Tabel 7. Kandungan limonin dalam kristal yang diperoleh dari biji, kulit ari, pulp jeruk
Bahan mg limoning bahan kering
Pulp kulit ari jeruk tanpa pencucian etanol
2,5.10
-5
kulit ari jeruk dengan pencucian etanol 2,5.10
-5
Biji jeruk tanpa pencucian etanol 0,676
Biji jeruk dengan pencucian etanol 0,215
Tabel 7 menunjukkan bahwa berdasarkan hasil analisis, kandungan limonin paling banyak terdapat pada biji, hal ini sesuai dengan Maier et al.
1977 yang menyebutkan bahwa limonin paling banyak terdapat pada bagian buah jeruk yang tidak dapat dimakan seperti biji. Hasil analisis
limonin dari pulp, kulit ari dan biji sesuai dengan penelitian Li 2000 mengajukan peta distribusi limonin pada buah jeruk dan menyebutkan
bahwa kandungan limonin paling tinggi terdapat pada biji diikuti dengan albedo, flavedo kulit ari, baru kemudian sari jeruk.
Menurut Pifferi et al. 1993 pencucian presipitat dengan etanol bertujuan untuk melarutkan senyawa-senyawa pengotor seperti flavonoid
yang terdapat pada presipitat. Tetapi hasil analisis menunjukkan presipitat yang dicuci dengan etanol mengandung limonin yang lebih sedikit.
Menurut Mullin 2001, pencucian dapat meningkatkan kemurnian suatu senyawa tetapi dikhawatirkan senyawa yang diinginkan juga ikut terlarut
sehingga menurunkan rendemen senyawa yang diinginkan. Tahap optimasi proses isolasi limonin dilakukan dengan metode tanpa pencucian etanol,
hal ini sejalan dengan penelitian Jitpukdeebodintra et al. 2005 yang mengisolasi limonin dari biji lemon.
4.2 Optimasi Proses Isolasi Limonin dari Biji Jeruk Siam
Penelitian utama yang dilakukan adalah optimasi proses isolasi limonin menggunakan bahan baku dengan kandungan limonin paling tinggi yaitu biji
jeruk siam, dengan metode ekstraksi soxhletasi tanpa pencucian etanol. Optimasi dilakukan dengan metode permukaan respon atau response surface
method RSM yaitu kumpulan teknik matematika dan statistik yang
digunakan untuk membentuk model dan menganalisis masalah dalam respon yang
dipengaruhi oleh
beberapa peubah
dan bertujuan
untuk mengoptimalisasi respon. Optimasi dilakukan dengan rancangan komposit
terpusat pada tahapan proses presipitasi dengan dua faktor yaitu rasio ekstrak aseton dengan pelarut heksan dengan rentang 1:3 – 1:5 vv serta lama
presipitasi pada rentang waktu 16-24 jam. Pengaruh rasio volume ekstrak aseton dengan heksan serta lama presipitasi terhadap jumlah limonin yang
diperoleh disajikan pada Tabel 8 dan hasil analisis statistik yang diolah dengan bantuan software Minitab 14 disajikan pada Lampiran 2.
Tabel 8. Kandungan limonin pada berbagai perlakuan rasio pelarut dan lama presipitasi
Rasio pelarut
heksan Lama
presipitasi jam
mg presipitat
Kadar limonin
mg limonin
mg limoning
biji kering
3 16
306,700 17,857
54,768 0,676
3 24
281,921 23,234
61,85 0,764
5 16
172,7015 23,571
40,708 0,503
5 24
56,376 26,020
14,669 0,181
4 20
453,400 26,837
121,678 1,502
4 20
450,000 26,429
118,929 1,468
2,6 20
236,285 12,857
30,379 0,375
5,4 20
41,320 20,306
8,391 0,104
4 14 jam 21 menit
84,240 15,204
12,808 0,158
4 25 jam 40 menit
69,979 15,204
10,639 0,131
Tabel 8 memperlihatkan bahwa kandungan limonin paling tinggi diperoleh dari perlakuan rasio ekstrak aseton dengan pelarut heksan 1: 4 serta
lama presipitasi 20 jam dengan jumlah limonin yang diperoleh sebesar 1,502 mg limoning biji jeruk kering.
Kristal limonin dari biji jeruk pada berbagai perlakuan rasio volume ekstrak aseton dengan pelarut heksan serta lama presipitasi disajikan pada
Gambar 19.
Gambar 19. Kristal limonin dari biji jeruk pada beberapa perlakuan rasio volume ekstrak aseton dengan heksan serta lama presipitasi
Keterangan :
Data respon jumlah limonin yang diperoleh selanjutnya dianalisis dan diperoleh koefisien paramater serta tingkat signifikansi sebagaimana disajikan
pada Tabel 9. Tabel 9. Koefisien parameter dengan respon jumlah limonin yang diperoleh
Koefisien Pendugaan koefisien
Signifikansi Titik potong
-23,0708 99,6
X
1
Rasio volume ekstrak aseton :heksan
4,6741 99,25
X
2
lama presipitasi 1,5577
99,6 X
1
X
1
-0,5380 99,5
X
2
X
1
-0,0366 99,6
X
2
X
2
-0,0256 77
S = 0,2513 R-sq = 89,9, R-Sqadj = 77,2 Tabel 9 faktor rasio volume ekstrak aseton dengan heksan X
1
dan lama presipitasi X
2
memiliki tingkat signifikansi lebih dari 95 α = 0,05 sehingga kedua faktor ini dikatakan berpengaruh signifikan terhadap respon
jumlah limonin yang diperoleh. Hasil analisis ragam menunjukkan model A Rasio 1:3, 16 jam;
C Rasio 1:4, 20 jam; E Rasio 1:4, 25 jam 40 menit;
B Rasio 1:4, 14 jam 21 menit; D Rasio 1:4, 20 jam;
F Rasio 1:5, 16 jam
A B
E D
C F
kuadratik memiliki nilai R
2
sebesar 89,9, hal ini berarti perlakuan yang diberikan berpengaruh sebesar 89,9 terhadap respon, sedangkan 10,1
dipengaruhi oleh faktor lain. Metode permukaan respon digunakan untuk mengetahui pengaruh
pemberian perlakuan terhadap input, mengetahui keadaan dari perlakuan yang akan memberikan hasil secara bersamaan memenuhi spesifikasi yang
diinginkan serta mengetahui nilai dari perlakuan yang akan memberikan hasil maksimal untuk respon tertentu. Metode permukaan respon dapat membawa
peneliti secara cepat dan efisien untuk mencapai titik optimum Box et al. 1978. Metode permukaan respon mempertimbangkan hubungan antara
parameter proses dan hasil yang diperolehnya sebagai permukaan dalam ruang dimensional variabel. Model yang diperoleh digunakan untuk
mengetahui kondisi optimum proses karenanya kondisi optimum yang diperoleh berdasarkan model persamaan harus divalidasi untuk melihat
apakah kondisi optimum berdasarkan model sesuai dengan kondisi optimum di lapangan. Model ini tidak cocok digunakan untuk menghitung respon dari
kondisi proses di luar taraf faktor yang dicobakan pada metode permukaan respon. Hasil analisis diperoleh hubungan antara respon jumlah limonin yang
diperoleh dengan 2 faktor yaitu rasio volume ekstrak aseton dengan heksan X
1
serta lama Presipitasi X
2
diperoleh persamaan: Y = -23,0708 + 4,6741X
1
+ 1,5577X
2
- 0,5380X
1 2
- 0,0366 X
1
X
2
-0,0256X
2 2
Nilai Y merupakan jumlah limonin yang diperoleh, X
1
adalah rasio ekstrak aseton dengan heksan vv dan X
2
adalah lama presipitasi jam. Titik optimum jumlah limonin yang diperoleh yaitu 1,502 mg limoning biji jeruk
kering. Kondisi optimum proses yang didapat dari model persamaan optimasi
adalah pada rasio volume ekstrak aseton dengan heksan X
1
dengan nilai 1:3,87 dan lama presipitasi X
2
19,93 jam seperti disajikan pada Tabel 10. Kondisi optimum proses yang didapat dari model persamaan memberikan
respon jumlah limonin yang dihasilkan sebesar 1,487 mg limoning biji jeruk
kering. Hasil validasi diperoleh limonin sebesar 1,444 mg limoning biji jeruk kering.
Tabel 10. Nilai optimum faktor rasio volume ekstrak aseton dengan heksan dan lama presipitasi
Faktor Pengamatan
Nilai optimal
Pengamatan
Rasio volume ekstrak aseton dengan heksan X
1
2,6 3,87
5,4 Lama presipitasi X
2
14,34 19,93
25,65 Gambar 20 dan 21 menunjukkan bahwa faktor rasio volume ekstrak
aseton dengan heksan akan berpengaruh pada peningkatan jumlah limonin yang dihasilkan. Namun setelah melalui titik kritis yaitu 1: 4, jumlah limonin
yang diperoleh menurun seiring peningkatan rasio volume ekstrak aseton dengan heksan. Hal ini karena pada penambahan heksan sebanyak tiga kali
volume aseton belum cukup untuk mengendapkan semua limonin dalam ekstrak aseton. Pada rasio ekstrak aseton berbanding heksan sebesar 1:5,
jumlah limonin menurun, hal ini menurut Mullin 2001 semakin tinggi rasio volume ekstrak aseton dengan pelarut heksan menyebabkan penurunan
kelarutan limonin dan senyawa semi polar lainnya berlangsung cepat sehingga ikatan antar molekul menjadi renggang yang menyebabkan molekul
yang terbentuk besar tetapi rapuh dan ringan sehingga jumlah limonin yang dihasilkan hanya 0,104-0,503 mg limoning biji kering. Faktor lama
presipitasi juga berpengaruh positif terhadap jumlah limonin yang diperoleh hingga mencapai titik kritis yaitu 20 jam dan setelah itu akan berpengaruh
negatif terhadap jumlah limonin yang diperoleh. Hal ini karena ketika presipitasi berlangsung selama 16 jam belum semua limonin terendapkan.
Tetapi ketika presipitasi berlangsung selama 24 jam, jumlah limonin menurun, menurut Mullin 2001, komponen organik memiliki kristal
berbentuk molekuler dengan ikatan tarik-menarik yang lemah. Presipitasi selama 24 jam diduga menyebabkan ikatan limonin dengan pengotor berupa
senyawa flavonoid terputus dan membentuk ikatan limonin dengan limonin, sehingga pada tahap purifikasi, pengotor larut dalam isopropanol
1 -1
-2 -3
1 -1
-2 -3
2,0 2,5
3,0 3,5
4,0 4,5
5,0 5,5
6,0
Rasio Aseton:Heksan vv
12 14
16 18
20 22
24 26
L a
m a
P re
s ip
it a
s i
j a
m
menyebabkan jumlah presipitat rendah tapi konsentrasi limonin dalam presipitat tinggi.
Gambar 20. Permukaan respon jumlah limonin yang diperoleh
Gambar 21. Kontur permukaan respon jumlah limonin yang diperoleh
Pichaiyongvongdee dan Haruenkit 2009 melakukan penelitian mengenai kandungan limonin dalam beberapa bagian pummel dari beberapa kultivar di
Thailand, sedangkan Drewnoski dan Gomez 2000 melakukan penelitian mengenai kandungan limonin pada beberapa bagian grapefruit. K
andungan limonin dari beberapa jenis biji dan sari jeruk disajikan pada Tabel 11.
Tabel 11. Kandungan limonin pada beberapa sari dan biji jeruk Jenis Jeruk
Sari ppm Biji ppm
Pummelo KNP
a
22,69 2615,30
Pummelo KP
a
18,27 2605,56
Pummelo KTG
a
10,07 1375,31
Pummelo PV
a
20,02 2443,46
Pumello TD
a
29,62 2594,60
Grapefruit
b
11,40 1536,00
Keterangan : KNP = Kao Nampheung;
KTG= Kao Tanggkya; PV = Pattavee
KP = Kao Paen; TD = Thong Dee
Sumber :
a
Pichaiyongvongdee dan Haruenkit 2009
b
Drewnowski dan Gomez 2000 Berdasarkan Tabel 11, dapat dihitung bahwa kandungan limonin
dalam biji jeruk apabila dirata-ratakan nilainya sebesar 123 kali dari kandungan limonin dalam sari jeruk. Apabila didasarkan pada asumsi tersebut
maka kandungan potensial limonin dalam biji jeruk siam diprediksi sebesar 1600 ppm sehingga dapat diketahui persen recovery dari ekstraksi yang
dilakukan adalah sebesar 93 . Hal ini berarti proses ekstraksi yang diajukan pada penelitian ini lebih baik dari proses ekstraksi penelitian yang sudah ada
yang mampu mengekstrak limonin dengan persen recovery sebesar 91,50 . Pada penelitian ini dihasilkan presipitat yang mengandung limonin
sebesar 27, hal ini berarti limonin ini dapat diaplikasikan dalam produk pangan dan farmasi dan digolongkan dalam phamaceutical grade, seperti
beberapa perusahaan di RRC yang menjual limonin dengan kadar 30 untuk dijadikan suplemen kesehatan.
Hasil analisis limonin dari biji jeruk siam menunjukkan bahwa biji jeruk siam merupakan bahan baku potensial untuk isolasi limonin. Biji jeruk
siam memiliki kandungan limonin sebesar 1,502 mg g biji jeruk kering, nilai ini lebih besar dibanding beberapa varietas jeruk lainnya seperti lemon yang
mengandung limonin sebesar 0,732 mgg biji lemon Pifferi, 1993; biji jeruk iyo tangor yang mengandung limonin sebesar 0,457 mgg biji jeruk kering
Ishii et al. 2003; biji jeruk asam Citrus aurantium yang mengandung limonin sebesar 0,65 mgg biji jeruk kering Dandeekar et al. 2008; biji jeruk
shiikusawa Citrus depresa Hayata yang mengandung limonin sebesar 0,187 mgg biji jeruk kering Ohta et al. 1995.
Menurut Maier et al. dalam Nagy et al. 1977, ekstrak biji jeruk
kemungkinan mengandung 10 sampai 15 senyawa limonoid yang berbeda sehingga sangat sulit mencari pelarut yang dapat memisahkan semua senyawa
tersebut sehingga penggunaan kromatografi kolom biasanya diperlukan.
49
V. SIMPULAN DAN SARAN
