Sediaan salep yang digunakan pada penelitian ini menggunakan konsentrasi daun binahong 10, 20 dan 40 dibuat sebanyak 30 g a. salep ekstrak daun binahong 10 R Ekstrak daun binahong 3 g Dasar salep 27 g m.f salep 30 g b. salep ekstrak daun binahong 20 R Ekstrak daun binahong 6 g Dasar salep 24 g m.f salep 30 g c. salep ekstrak daun binahong 40 R Ekstrak daun binahong 12 g Dasar salep 18 g m.f salep 30 g

3.9.1.4 Aklimatisasi Hewan Uji

Sebelum dilakukan percobaan, dilakukan aklimatisasi dahulu pada semua hewan sampel di laboratorium Animal House Fakultas Ilmu Kesehatan dan Kedokteran selama satu minggu. Hewan diadaptasikan dengan lingkungan barunya, makanan dan minumannya. Pemberian makanannya dengan pakan standar secara ad libitum.

3.9.1.5 Pembuatan Alat Luka Bakar

Menggunakan plat besi yang mempunyai luas penampang 4x2 cm disertai gagang yang mempermudah kita dalam membuat luka bakar pada tikus Sparague dawley. 3.9.2 Tahap Pengujian 3.9.2.1 Pembuatan Luka Bakar Derajat II Sebelum melakukan perlakukan, bulu disekitar punggung dicukur dan saat melakukan pencukuran diberikan gel khusus pencukur bulu, bertujuan untuk meminimalkan cedera yang terjadi pada kulit tikus. Berikan terlebih dahulu anastesi eter secara inhalasi sebelum perlakuan. Alat pembuat luka yang terbuat dari plat berukuran 4x2 cm dicelupkan ke air panas 98 C selama 5 menit , kemudian ditempelkan pada kulit tikus yang telah dianastesi selama 10 detik. 31

3.9.2.3 Pemberian Terapi

Setelah dilakukan perlukaan, langsung diberikan perlakuan dengan sesuai kelompok yang sudah ditentukan. Perlakuan dilakuan 2 kali sehari pagi dan sore hari. Perlakuan dilakukan selama 5 hari. Terapi yang dilakukan secara topikal sesuai dengan luas dari luka.

3.9.2.3 Pengambilan Jaringan

Setelah dilakukan selama 5 hari, hewan uji dianatesi dengan cara memasukkannya kedalam toples yang mengandung larutan eter. Setelah itu pengambilan jaringan dengan menggunakan alat bedah minor yang steril. Kemudian dimasukkan ke dalam pot sampel yang berisi formalin 10. Dikirimkan ke tempat pembuatan preparat dibagian Departemen Histologi Universitas Indonesia.

3.9.2.4 Pembuatan Preparat

Pembuatan preparat dilakukan di Departemen Patologi Anatomi Universitas Indonesia. Preparat dibuat menggunakan pewarnaan Hematoxylin Eosin.

3.9.2.5 Pengambilan Gambar Histopatologi

Preparat diamati pada tepi luka dalam proses penyembuhan luka menggunakan mikroskop cahaya Olympus BX41 menggunakan perbesaran 100x. Kemudian diambil gambar menggunakan kamera mikroskop Olympus DP25 dengan disertai penggunaan software Olympus DP2-BSW. Foto diambil dengan perbesaran 100x. Hasil foto ini yang menjadi perhitungan re-epitelisasi epidermis. Sehingga satu preparat mempunyai dua foto sisi re-epitelisasi yang kemudian kedua nilai dirata-ratakan. Untuk menghitung ketebalan re-epitelisasi menggunakan software ImageJ.

3.9.2.6 Cara Penghitungan Ketebalan Re-epitelisasi Epidermis

Tahap penggunaan aplikasi ImageJ untuk menghitung re-epitelisasi yang dilakukan sebanyak 5 kali setiap foto preparat. 1. Setelah komputer dinyalakan, buka aplikasi ImageJ 2. Klik file pada menu kemudian open lalu pilih foto yang akan dilakukan perhitungan 3. Setelah foto tersaji, kemudian klik straight pada menu toolbar 4. Buatlah garis sepanjang garis yang ada pada pojok kanan bawah pada hasil foto preparat. 5. Klik Analyze pada menu kemudian set scale 6. ukuran panjang yang kita ketahui yang tertera pada pojok kanan bawah, pada penelitian ini sebesar 100 µm. Dimasukkan kedalam kolom Known Distance dan untuk kolom Unit of Length dimasukkan satuan µm micrometer. Kemudian klik Ok 7. Buatlah garis kembali pada ketebalan re-epitelisasi yang telah kita tentukan 8. Kik Analyze pada menu dan kemudian klik Measure 9. Selanjutnya akan muncul Result, pada penghitungan re-epitelisasi yang digunakan data pada kolom Length 10. Jika akan melakukan kembali ikuti langkah-langkah dari 1-9 dan apabila akan menyimpan data tersebut, langsung klik file kemudian save. Pada penelitian ini melakukan pengukuran ketebalan re-epitelisasi sebanyak 5 kali, kemudian hasilnya dirata-ratakan.

3.9.3 Alur Penelitian

Determinasi Pengumpulan daun Anredera cordifolia Tenore steenis Dikeringkan ekstraksi dengan pelarut etanol Dijadikan ekstrak kental Dijadikan salep Pembelian tikus Aklimatisasi 1 kandang untuk 1 tikus Perlakuan luka bakar Diberikan salep 2 kali sehari selama 5 hari anastesi Tikus dianastesi dengan eter Jaringan kulit diambil Masukkan ke toples mengandung formalin 10 pembuatan preparat Pembacaan gambar mikroskopik preparat mikroskop cahaya Olympus BX41 Pengambilan foto menggunakan kamera mikroskop Olympus DP25 Hasil foto dibaca menggunakan aplikasi ImageJ Bulu punggung dicukur

3.10 Managemen Data

Data dari hasil penelitian efek pemberian salep ekstrak daun Anredera cordifolia Tenore steenis terhadap re-epitelisasi epidermis pada luka bakar Sprague dawley dianalisis menggunakan program SPSS 16.0 untuk melihat efektifitas yang bermakna pada setiap bahan uji yang terdiri dari kontrol positif, kontrol negatif dan salep dengan berbagai konsentrasi ekstrak Dari penelitian ini data didapatkan berupa variabel numerik-numerik yang lebih dari dua kelompok tidak berpasangan dan dengan distribusi data normal menggunakan uji one way ANOVA. 23 Jika data tidak terdistribusi dengan normal, maka dilakukan transformasi dengan log 10. Jika data tetap tidak normal, maka dilakukan uji non parametrik tes.

3.11 Etika Penelitian