Rekayasa Proses Isolasi Limonin dari Limbah Pembuatan Sari Jeruk Siam

Dewi Cakrawati

SEKOLAH PASCA SARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

Limonin dari Limbah Pembuatan Sari Jeruk Siam” adalah karya saya sendiri dengan arahan komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2010

Dewi Cakrawati NRP. F351070151

Limonin is related to triterpene derivatives found in Rutaceae families. It is generally not desirable in citrus juice, because of its bitter taste. Limonin have been shown to have biological activities such as amoebicidal agent and chemo preventive agent. Limonin has a future chances to be a valuable chemical for health treatment. The aims of this study were (1) determined extraction condition for isolating limonin from Pontianak tangerine juice by product such as from flavedo, seeds, pulp, backwashed water; (2) determined the effect of ethanol washing in the seed extraction process; (3) determined the optimum precipitation process (solvent ratio, time) to obtain high yield of limonin. Limonin isolation from backwashed water conducted with two methods, firstly, maceration of pulp using acetone and dichloromethane; secondly, liquid-liquid extraction of backwashed water using dichloromethane. Limonin isolation from membran segment, seed and pulp conducted with continous soxhlet extraction using hexane and acetone. The precipitate obtained from extraction were given two treatment, there were washed and unwashed with ethanol 95% to dissolved the impurities. Optimization process was conducted on precipitation stage using response surface method. Precipitation conditions were ratio between acetone extract and hexane and precipitation time. The result shown that none of limonin was detected in

backwashed water and pulp. Limonin content from flavedo was 2,5.10-5 mg,

while limonin content from citrus seed with ethanol washing was 0,215 mg limonin/g dried citrus seeds and limonin content from citrus seed without ethanol washing was 0,676 mg limonin/g dried citrus seeds. The preliminary research shown that seeds contain higher limonin than any other part of citrus fruit so the optimization only conducted on citrus seeds without ethanol washing. Optimum precipitation conditions by experiment was agreed with optimum condition by model obtain from response surface method, those were ratio between acetone extract and hexane 1:4 and precipitation time 20 hours with yield of limonin 1,502 mg limonin/g dried citrus seed. Design process of limonin isolation in this reasearch was good enough because it could give high extraction yield approximately 93%.

Keywords : limonin, siam citrus juice by product, optimization process, precipitation.

Limonoid merupakan senyawa khas yang terdapat pada jeruk yang keberadaannya kurang disukai karena menyebabkan rasa pahit pada sari jeruk. Meskipun demikian, limonin memiliki manfaat yang besar bagi kesehatan diantaranya menghambat pertumbuhan tumor dan membantu mengurangi resiko penyakit penyumbatan pembuluh darah. Limonin telah diproduksi oleh Biosecure Lab Inc, suatu perusahaan farmasi dari Kanada menggunakan limonin serta senyawa aktif dalam jeruk seperti bioflavonoid, asam askorbat dalam produk

bernama AntimicrobesTM, suatu produk antiviral, antibakteri, antiparasit,

antioksidan, bakteriostatis, fungisidal, antiseptik dan desinfektan, yang dapat dikonsumsi atau digunakan sebagai obat luar. Limonin terutama terdapat pada bagian jeruk yang tidak dapat dimakan, sehingga bahan baku untuk isolasi limonin dapat diperoleh dari industri pembuatan sari jeruk yang menghasilkan

limbah seperti biji, kulit ari, sisa penyaringan awal (pulp) dan sisa penyaringan

membran. Adapun tujuan dari penelitian ini adalah (1) untuk memperoleh kondisi ekstraksi untuk mengisolasi limonin dari limbah pembuatan sari jeruk seperti biji,

kulit ari dan air backwash; (2) mengetahui pengaruh pencucian dengan etanol

95% terhadap presipitat yang dihasilkan dari biji jeruk siam; (3) memperoleh kondisi optimum proses presipitasi meliputi rasio ekstrak aseton dengan heksan serta lama presipitasi pada isolasi limonin dari biji jeruk.

Isolasi limonin dari air backwash dilakukan dengan dua metode, pertama

maserasi endapan air backwash menggunakan pelarut aseton dan diklorometan

pada suhu ruang selama 4 jam, metode kedua adalah ekstraksi cair-cair dari air

backwash menggunakan pelarut diklorometan. Isolasi limonin dari kulit ari dan biji jeruk dilakukan dengan metode soxhletasi bertahap, tahap pertama menggunakan pelarut heksan selama 10 jam, tahap kedua menggunakan pelarut aseton selama 10 jam. Untuk mempermudah proses ekstraksi, biji, kulit ari, dan

pulp dikeringkan dengan oven blower pada suhu 50oC sampai berat ketiga bahan

tersebut konstan, selanjutnya dilakukan pengecilan ukuran menggunakan hammer

mill sampai berukuran 10 mesh. Presipitat yang dihasilkan kemudian diberi

perlakukan tanpa dan dengan pencucian etanol 95%. Selanjutnya dilakukan isolasi limonin pada bahan baku dengan kandungan limonin paling tinggi dengan optimasi rekayasa proses isolasi dilakukan dengan metode permukaan respon (response surface method -RSM) dengan rancangan komposit terpusat pada tahapan proses presipitasi dengan dua faktor yaitu rasio ekstrak aseton dengan pelarut heksan serta lama presipitasi.

Analisis limonin dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang

gelombang 503 nm. Isolasi limonin dari air backwash metode maserasi endapan

maupun ekstraksi cair-cair menunjukkan kandungan limonin tidak terdeteksi. Isolasi limonin dari pulp juga menunjukkan kandungan limonin tidak terdeteksi sedangkan isolasi limonin dari kulit ari menunjukkan kandungan limonin sebesar

2,5.10-5 mg limonin/g bahan kering. Isolasi limonin dari biji jeruk dengan metode

soxhletasi bertahap dengan pecucian etanol memberikan hasil kandungan limonin sebesar 0,215 mg limonin/g biji jeruk kering, sedangkan tanpa pencucian etanol

berdasarkan metode permukaan respon, yaitu diperoleh pada rasio ekstrak aseton dengan heksan yaitu 1:4 dengan lama presipitasi 20 jam dengan respon jumlah limonin 1,502 mg limonin/g biji kering. Rekayasa proses isolasi limonin pada penelitian ini sudah cukup baik karena dapat mengisolasi limonin sebesar 93% dari biji jeruk siam.

Biji jeruk siam merupakan bahan baku potensial untuk produksi limonin karena kandungan limonin yang tinggi serta ketersediaannya yang mencukupi dan dapat diperoleh dari limbah industri pengolahan sari jeruk. Penelitian ini menghasilkan presipitat dengan tingkat kemurnian limonin sebesar 27%, hal ini berarti limonin ini dapat diaplikasikan dalam produk pangan dan farmasi dan

digolongkan dalam phamaceutical grade.

Kata Kunci : limonin, limbah industri pembuatan sari jeruk siam, optimasi proses, presipitasi.

© Hak Cipta Milik Institut Pertanian Bogor (IPB) tahun 2010

Hak cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan

karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya

Dewi Cakrawati

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Magister Sains pada

Program Studi Teknologi Industri Pertanian

SEKOLAH PASCA SARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

Pembuatan Sari Jeruk Siam

Nama : Dewi Cakrawati

NIM : F351070151

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Erliza Noor Dr. Ir. Setyadjit, M.App.Sc

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Teknologi Industri Pertanian

Prof. Dr. Ir. Irawadi Djamaran Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.Si

penulis menyelesaikan penelitian dan menuangkan hasilnya dalam bentuk tesis yang berjudul “Rekayasa Proses Isolasi Limonin dari Limbah Pembuatan Sari Jeruk Siam” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian Insitut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini tidak akan terselesaikan tanpa bantuan dari berbagi pihak, karenanya pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Dr. Ir. Erliza Noor dan Bapak Dr. Ir. Setyadjit, M.App.Sc. selaku komisi

pembimbing atas segala bimbingan, arahan, bantuan, dan motivasi baik berupa moril dan materil yang telah diberikan selama penelitian dan penyusunan tesis.

2. Prof. Dr. Ir. Irawadi Djamaran dan Dr. Ir. Ani Suryani, DEA., selaku Ketua

dan Sekretaris Program Studi Teknologi Industri Pertanian atas bantuan dan masukan yang diberikan untuk kelancaran studi penulis.

3. Seluruh staf pengajar Sekolah Pasca Sarjana IPB yang telah memberi ilmu

pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama menimba ilmu pengetahuan serta laboran dan teknisi laboratorium Departemen Teknologi Industri Pertanian yang telah banyak memberikan bantuan kepada penulis selama melaksanakan penelitian.

4. Sekretariat Jendral Penelitian dan Pengembangan Departemen Pertanian yang

telah memberi dukungan finansial bagi pelaksanaan penelitian ini melalui Program Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T).

5. Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian

Departemen Pertanian yang telah bersedia memfasilitasi penelitian ini serta staf dan teknisi Balai Besar Litbang Pasca Panen yang telah banyak membantu demi kelancaran pelaksanaan penelitian ini.

6. Rekan-rekan seperjuangan, mahasiswa S1, S2 dan S3 TIP atas bantuan,

dukungan, dan motivasi yang diberikan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan tesis.

8. Suami tercinta Yuyus Sirhanudin Permana S.Si., Apt, untuk kesabaran, pengertian, dukungan, serta motivasi yang tidak pernah berhenti diberikan kepada penulis selama menyelesaikan pendidikan S2 serta untuk diskusi-diskusi panjang dan masukan yang bermanfaat yang diberikan kepada penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan tesis.

9. Semua pihak yang telah banyak membantu penulis baik secara langsung

maupun tidak langsung yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis berharap semoga karya ini bisa bermanfaat bagi pihak yang membutuhkan. Semoga dengan mengetahui sedikit tentang limonin bisa menambah keimanan kita kepada Sang Khalik yang Maha Mengetahui Segala Sesuatu.

Bogor, Januari 2010

bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan dari SMU Negeri 20 Bandung pada tahun 2001 dan pada tahun yang sama memperoleh kesempatan untuk melanjutkan pendidikan di Universitas Padjadjaran pada Jurusan Teknologi Industri Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) dan lulus tahun 2006. Penulis melanjutkan pendidikan S2 pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian Insititut Pertanian Bogor pada tahun 2007.

xii

DAFTAR TABEL ... DAFTAR GAMBAR ... DAFTAR LAMPIRAN ………..

I. PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang ………

1.2Perumusan Masalah ………

1.3Tujuan Penelitian………

1.4Ruang Lingkup Penelitian ………

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1Senyawa Limonoid ………….………

2.2Ekstraksi ………

2.3Teknik Separasi……….……….

2.4Penelitian Terdahulu ………..

III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1Kerangka Pemikiran ………...

3.2Tempat dan Waktu Penelitian ………

3.3Bahan dan Alat ………...

3.4Tahapan Penelitian ………

3.5Rancangan Percobaan ………

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1Isolasi Limonin dari Air Backwash, Kulit Ari, Biji dan

Sisa Penyaringan Awal (Pulp) ………...

4.2Optimasi Proses Isolasi Limonin dari Biji Jeruk …………

V. SIMPULAN DAN SARAN

5.1Simpulan ……….

5.2Saran ………..

DAFTAR PUSTAKA. ……… LAMPIRAN ……… xiii xiv xv 1 3 3 3 4 9 13 15 18 19 19 19 27 30 41 49 49 50 54

xiii Halaman 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Senyawa limonoid aglikon dan limonoid glukosida ………. Beberapa penelitian tentang limonin ……… Desain rancangan percobaan ……….

Konsentrasi limonin dalam permeat, retentat dan air backwash…

Hasil analisis isolasi limonin dari air backwash ………...

Komposisi asam lemak pada minyak biji jeruk ……… Kandungan limonin dalam kristal yang diperoleh dari biji, kulit

ari, pulp jeruk ………

Kandungan limonin pada berbagai perlakuan rasio pelarut dan lama presipitasi ………. Koefisien parameter dengan respon jumlah limonin yang diperoleh ………... Nilai optimum faktor rasio volume ekstrak aseton dengan heksan dan lama presipitasi ……….……….. Kandungan limonin pada beberapa sari dan biji jeruk ………….. 6 15 27 30 36 39 41 42 43 45 47

xiv 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Biosintesis limonin dalam buah jeruk ……… Mekanisme pembentukan rasa pahit pada buah jeruk ………...

Struktur molekul limonin 17-β-D- glucopyranosida …………..

Distribusi limonin dalam jeruk ………... Perangkat ekstraksi soxhletasi ……… Diagram proses persiapan bahan baku ……… Skema proses mikrofiltrasi sari jeruk ……… Skema proses backwash membran ………..

Diagram proses maserasi endapan air backwash dengan pelarut

aseton dan diklorometan ………...

Diagram proses ekstraksi air backwash dengan metode ekstraksi

cair-cair ………..

Diagram proses isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp jeruk

tanpa pencucian etanol ………..

Diagram proses isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp jeruk

dengan pencucian etanol ………... Optimasi proses isolasi limonin dari biji jeruk ………. Struktur molekul limonin dan beberapa turunannya ………

Ekstraksi maserasi hasil sentrifugasi air backwash …………...

Proses ekstraksi cair-cair ……….. Biji jeruk hasil pengeringan dan pengecilan ukuran ………….... Minyak biji jeruk siam ……….. Kristal limonin dari biji jeruk pada berbagai perlakuan rasio volume ekstrak aseton dengan heksan serta lama presipitasi... Permukaan respon jumlah limonin yang diperoleh ……..……… Kontur permukaan respon jumlah limonin yang diperoleh …...

5 5 7 7 11 21 22 22 23 24 25 26 29 32 33 35 37 38 43 46 46

xv

Halaman 1

2 3 4 5 6 7

Prosedur analisa ……….……… Kurva standar limonin ……….…….. Analisis Limonin dalam presipitat……… Hasil Analisis Limonin ……… Hasil optimasi jumlah limonin dengan metode permukaan respon Pengolahan data rasio volume ekstrak aseton – pelarut heksan terhadap jumlah limonin yang dihasilkan ……….

Perhitungan persen recovery isolasi limonin ……….

54 56 57 58 60 61 62

1

Limonin merupakan senyawa limonoid utama yang terdapat pada hampir semua jenis jeruk dalam jumlah signifikan. Limonin juga merupakan penyebab utama timbulnya rasa pahit pada sari jeruk. Meskipun demikian, limonin memiliki manfaat yang besar bagi kesehatan diantaranya dapat menghambat

pertumbuhan tumor (Ishii et al. 2003), menurunkan rasio kolesterol LDL/HDL

dan mempercepat oksidasi LDL di usus sehingga membantu mengurangi resiko

penyakit penyumbatan pembuluh darah (Dandeekar et al. 2007).

Beberapa perusahaan farmasi diantaranya Shanghai Xinma Bio-tech Co,Ltd dari Cina; Alexis Biochemicals, perusahaan farmasi Swiss-Amerika Serikat telah memproduksi limonin dalam skala pabrik untuk selanjutnya dijadikan bahan tambahan makanan dan minuman, suplemen kesehatan dan biopestisida. Saat ini, Biosecure Lab Inc, suatu perusahaan farmasi dari Kanada menggunakan limonin serta senyawa aktif dalam jeruk seperti bioflavonoid,

asam askorbat dalam pembuatan produk bernama AntimicrobesTM, suatu

produk antiviral, antibakteri, antiparasit, antioksidan, bakteriostatis, fungisidal,

antiseptik dan desinfektan, yang berbentuk spray dan konsentrat serta dapat

dikonsumsi atau digunakan sebagai obat luar. Sedangkan di Indonesia data mengenai produksi limonin serta perusahaan farmasi yang memproduksinya belum tersedia.

Limonin (Limonoic Acid 3,19:16, 17-dilactone) adalah senyawa

limonoid aglycone dengan rumus molekul C26H30O8 memiliki berat molekul

470,5 Da, titik didih 280 ºC, bersifat tidak larut dalam air, tetapi larut dalam

dimetilformamida, dichloromethane, acetonitrile, asam asetat glasial, dan

alkohol. Senyawa dengan bentuk kristal berwarna putih kekuningan ini ditemukan pada semua spesies jeruk, dengan kandungan tertinggi pada biji.

Limonin pada buah jeruk awalnya terdapat sebagai senyawa limonoic acid A

ring lactone yang memiliki satu gugus lakton dan tidak memiliki rasa pahit, pada saat proses ekstraksi sari jeruk, senyawa ini terlaktonisasi karena menjadi

limonoid dilakton yang memiliki dua gugus lakton dan memiliki rasa pahit.

D-ring lakton hidrolase. Adanya penambahan panas selama proses pasteurisasi

dan evaporasi akan mempercepat reaksi ini (Mozaffar et al. 2000).

Penelitian Aghitsni (2008) mengenai mikrofilrasi sari jeruk menghasilkan

produk samping berupa kulit ari, biji, sisa penyaringan awal dan lapisan cake

yang tertahan di membran yang diduga mengandung limonin. Limonin bernilai tinggi yaitu sebesar US$ 109,5 untuk 5 mg limonin murni (SIGMA, 2009), pada produk komersial limonin dijual dengan tingkat kemurnian 75% ± 5% (SIGMA 2007).

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengisolasi limonin,

diantaranya Ifuku et al. (1998), yang mengajukan paten produksi limonoid

glukosida dari biji dan sari jeruk menggunakan ekstraksi supercritical fluida.

Yu (2004), ekstraksi limonin aglikon dan glukosida dari biji grapefruit

menggunakan Supercritical CO2 pada kondisi optimum tekanan -48,3 MPa

selama 60 menit, kecepatan alir 5 l/menit, menghasilkan rendemen limonin 6,3

mg limonin/biji grapefruit kering, ekstraksi limonin glukosida pada kondisi

optimum tekanan -42 Mpa, 45% etanol selama 40 menit, kecepatan alir 5

l/menit menghasilkan rendemen 0,73 mg limonin glukosida/g biji grapefruit

kering. Dandeekar et al. (2007) memperkenalkan proses baru dalam ekstraksi

limonoid aglikon dari biji jeruk asam (Citrus aurantium L.) menggunakan dua

larutan hidrotrop yaitu garam natrium salisilat (Na-Sal) dan natrium cumene sulfonat (Na-CuS) dengan hasil penelitian menunjukkan rendemen limonin

paling tinggi diperoleh pada kondisi konsentrasi larutan 2 M, suhu 45oC dan

persen bahan 10% dimana larutan Na-CuS menghasilkan limonin 0,65 mg/g biji jeruk sedangkan larutan Na-Sal menghasilkan 0,46 mg/g biji.

Pada penelitian ini dilakukan isolasi senyawa limonin yang diperoleh dari biji jeruk siam. Rekayasa proses isolasi dilakukan dengan metode ekstraksi bertahap, presipitasi dan purifikasi. Optimasi rekayasa proses isolasi dilakukan

dengan metode permukaan respon atau response surface method (RSM)

dengan rancangan komposit terpusat dengan pada tahap proses presipitasi dengan perlakuan rasio volume pelarut heksan serta lama presipitasi. Isolasi senyawa limonin sebagai pemanfaatan produk samping mikrofiltrasi sari jeruk diharapkan dapat memberikan nilai tambah pada industri pengolahan sari jeruk.

Secara umum, produk limonin diharapkan dapat dimanfaatkan lebih lanjut pada industri farmasi.

1.2 Perumusan Masalah

Limonin yang ada saat ini diperoleh dari biji lemon, grapefruit dan

jeruk asam (Citrus aurantifolium L.) sedangkan isolasi limonin dari biji jeruk

siam (Citrus nobilis var microcarpa) yang juga diduga mengandung limonin

belum pernah dilakukan. Isolasi limonin saat dilakukan dengan metode ekstraksi menggunakan pelarut petroleum eter yang bersifat toksik. Selain itu, tahapan proses isolasi limonin cukup panjang sehingga perlu ada optimasi rekayasa proses ekstraksi dan presipitasi supaya tahapan proses bisa lebih singkat dan bisa meningkatkan rendemen limonin yang dihasilkan.

1.3 Tujuan penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah

1. Mengetahui kandungan limonin dalam limbah pengolahan sari jeruk,

seperti air backwash membran, kulit ari, sisa penyaringan awal (pulp) dan

biji jeruk

2. Memperoleh kondisi optimum proses isolasi limonin dari bahan baku

dengan kandungan limonin paling tinggi (biji jeruk) agar dihasilkan limonin dengan rendemen paling tinggi

1.4 Ruang Lingkup Penelitian

Penelitian ini meliputi penelitian pendahuluan dan penelitian utama.

Penelitian pendahuluan meliputi isolasi limonin dari air backwash, kulit ari

dan biji jeruk siam serta penentuan metode isolasi limonin dari biji jeruk. Penelitian utama meliputi penentuan kondisi optimum proses isolasi limonin dari bahan baku dengan kandungan limonin paling tinggi pada tahap presipitasi dengan perlakuan rasio volume ekstrak aseton dengan pelarut heksan serta lama presipitasi.

4

II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Senyawa Limonoid

Menurut Yu (2004), senyawa limonoid pada jeruk merupakan kelompok metabolit sekunder yang belum diketahui memiliki fungsi langsung

pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Menurut Ishii et al. (2003),

limonoid merupakan senyawa kimia dengan struktur triterpenoid dengan kandungan oksigen yang tinggi. Limonoid merupakan penanda taksonomi

yang baik karena senyawa ini spesifik untuk tanaman Rutaceae. Maier et al.

dalam Nagy et al. (1977) menambahkan limonoid memiliki beberapa

karakteristik yaitu cincin furan yang terikat pada cincin D pada C-17, gugus fungsional yang mengandung oksigen pada C-3, C-4, C-16 dan C-17, gugus epoksida pada C-14 dan C-15. Limonoid terdapat secara alami dalam dua bentuk yaitu limonoid aglikon dan limonoid glukosida. Limonoid aglikon diklasifikasikan menjadi dua kelompok, pertama limonoid monolakton yang memiliki cincin D terbuka, misalnya limonoat A-ring lakton yang banyak terdapat pada daun dan buah jeruk; kedua limonoid dilakton yang memiliki cincin D tertutup, misalnya limonin yang banyak terdapat pada biji jeruk. Limonin pertama kali diisolasi dari jeruk navel, dengan komposisi kimia

C26H30O8 dengan berat molekul 470 Da.

Menurut Hasegawa dan Maier dalam Rouseff (1990), dari 37 jenis senyawa limonoid aglikon yang berhasil diisolasi, empat diantaranya menyebabkan rasa pahit pada jeruk, yaitu limonin, nomilin, ichangin dan nomilinat. Limonin terbentuk seiring proses pertumbuhan jeruk dan diduga terbentuk pada jaringan albedo buah jeruk. Diduga senyawa limonoid yang mula-mula terbentuk adalah deasetilnomilin selanjutnya nomilin, obacunone lalu limonin. Limonoate A-ring lakton merupakan garam dari asam limonoat A-ring lakton yang terdapat dalam jaringan buah jeruk, sedangkan dalam biji jeruk terdapat dalam bentuk limonoat dilakton atau disebut juga limonin. Biosintesis pembentukan limonin disajikan pada Gambar 1.

Pahit Tidak Pahit

Gambar 1. Biosintesis limonin dalam buah jeruk

Sumber : Eskin (1979); Maier et al. dalam Nagy et al. (1977)

Limonoat A-ring lakton terdapat pada bagian membran sel dari vesicle jeruk dan tidak memiliki rasa pahit tetapi ketika diekstraksi dan terjadi kontak dengan sari jeruk yang bersifat asam, senyawa ini terlaktonisasi menjadi limonoat dilakton yang memiliki rasa pahit. Perubahan limonin dari monolakton menjadi dilakton terjadi pada suasana pH 5,4-6,2 dan suhu

15-45oC. Proses ini dipengaruhi oleh aktivitas enzim limonoid D-ring lakton

hidrolase. Selama proses pasteurisasi dan evaporasi, adanya penambahan

panas akan mempercepat reaksi ini (Mozaffar et al. 2000). Mekanisme

terbentuknya rasa pahit pada buah jeruk disajikan pada Gambar 2.

Gambar 2. Mekanisme pembentukan rasa pahit pada buah jeruk Sumber : Eskin (1979) ; Li (2000)

Menurut Breksa dan Manners (2006), limonoid glukosida merupakan turunan bentuk ester ion cincin A dan D, misalnya glikosilasi pada posisi D-hidroksi dari ester ion limonoid D-ring. Senyawa limonoid aglikon dan limonoid glukosida disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Senyawa limonoid aglikon dan limonoid glukosida

Limonoid aglikon Limonoid glukosida

1. Limonin 2. Nomilin 3. Obacunone 4. Deacetylnomilin 5. Ichangin 6. Deoxylimonin 7. Deoxylimonol 8. Limonol

9. Limonyl acetate

10. 7α-Obacunol

11. 7α-Obacunyl acetate

12. Ichangensin 13. Citrusin

14. 1- (10-19)Abeo-obacun-

15. Calamina hydroxy-isoobacunoic acid

16. Retrocalamina

17. Cyclocalamina

18. Methyl isoobacunoate diosphenola

19. Methyl deacetylnomilinatea

20. 6-Keto-7β- deacetylnomilola

21. Methyl 6-hydroxy isoobacunoatea

22. Isocyclocalamina

23. Asam Deacetylnomilinic 24. Asam Nomilinic

25. Asam Isoobacunoic 26. Asam Epiisoobacunoic 27. Asam Isolimonic

28. Limonoic acid A-ring lactone 29. Asam Deoxylimonic

30. 17-Dehydrolimonoic acid A-ring lactone 31. Asam Trans-19- hydroxyobacunoic 32. Asam Calaminic

33. Asam Retrocalaminic 34.Asam Cyclocalaminic

35. Isoobacunoic acid diosphenola

36. Obacunoic acida 9 (11) -en-7α-yl acetate

37. 1- (10-19)Abeo-7o- acetoxy-lOβ-

1. Limonin 17-β-D-glukopiranosida

2. Nomilin 17-β-D-glukopiranosida

3. Deacetylnomilin 17-β

-D-glukopiranosida

4. Obacunone 17-β

-D-glukopiranosida

5. Asam Nomilinat 17-β

-D-glukopiranosida

6. Asam Deacetylnomilinat 17-β

-D-glukopiranosida

7. Obacunoat 17-β

-D-glukopiranosida

8. Asam Trans-obacunoat 17-β

-D-glukopiranosida

9. Asam Isoobacunoat 17-β

-D-glukopiranosida

10. Asam Epiisoobacunoat 17-β

-D-glukopiranosida

Keterangan : a diisolasi dari biji jeruk calamondin

Contoh senyawa limonoid glukosida disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Struktur molekul Limonin 17-β-D- glukopiranosida

Sumber : Hasegawa et al. (1997)

Senyawa limonoid terdapat pada jaringan buah dan biji jeruk yang

telah matang dalam bentuk turunan aglikon dan glukosida. Menurut Maier et

al. (1977), biji merupakan bagian yang paling banyak mengandung senyawa

limonoid, karenanya hampir semua proses isolasi dilakukan pada biji jeruk. Distribusi limonin dalam jeruk disajikan pada Gambar 4.

Gambar 4. Distribusi limonin dalam jeruk Sumber : Li (2000)

Menurut Mozaffar et al. (2000), limonin (Limonoate 3,19:16,

17-dilactone) adalah senyawa limonoid aglikon dengan rumus molekul C26H30O8

memiliki berat molekul 470,5 Da, titik didih 280 ºC, bersifat tidak larut dalam

air, tetapi larut dalam dimetilformamide, dichloromethane, acetonitrile, asam

asetat glasial, dan alkohol. Senyawa dengan bentuk kristal berwarna putih kekuningan ini ditemukan pada semua spesies jeruk, dengan kandungan tertinggi pada biji. Limonin merupakan senyawa dominan yang terdapat pada hampir semua varietas jeruk dan terakumulasi pada biji lemon, jeruk

Valencia, grapefruit dan jeruk siam. Menurut Maier et al. dalam Nagy et al. (1977), limonin terdekomposisi oleh asam kuat membentuk asam limoneksik yang tidak memiliki aktivitas antioksidan. Limonin juga bereaksi dengan basa pada pH 10-12 membentuk garam dari asam limonoat.

Limonin memiliki kelarutan yang terbatas dalam air yaitu < 40 mg/l, memiliki rasa pahit dan ditemukan dalam konsentrasi tinggi pada bagian jeruk yang tidak dapat dimakan seperti biji dan kulit. Konsentrasi limonin pada sari jeruk biasanya kurang dari 20 mg/l, tetapi pada konsentrasi 6 mg/l telah menimbulkan rasa pahit dan menyebabkan sari jeruk tidak diterima konsumen. Sebaliknya, limonoid glukosida larut air, tidak berasa dan ditemukan dalam sari jeruk dengan konsentrasi sebesar 720 mg/l (Breksa dan Dragull, 2008). Ozaki (1990) menambahkan biji jeruk mengandung sejumlah besar senyawa limonoid serta dapat melakukan biosintesis senyawa limonoid aglikon dan limonoid glukosida. Limonin mulai terbentuk pada awal pembentukan biji sedangkan limonoid glukosida terbentuk hanya pada biji

yang matang.

Limonin adalah komponen kimia yang mengandung furan. Banyak produk alami yang mengandung furan yang diperoleh dari tanaman telah terbukti meningkatkan sistem enzim detoksifikasi, glutathione S-transferase (GST) dan menghambat atau menghambat pembentukan kimia dari

karsinogenesis sehingga disebut suppresive agent. Aktivitas antikarsinogen

dari limonoid aglikon telah diteliti lebih lanjut. Penelitian menunjukkan limonoid aglikon (limonin, nomilin, obacunone, isoobacunone, ichangin) meningkatkan pembentukan enzim detoksifikasi glutathione S-transferase dan menghambat pembentukan tumor pada kulit, berbagai jaringan pada tikus dan pada hamster dengan cara mengkatalisis konjugasi glutathione yang menghambat pembentukan benzo [a] pyrene, salah satu penyebab kanker. Limonoid aglikon juga menghambat pembentukan, pertumbuhan dan perkembangan hormon-independen sel kanker payudara manusia dalam

jaringan (Hasegawa et al. dalam Shahidi, 2008). Hasil penelitian

menunjukkan limonin 17-D-glukopiranosida berfungsi sebagai anti kanker

menunjukkan bahwa limonoid pada jeruk menurunkan rasio kolesterol LDL/HDL dan mempercepat oksidasi LDL di usus sehingga membantu

mengurangi resiko penyakit penyumbatan pembuluh darah (Dandeekar et al.

2007).

2.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu proses untuk memisahkan komponen dari bahan berdasarkan kelarutan komponen tersebut dalam pelarut. Produk natural perlu dipisahkan dari biomassa melalui proses ekstraksi mengingat produk natural sangat beragam dan memiliki sifat fisikokimia yang berbeda maka diperlukan metode ekstraksi yang mengekstrak bahan yang diinginkan secara efisien. Metabolit sekunder dapat diekstraksi dari berabagai sumber alam, seperti tanaman, mikroorganisme, binatang laut, serangga dan hewan amfibi (Seidel, 2006).

Prosedur ekstraksi yang ideal harus dapat mengekstrak sebanyak mungkin senyawa yang diinginkan, juga harus cepat, sederhana dan efisien. Pemilihan metode ekstraksi didasarkan pada pengetahuan mengenai senyawa yang ingin diekstrak. Hal ini meliputi koefisien partisi dalam air atau pelarut organik, polaritas dari senyawa, stabilitas molekul dalam terang atau gelap, atau pada kondisi suhu tertentu. Apabila senyawa larut air biasanya diekstrak

dengan air atau larutan buffer sedangkan senyawa yang tidak larut air

diekstrak dengan pelarut organik. Untuk mempermudah proses ektraksi biasanya dilakukan proses preparasi pada bahan yang akan diekstraksi misalnya dengan pengeringan serta penghancuran dinding sel atau jaringan, hal ini dapat dilakukan dengan bantuan enzim, atau dengan pengecilan ukuran bahan (Jones, 2006).

Menurut Cseke et al. (2000), ekstraksi herbal secara tradisional

dilakukan menggunakan air, dimana untuk jaringan lunak seperti daun, bunga, akar atau buah dengan tekstur lembut yang memiliki kadar air tinggi (60-95%) dilakukan menggunakan air dingin atau panas dengan perlakuan fisik yang minimal. Sedangkan untuk jaringan dengan kandungan lignin tinggi dengan kadar air rendah (5-50%), perlu diberi perlakuan fisik seperti pengecilan ukuran, dengan air mendidih dan waktu ekstraksi yang lebih lama.

Apabila senyawa yang diinginkan tidak larut air karena bersifat non-polar, maka dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut organik (misalnya aseton, methanol, etanol, kloroform, dietil eter, metilen klorida atau kombinasi beberapa pelarut organik). Suhu ekstraksi tergantung titik didih pelarut yang digunakan dan sehingga harus disesuikan dengan peralatan yang digunakan.

Seidel (2006) menambahkan metode yang dapat digunakan yaitu maserasi, perkolasi dan soxhletasi. Maserasi dilakukan dengan cara merendam bahan dalam pelarut organik kemudian dilakukan pengadukan

menggunakan stirrer atau shaker untuk mempercepat ekstraksi. Proses

ekstraksi dihentikan ketika kondisi equilibrium tercapai antara konsentrasi metabolit dalam ekstrak dan dalam bahan. Ekstraksi perkolasi dilakukan

dengan melewatkan pelarut pada bahan yang disimpan dalam percolator yaitu

sebuah tabung dengan keran di bagian bawah. Metode ini memiliki beberapa kelemahan diantaranya membutuhkan pelarut yang banyak, waktu ekstraksi yang lama serta rendemen sedikit karena pelarut tidak merata ke seluruh bahan. Ekstraksi soxhletasi paling banyak digunakan untuk mengekstrak bahan dari tanaman karena prosesnya yang bersifat kontinyu. Ekstraksi ini menggunakan perangkat ekstraksi soxhlet, yang didasarkan pada metode

refluks dimana bahan disimpan dalam hull yang terbuat dari selulosa yang

diletakkan dalam tabung soxhlet yang berada di antara kondensor dan labu yang menampung pelarut. Pada proses ini, pelarut ditambahkan ke dalam labu dan suhu diatur sesuai titik didih pelarut, ketika mencapai titik didihnya, pelarut akan menguap dan terkondensasi sehingga terkumpul dalam labu soxhlet dan merendam bahan, setelah mencapai ketinggian tertentu, pelarut akan terefluks dan kembali ke labu pelarut di bagian bawah. Perangkat ekstraksi soxhlet disajikan pada Gambar 5.

Gambar 5. Perangkat ekstraksi soxhletasi

Sumber : Cseke et al. 2006

Ekstraksi juga dapat dilakukan menggunakan detergen (XAD-4, styrene-divinylbenzene), alkohol (metanol, etanol dan alkohol rantai panjang) dan dimetilsulfoksida untuk mengekstrak komponen yang diinginkan tanpa membunuh organisme yang mengandung komponen tersebut. Metode ini tergantung pada koefisien partisi dari pelarut yang digunakan, polaritas molekul yang akan diekstrak dan kemudahan pelarut untuk berpenetrasi ke dalam jaringan tanpa membunuh jaringan tersebut (Seidel, 2006).

Menurut Seidel (2006), ekstraksi ultrasonik atau disebut juga ultrasonifikasi, merupakan modifikasi dari ekstraksi maserasi, yaitu metode ekstraksi menggunakan suara dengan frekuensi tinggi untuk memisahkan senyawa fitokimia dari jaringan tanaman. Pada metode ini, bubuk tanaman disimpan dalam vial yang diletakkan dalam bak ultrasonik dan suara ultra digunakan untuk meningkatkan tekanan mekanik pada sel karena menyebabkan terbentuknya rongga dalam sel. Sonifikasi berlangsung lebih cepat dibanding metode ekstraksi biasa seperti soxhletasi atau maserasi, karena adanya gangguan pada partikel. Efisiensi ekstraksi tergantung pada

frekuensi instrumen, suhu dan lama ekstraksi. Metode ini digunakan untuk isolasi minyak essensial, polisakarida dan zat bioaktif fitokimia. Proses ultrasonifikasi dapat menimbulkan panas, sehingga sonifikasi komponen yang mudah rusak karena panas memerlukan tahapan proses untuk menjaga agar suhu komponen tetap dingin.

Ekstraksi dengan bantuan microwave dilakukan dengan cara meradiasi

sampel yang ditambah pelarut organik yang sesuai dengan kekuatan 100-150 W, biasanya dilakukan pada interval waktu yang pendek untuk mencegah

sampel mendidih. Ekstraksi dengan microwave memberikan rendemen yang

lebih tinggi dibanding ekstraksi konvensional (Cseke et al. 2000).

Ekstraksi superfluida critical, biasanya menggunakan CO2 sebagai

pelarut, ekstraksi ini digunakan pada proses dekafeinasi kopi arabika dalam

skala besar. Kondisi supercritical tercapai ketika tekanan dan suhu sama atau

melebihi titik kritis (31oC dan 73 atm untuk CO2) dimana pada kondisi ini

CO2 tidak berupa gas atau cairan tetapi merupakan antara dua fase tersebut

yang menyebabkan superfluida critical memberikan kondisi ideal untuk

ekstraksi komponen (Cseke et al. 2000).

Gaikar dan Dandeekar (2001) mengajukan paten mengenai ekstraksi curcuminoid menggunakan larutan hidrotrop. Ekstraksi ini disebut ekstraksi hidrotropik dimana pelarut yang digunakan adalah larutan dari garam hidrotrop. Hidrotrop adalah komponen ampifilik berupa alkil rantai pendek yang larut air, yang dihasilkan dari sulfonasi hidrokarbon aromatik. Hidrotrop digunakan sebagai agen ganda untuk melarutkan zat yang tidak larut dalam air dan zat–zat yang kurang larut pada produk pembersih rumah tangga, perawatan tubuh. Fungsi hidrotrop adalah menstabilkan larutan, memodifikasi viskositas dan titik awan, membatasi pemisahan fase pada suhu rendah dan mengurangi busa. Meskipun bukan sebagai surfaktan, hidrotrop merupakan senyawa ampifilik yang mempunyai gugus hidrofob dan hidrofil. Bagian hidrotrop yang bersifat hidrofob adalah benzene, yaitu metal benzene (nama umum: toluene, dimetil benzene (xilene) dan metal etil benzene (cumene) yang non-polar. Bagian hidrofilik yang bersifat polar adalah gugus sulfonat anionic yang terikat pada ion seperti natrium, ammonium, kalsium dan

kalium. Hidrotrop bukan surfaktan tapi digunakan untuk melarutkan komponen yang tidak larut air, menstabilkan larutan, memodifikasi viskositas. Larutan hidrotop bekerja dengan cara berpenetrasi ke dalam dinding sel, menghancurkan struktur dinding sel sehingga membuat bahan yang diinginkan lebih mudah larut.

2.3 Teknik Separasi

Setelah dilakukan ekstraksi, suatu komponen biasanya terdapat dalam bentuk cair berupa ekstrak untuk itu perlu diubah menjadi bentuk padat atau bentuk lain yang lebih mudah digunakan. Hal ini dapat dilakukan dengan cara presipitasi, biasanya dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah pelarut ke dalam ekstrak dimana kelarutan komponen dalam pelarut tersebut rendah sehingga komponen kemudian mengendap. Hasil presipitasi biasanya masih mengandung banyak pengotor karena itu perlu dilakukan metode separasi untuk memisahkan komponen menjadi bentuk yang lebih murni. Dalam hal ini, separasi tidak berarti menghasilkan bahan yang betul-betul murni, tetapi

kadar pengotor berada pada batas yang diperbolehkan (Florence et al. dalam

Sarker et al. 2006). Beberapa metode separasi antara lain :

1. Destilasi

Salah satu cara yang paling banyak diaplikasikan dalam purifikasi cairan atau bahan organik dengan titik didih rendah adalah destilasi fraksional pada tekanan atmosfer atau tekanan rendah. Efisiensi proses destilasi tergantung pada titik didih senyawa yang ingin dimurnikan serta pengotornya. Apabila pengotor bersifat non-volatil maka destilasi sederhana sudah cukup tetapi apabila pengotor bersifat volatil maka destilasi perlu dilakukan bertahap menggunakan kolom yang efisien (Armarego & Perrin, 2000).

2. Presipitasi

Menurut Noor (2002), presipitasi adalah salah satu metode langsung pemisahan solut, dalam proses ini dihasilan produk non-kristal yang menyerupai gumpalan presipitat yang dihasilkan umumnya belum murni.

Prinsip pemisahannya adalah dengan pengaturan kondisi lingkungan seperti suhu, pH, konstanta dielektrik, kekuatan ion atau komposisi.

Salah satu cara paling mudah dalam teknik kristalisasi adalah ketika suatu komponen sangat larut dalam pelarut pertama dan tidak larut dalam pelarut kedua. Penambahan secara sedikit demi sedikit pelarut kedua pada larutan yang mengandung bahan dan pelarut pertama akan menyebabkan terbentuknya kristal karena kelarutan bahan menjadi menurun. Ada beberapa kelemahan dari teknik ini, pertama kedua pelarut harus bercampur, kedua bahan yang dikristalisasi harus memiliki kelarutan seperti disebutkan sebelumnya (Mayo, 2001).

3. Kromatografi

Ada beberapa jenis kromatografi yang dapat digunakan, yaitu : 1. Low Preasure Liquid Chromatography (LPLC)

Pada metode ini, separasi berlangsung melalui distribusi selektif pada fase mobile berupa pelarut organik dan fase stasioner dapat berupa silika gel, alumina, polistyrene. Separasi didasarkan pada perbedaan afinistas adsorpsi dari molekul pada permukaan fase stasioner, yang dipengaruhi oleh ikatan hidrogen, ikatan van der walls, interaksi dipol,

sifat asam-basa (Reld dan Sarker dalam Sarker et al. 2006).

2. Ion-exchange Chromatography

Proses ion-exchange didasarkan pada ikatan reversible molekul kation

atau anion pada resin matriks insoluble melalui pertukaran ion yang berlawanan. Pemilihan jenis resin dan pengaturan kondisi pH dapat dilakukan untuk memilih molekul yang akan diionisasi (Durham dalam Sarker et al. 2006).

3. High-Speed Counter Current Chromatography

Metode ini digunakan untuk mengisolasi komponen yang tidak stabil atau sensitif. Media yang akan kontak dengan sampel terdiri dari pelarut dan tabung Teflon. Pelarut yang digunakan dalam sistem dua-fase yang digunakan disesuaikan dengan sampel yang ingin diisolasi (McApline

4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC terdiri dari fase stasioner, instrument dan pelarut yang digunakan. Purifikasi komponen menggunakan HPLC biasanya

menggunakan salah satu dari empat tipe berikut : normal-phase,

reversed-phase, gel permeation gel dan ion exchange kromatografi. Tipe ini ditentukan oleh fase stasioner dan kolom preparative yang

digunakan (Latif dalam Sarker et al. 2006).

2.4 Penelitian Terdahulu

Penelitian mengenai senyawa limonoid telah banyak dilakukan untuk beberapa tujuan yaitu menghilangkan rasa pahit pada sari jeruk, menandai taksonomi dari tanaman jeruk karena setiap varietas tanaman jeruk memiliki kandungan dan jenis senyawa limonoid yang khas. Dewasa ini, penelitian mengenai senyawa limonoid terutama limonin dilakukan untuk mengisolasi dan memproduksi limonin dari jeruk karena diketahui limonin memiliki aktivitas biologis sebagai senyawa anti kanker dan permintaan akan senyawa ini semakin meningkat. Beberapa hasil penelitian mengenai limonin disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Beberapa penelitian tentang limonin

No Peneliti, tahun Hasil Penelitian

1 Konno et al.

1982

Penambahan 0,5% β-siklodekstrin mampu mengurangi rasa pahit sampai setengahnya, berdasarkan pengukuran menggunakan NMR β-siklodekstrin membentuk kompleks dengan senyawa limonin dan naringin.

2 Mitchell, 1985 Paten proses pengurangan kandungan limonin dan naringin menggunakan resin anion exchange basa lemah dengan matrik polimer stirene yang mengandung gugus fungsional turunan mono atau poli amine. Paten ini diberi judul “Upflow Ion Exchange Treatment Of Natural Edible Juices Containing High Acidity And Suspended Solids”. Perlakuan ion exchange juga mengurangi kandungan asam pada sari jeruk tetapi tidak mempengaruhi kandungan nutrisi atau flavor yang diinginkan dari sari jeruk.

Tabel 2. Lanjutan

3 Ozaki et al. 1990 Pengukuran konsentrasi limonoid glukosida pada bagian biji beberapa varietas jeruk yaitu grapefruit (Citrus paradisi), lemon (C limon), jeruk Valencia (C. sinensis), tangerine (C reticulata), Fukuhara (C sinensis Osbeck Hort.), Hyuganatsu (C tamurana Hort. ex Tanaka), Shimamikan (C. kinokuni Hort. Ex Tanaka) dan Sanbokan (C. sideata

Hort. ex Takahashi). Semua biji jeruk tersebut mengandung 17 –D-glukopiranosida dari limonin, nomilin, obakunon, deasetilnomilin, asam nomilinat dan asam deasetilnomilinat. Kandungan total limonoid glukosida berkisar antara 0,31 to 0,87% dari biji jeruk kering. Kandungan nomilin glukosida tertinggi terdapat pada biji.

4 Pifferi et al. 1993 Ekstraksi limonin dari biji lemon dengan metode soxhletasi bertahap menggunakan pelarut petroleum eter diikuti dengan aseton, menghasilkan limonin sebesar 0,732 mg/g biji lemon kering.

5 Ifuku et al. 1998 Paten produksi limonoid glukosida menggunakan supercritical fluida dimana larutan yang mengandung limonid glukosida diletakkan di dalam tangki ekstraksi dari peralatan supercritical karbondioksida yang dioperasikan selama 20 menit dengan laju 4 gram per menit pada suhu 40oC dan tekanan 300 kg/cm2 untuk menghilangkan pengotor dari limonoid glukosida.

6 Yu, J. 2004 Ekstraksi limonin aglikon dan glukosida dari biji grapefruit

menggunakan supercritical CO2 pada kondisi optimum tekanan -48,3 MPa selama 60 menit, kecepatan alir 5 l/menit, menghasilkan rendemen limonin 6,3 mg limonin/biji grapefruit kering, ekstraksi limonin glukosida pada kondisi optimum tekanan -42 Mpa, 45% etanol selama 40 menit, kecepatan alir 5 l/menit menghasilkan rendemen 0,73 mg limonin glukosida/g biji grapefruit kering.

Tabel 2. Lanjutan

7 Manners dan

Breksa, 2006

Paten mengenai produksi dan isolasi senyawa limonoid dari jeruk menggunakan kromatografi ion exchange anion (amin kuartener) kuat.

8 Dandekar et al.

2007

Ekstraksi hidrotropik menggunakan dua hidrotrop yaitu garam natrium salisilat (Na-Sal) dan natrium cumene sulfonat (Na-CuS) dengan rancangan percobaan menggunakan analisis respon permukaan (Response Surface Analysis–RSA) dengan rancangan Box-Behnken. Ekstraksi dilakukan dengan variabel konsentrasi larutan hidrotrop, suhu ekstraksi dan persen bahan yang diekstrak. Hasil penelitian menunjukkan rendemen limonin paling tinggi diperoleh pada kondisi konsentrasi larutan 2 M, suhu 45oC dan persen bahan 10% dimana larutan Na-CuS menghasilkan limonin 0,65 mg/g biji jeruk sedangkan larutan Na-Sal menghasilkan 0,46 mg/g biji jeruk.

9 Breksa & Dragull, 2008

Pemisahan limonin dari limonoid glukosida menggunakan HPLC kolom C-18 flash

18

III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Kerangka Pemikiran

Limonin memiliki manfaat bagi kesehatan, diantaranya dapat menghambat pertumbuhan tumor, menurunkan rasio kolesterol LDL/HDL, mengurangi resiko penyakit penyumbatan pembuluh darah karenanya limonin memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Limonin terdapat pada semua bagian buah jeruk seperti biji, kulit ari dan sari jeruk dengan kandungan terbesar terdapat pada bagian jeruk yang tidak dapat dimakan yaitu biji jeruk. Oleh karena itu, limbah pembuatan sari jeruk berpotensi sebagai sumber bahan baku untuk isolasi limonin dan diharapkan dapat memberikan nilai tambah pada industri pembuatan sari jeruk.

Isolasi limonin dilakukan dari limbah pembuatan sari jeruk meliputi air

backwash, kulit ari dan biji jeruk. Kandungan limonin pada permeat dan retentat hasil mikrofiltrasi sari jeruk rendah sehingga menimbulkan dugaan bahwa limonin tertahan pada membran karena membentuk senyawa

kompleks. Pencucian membran dengan metode backwash dilakukan untuk

membersihkan membran, mengembalikan fluksi membran serta memperoleh

limonin yang tertahan pada permukaan membran. Isolasi limonin dari air

backwash dilakukan dengan dua metode metode ekstraksi endapan dari hasil

sentrifugasi air backwash dan ekstraksi cair-cair dari air backwash. Ekstraksi

endapan menggunakan pelarut yaitu diklorometan dan aseton, sedangkan ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut diklorometan. Isolasi limonin dari biji dan kulit ari dilakukan dengan ekstraksi soxhletasi bertahap menggunakan pelarut heksan kemudian aseton. Pengukuran kandungan

limonin dalam air backwash, kulit ari dan biji jeruk dilakukan dengan metode

spektrofotometri.

Selanjutnya isolasi limonin dilakukan dari bahan dengan kandungan limonin paling tinggi yaitu biji jeruk. Optimasi proses ekstraksi dilakukan

pada tahap presipitasi dengan metode respon permukaan atau response

19

dua faktor yaitu rasio volume ekstrak aseton dengan pelarut heksan serta lama presipitasi.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian telah dilaksanakan pada bulan April sampai Oktober 2009 di Laboratorium di lingkungan Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian IPB dan Laboratorium di lingkungan Balai Besar Pasca Panen Departemen Pertanian.

3.3 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1. Bahan baku berupa jeruk Pontianak

2. Bahan kimia untuk esktraksi limonin yang terdiri dari heksan, aseton,

diklorometan, isopropanol.

3. Bahan kimia untuk analisis yang terdiri dari : etanol PA, 4-dimethylamino

benzaldehide, asam asetat glasial, asam perklorat, kloroform, limonin standar, dan acetonitrile.

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pulper, penyaring ukuran 65 mesh, 150 mesh dan 200 mesh, membran mikrofiltrasi

polipropilen (ukuran 0,1 µm), spektrofotometer, alat sentrifugasi, rotary

evaporator vakum, termometer, oven, timbangan analitik, corong pemisah, perangkat ekstraksi soxhlet dan alat-alat gelas.

3.4 Tahapan Penelitian

Penelitian ini terdiri dari penelitian pendahuluan dan penelitian utama, penelitian pendahuluan terdiri dari empat tahap, dengan tahapan penelitian sebagai berikut :

1. Penelitian Pendahuluan

Tahap 1. Persiapan Bahan Baku

Bahan baku yang digunakan adalah jeruk Pontianak (Citrus nobilis L. var

20

1. Sortasi

Sortasi bertujuan untuk memisahkan buah yang digunakan agar diperoleh buah jeruk yang baik dan tidak busuk.

2. Pencucian dan Pengupasan Kulit Buah

Pencucian bertujuan untuk membersihkan kulit buah dari kotoran-kotoran seperti tanah dan lumpur serta sisa pestisida yang melekat. Selanjutnya dilakukan pengupasan kulit buah agar minyak yang terkandung di dalam kulit tidak terbawa ke dalam sari buah.

3. Ekstraksi

Jeruk yang telah dicuci dan dikupas selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin pulper untuk memperoleh sari jeruk. Sari jeruk ditampung di dalam wadah, sedangkan ampasnya yang berupa biji dan pulp langsung terpisah.

4. Penyaringan

Penyaringan dilakukan untuk memisahkan serat, pulp serta biji yang dapat menghambat proses pemisahan dengan membran mikrofiltrasi. Penyaringan dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu :

- Penyaringan pertama dilakukan menggunakan saringan santan

- Penyaringan kedua dilakukan menggunakan saringan 100 mesh.

- Penyaringan ketiga menggunakan saringan 150 mesh.

- Penyaringan keempat menggunakan saringan 200 mesh.

5. Pasteurisasi

Pasteurisasi sari jeruk bertujuan untuk inaktivasi enzim dan membunuh mikroorganisme yang dapat menyebabkan fermentasi dan kerusakan pada sari jeruk. Pada penelitian ini, pasteurisasi dilakukan menggunakan suhu

70ºC selama 10 menit.Diagram proses persiapan bahan baku disajikan pada

Gambar 6.

Tahap 2. Mikrofiltrasi Sari Jeruk

Penyaringan sari jeruk dilakukan menggunakan membran mikrofiltrasi yang dilakukan pada kondisi operasi laju alir 0,08 m/det yang didasarkan pada hasil penelitian Agihitsni (2008). Skema proses mikrofiltrasi sari jeruk disajikan pada Gambar 7.

21

22 E-1 E-2 V-1 P I-1 E-3 V-2 P I-2 V-3 V-4 V-5 V-6 V-7 S1 S2 S3 T1 T2 S4 Keterangan :

E-1 = tangki umpan E-2 = pompa

E-3 = membran ultrafiltrasi I-1 = pressure gauge in I-2 = pressure gauge out

V-1, V-2 = katup pengatur tekanan dan laju alir V-3, V-4, V-5 = three way valve

V-6 = katup sampling permeat V-7 = katup sampling retentat S1,S2,S3,S4 = Selenoid

T1, T2 = timer elektronik

Selenoid merupakan valve elektronik, timer T1 mengatur S1 dan S3 yang merupakan pengatur selang periode (frekuensi) backwash, sedangkan timer T2 mengatur S1 dan S2 yang menentukan lamanya (durasi) backwash

Gambar 7.Skema proses mikrofiltrasi sari jeruk

Sumber : Noor et al. (2007)

Tahap 3. Backwash Membran Mikrofiltrasi

Pencucian membran mikrofiltrasi dilakukan untuk mendapatkan limonin yang diduga tertahan pada membran yang dilakukan dengan metode

backwash menggunakan akuades. Skema proses backwash membran disajikan pada Gambar 8.

Gambar 8.Skema proses backwash membran

Sumber : Noor et al (2007)

E-1 E-2 V-1 P I-1 E-3 V-2 P I-2 V-3 V-5 V-6 V-7 Keterangan :

E-1 = tangki umpan E-2 = pompa

E-3 = membran mikrofiltrasi I-1 = pressure gauge in I-2 = pressure gauge out

V-1, V-2 = katup pengatur tekanan dan laju alir V-3, V-4, V-5 = three way valve

V-6 = katup sampling permeat V-7 = katup sampling retentat

23 Tahap 4. Isolasi Limonin

Isolasi limonin dilakukan pada air backwash, kulit ari dan biji jeruk.

a. Isolasi Limonin Dari Air Backwash

Ekstraksi limonin dari air backwash dilakukan dengan dua metode :

1. Metode pertama adalah maserasi endapan air backwash. Pada metode ini,

air backwash sebanyak 3 liter disentrifugasi pada 7000 rpm pada suhu

4oC, selama 20 menit sehingga menghasilkan endapan sebesar 12 g, yang

selanjutnya dimaserasi menggunakan dua jenis pelarut yaitu aseton dan diklorometan sebanyak 200 ml selama 4 jam pada suhu ruang. Pelarut

selanjutnya diuapkan dengan rotary evaporatorvacuum pada suhu 40 oC.

Ekstrak pelarut sebesar 20 ml kemudian ditambahkan heksan sebanyak

tiga kali volume ekstrak. Diagram proses maserasi endapan air backwash

disajikan pada Gambar 9.

Gambar 9. Diagram proses maserasi endapan air backwash dengan pelarut aseton

24

2. Metode ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut diklorometan dengan

menggunakan corong pemisah. Ekstraksi 2 liter air backwash dengan 100

ml dengan diklorometan dilakukan menggunakan corong pemisah dimana

200 ml air backwash ditambahkan dengan 100 ml pelarut selanjutnya

dilakukan pengocokan supaya limonin yang terdapat pada fase air dapat pindah ke fase diklorometan. Kemudian didiamkan selama 15 menit sampai terbentuk dua fase dimana bagian bawah adalah diklorometan dan bagian atas adalah air. Kedua fase tersebut lalu dipisahkan kemudian fase diklorometan dipresipitasi dengan cara ditambahkan heksan sebanyak tiga kali volume pelarut lalu didiamkan selama 20 jam pada suhu refrigerasi.

Ekstraksi air backwash dengan metode ekstraksi cair-cair disajikan pada

Gambar 10.

Gambar 10. Diagram proses ekstraksi air backwash dengan metode ekstraksi

cair-cair

b. Isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp jeruk

Isolasi limonin juga dilakukan dari bagian jeruk yang lain yang diduga mengandung limonin seperti biji jeruk dan kulit ari, sisa penyaringan jeruk

tahap awal (pulp) jeruk. Biji jeruk dan kulit ari dikeringkan menggunakan

oven blower suhu 50oC sampai berat kedua bahan tersebut konstan

kemudian dilakukan pengecilan ukuran menggunakan hammer mill.

Selanjutnya biji dan kulit ari jeruk diekstraksi secara bertahap, tahap pertama menggunakan heksan yang bertujuan untuk menghilangkan

25

jeruk, tahap kedua menggunakan aseton yang bertujuan untuk mengekstrak limonin dengan menggunakan perangkat ekstraksi soxhlet. Proses isolasi dilakukan dengan 2 cara yaitu dengan pencucian etanol dan tanpa pencucian etanol. Diagram proses isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp jeruk tanpa pencucian etanol disajikan pada Gambar 11.

Gambar 11. Diagram proses isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp

jeruk tanpa pencucian etanol

26

Diagram proses isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp jeruk dengan pencucian menggunakan etanol disajikan pada Gambar 12.

Gambar 12. Diagram proses isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp jeruk

dengan pencucian etanol

27

2. Penelitian Utama

Pada penelitian utama dilakukan optimasi proses isolasi limonin dari bahan baku dengan kandungan limonin paling tinggi yaitu biji jeruk dengan metode ekstraksi tanpa pencucian dengan etanol. Optimasi dilakukan pada tahap proses presipitasi dengan dua faktor yaitu rasio ekstrak aseton dan pelarut heksan dengan rentang 1:3 – 1:5 (v/v) dan lama presipitasi pada rentang waktu 16-24 jam. Presipitasi dilakukan pada kondisi suhu refrigerasi. Diagram proses optimasi isolasi limonin dari biji jeruk siam disajikan pada Gambar 13.

3.5 Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan optimasi ekstraksi limonin menggunakan

metode permukaan respon (respon surface method). Faktor yang dianalisis ada

dua yaitu:

1. Rasio volume ekstrak aseton : pelarut heksan dengan rentang 1:3 – 1:5 (v/v)

2. Lama presipitasi dengan rentang 16-24 jam. Dengan basis percobaan 81 gram biji jeruk kering. Desain rancangan percobaan disajikan pada Tabel 2.

Tabel 3. Desain rancangan percobaan

No. Rasio volume

pelarut heksan Lama presipitasi (jam)

Kode Variabel

X1 X2

1 3 16 -1 -1

2 5 24 1 -1

3 3 16 -1 1

4 5 24 1 1

5 2,6 20 -1.41 0

6 5,4 20 1.41 0

7 4 14 jam 21 menit 0 -1.41

8 4 25 jam 40 menit 0 1.41

9 4 20 0 0

28

Respon utama (parameter) yang dianalisis adalah konsentrasi limonin yang diperoleh (Y). Model rancangan percobaan faktorial untuk mengetahui pengaruh dari kedua faktor terhadap respon yang diinginkan adalah sebagai berikut:

2 1 5 2 2 4 2 1 3 2 2 1 1

0

a

x

a

x

a

x

a

x

a

x

x

a

Y

=

+

+

+

+

+

Keterangan :

Y = Jumlah limonin (mg)

a0, a1, a2, a3, a4, a5 = Koefisien regresi

X1 = Pengaruh linier faktor rasio volume ekstrak aseton

dan heksan

X2 = Pengaruh linier faktor lama presipitasi

X1X2 = Pengaruh linier interaksi faktor rasio volume

ekstrak aseton dan heksan serta lama presipitasi

X12 = Pengaruh kuadratik faktor rasio volume ekstrak

aseton dan heksan

29 Biji jeruk

Pengeringan, T 50oC ±5oC, T 24 Jam

Pengecilan Ukuran

Ekstraksi Dengan aseton Menggunakan Soxhlet Selama 10 Jam

Evaporasi Suhu 40OC

Optimasi Presipitasi Dengan Faktor Rasio Ekstrak Aseton : Pelarut Heksan = 1:301:5 Dan Lama Presipitasi 16024 Jam

Kristal limonin

Ekstraksi dengan heksan Menggunakan Soxhlet Selama 10 Jam

Purifikasi dengan diklorometan : isopropanol = 1 : 3, t=16 jam Presipitat

Bubuk Biji jeruk kering

Gambar 13. Optimasi proses isolasi limonin dari biji jeruk

30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Limonin dari Air Backwash, Kulit Ari, Biji dan Sisa Penyaringan Awal (Pulp)

Berdasarkan hasil penelitian Setyadjit (2006) terhadap beberapa varietas jeruk yang beredar di Indonesia, konsentrasi limonin paling tinggi

terdapat pada sari jeruk nipis yaitu 16,25 µg ml-1, sari jeruk siam menempati

tempat kedua dengan kandungan limonin sebesar 13,70 µg ml-1, kemudian sari

jeruk Medan, 4,30µg ml-1, sari jeruk Argentina 3,13 µg ml-1 sedangkan sari

jeruk sunkist tidak mengandung limonin.

Mikrofiltrasi sari jeruk yang didasarkan pada penelitian Aghitsni (2008) telah berhasil menghilangkan rasa pahit pada sari jeruk dimana kandungan limonin pada sari jeruk hasil mikrofiltrasi yaitu permeat dan retentat berada di

bawah batasan konsentrasi yang dapat diterima konsumen yaitu 6 7g ml-1

(Mozaffar 1998). Konsentrasi limonin pada permeat dan retentat disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4. Konsentrasi limonin dalam permeat, retentat dan air backwash

Hasil analisis kandungan limonin pada Tabel 4 menunjukkan kandungan limonin pada sari jeruk berbeda dengan hasil penelitian Setyadjit (2006), hal ini bisa dikarenakan perbedaan masa panen jeruk siam dimana jeruk siam yang dipanen pada musim kemarau memiliki kandungan limonin lebih tinggi. Limonin merupakan metabolit sekunder dan diduga kandungannya akan semakin tinggi apabila jeruk menerima tekanan dari lingkungan sekitar.

Penurunan kandungan limonin pada permeat maupun retentat hasil mikrofiltrasi menimbulkan dugaan senyawa-senyawa tersebut tertahan di dinding membran. Tertahannya limonin dan naringin pada membran juga

Konsentrasi (ppm)

Sari jeruk 13,061

Permeat 2,347

Retentat 3,980

ditunjukkan oleh konsentrasi keluaran di retentat yang tidak jauh berbeda

dengan konsentrasi pada permeat, diduga limonin membentuk lapisan cake

pada permukaan membran akibat polarisasi konsentrasi. Untuk memperoleh limonin yang diduga tertahan pada membran dilakukan pencucian membran

dengan metode backwash menggunakan akuades. Air backwash selanjutnya

dianalisis dengan metode spektrofotometer berdasarkan metode Abbasi et al.

(2005) yang telah dimodifikasi oleh Setyadjit (2005). Analisis limonin dari air

backwash menunjukkan bahwa air backwash mengandung limonin sebesar 5,715 ppm karenanya pada penelitian pendahuluan dilakukan isolasi limonin

dari air backwash.

Mikrofiltrasi juga menghasilkan produk samping seperti biji jeruk, kulit ari dan sisa penyaringan awal (pulp) yang juga diduga mengandung limonin. Oleh karena itu pada penelitian pendahuluan dilakukan isolasi limonin dari biji jeruk, kulit ari dan pulp. Analisis limonin dilakukan menggunakan alat

spektrofotometer berdasarkan metode Abbasi et al. (2005) yang telah

dimodifikasi oleh Setyadjit (2005). Meskipun jumlah laporan yang menggunakan metode spektrofotometri untuk analisis limonin relatif sedikit tetapi metode ini memiliki kelebihan yaitu sederhana sehingga mudah diaplikasikan misalnya pada proses pengawasan mutu pada industri

pembuatan sari jeruk (Abbasi et al. 2005). Metode ini menggunakan pelarut

kloroform untuk menghilangkan senyawa polar pada bahan yang dianalisis serta menggunakan reagen burham yang terdiri dari asam asetat glasial, asam perklorat dan 4-dimetilaminobenzaldehid, yang bereaksi dengan limonin menghasilkan warna kuning-orange sampai merah yang kemudian diamati nilai absorbansinya pada panjang gelombang 503 nm. Masing-masing senyawa limonoid dibedakan dari komponen yang terikat pada cincin A dan D, sehingga diduga reagen burham bereaksi secara spesifik dengan cincin A dan D dari limonin yang merupakan senyawa lakton. Semakin tinggi kandungan limonin, warna yang dihasilkan semakin mendekati warna merah dan nilai absorbansi semakin tinggi. Menurut Harris (1999), pada panjang gelombang 470-500, warna yang diserap adalah biru-hijau dan warna yang tampak adalah merah.

Struktur molekul limonin dan beberapa turunannya disajikan pada Gambar 14.

Gambar 14. Struktur molekul limonin dan beberapa turunannya

Sumber : Maier et al. dalam Nagy et al. (1977); Li (2000)

1. Isolasi Limonin dari Air Backwash.

Isolasi limonin dari air backwash dilakukan dengan dua metode yaitu

ekstraksi maserasi sludge hasil sentrifugasi air backwash dan ekstraksi

cair-cair.

a. Ekstraksi Maserasi Endapan Hasil Sentrifugasi Air Backwash

Limonin tidak larut dalam air karenanya dilakukan sentrifugasi pada air backwash yang bertujuan untuk mengendapkan limonin. Sentrifugasi memanfaatkan adanya perbedaan densitas antara padatan dan cairan. Bila suspensi dibiarkan maka padatan yang mempunyai densitas lebih besar perlahan-lahan akan mengendap karena pengaruh gravitasi namun

pengendapan ini dapat dipercepat dengan adanya gaya sentrifugal dengan

proses sentrifugasi (Noor, 2002). Sentrifugasi air backwash dilakukan

dengan kecepatan 7000 rpm suhu 4oC selama 20 menit. Hasil sentrifugasi

3 liter air backwash diperoleh endapan sebesar 12 gram. Endapan

selanjutnya dimaserasi, pertama menggunakan pelarut aseton dan kedua menggunakan diklorometan, pada kondisi suhu ruang selama 4 jam.

Perangkat ekstraksi dilengkapi dengan magnetik stirer untuk mempercepat

proses ekstraksi serta pendingin balik untuk mencegah pelarut menguap. Maserasi hasil sentrifugasi disajikan pada Gambar 15.

Gambar 15. Ekstraksi maserasi hasil sentrifugasi air backwash

Maserasi endapan menggunakan pelarut aseton tidak dapat

mengisolasi limonin. Endapan hasil sentrifugasi air backwash sebagian

besar terdiri dari air, sehingga menyisakan fase air ketika aseton diuapkan dengan cara evaporasi. Selanjutnya ketika dilakukan presipitasi dengan penambahan pelarut heksan, air tidak dapat bercampur dengan heksan sehingga tidak diperoleh endapan, hal ini bertentangan dengan prinsip

presipitasi menurut Mullin (2001) yang menyatakan bahwa kedua pelarut yang digunakan dalam proses presipitasi harus dapat bercampur.

Maserasi endapan juga dilakukan dengan pelarut diklorometan pada kondisi suhu ruang selama 4 jam. Diklorometan tidak bercampur dengan air sehingga limonin yang terdapat dalam endapan diharapkan dapat berpindah dari fase air dalam endapan ke fase diklorometan. Selanjutnya dilakukan pemisahan antara fase diklorometan dengan air dengan cara dekantasi karena fase diklorometan bagian bawah air. Kemudian pada proses presipitasi dihasilkan sedikit endapan karena diklorometan bercampur dengan heksan, tetapi ketika endapan hasil ekstraksi tersebut

dianalisis menggunakan metode spektrofotometri, hasil analisis

menunjukkan kandungan limonin tidak terdeteksi. Hal ini diduga karena

kandungan limonin dalam air backwash yang terlalu rendah menyebabkan

limonin tidak dapat diendapkan.

Menurut Noor (2002), presipitasi biasanya digunakan untuk larutan dengan kandungan senyawa yang ingin diendapkan sebesar 0,1-5% (berat),

sedangkan kandungan limonin dalam air backwash hanya sebesar 5,715

ppm, hal ini menyebabkan limonin dalam air backwash tidak dapat

diendapkan.

b.Ekstraksi Cair-cair Air Backwash

Metode lain yang dilakukan untuk mengisolasi limonin dari air

backwash adalah dengan ekstraksi cair-cair. Menurut Khopkar (1998), metode ekstraksi cair-cair adalah suatu metode dimana suatu larutan (biasanya dalam air) dibuat bersentuhan dengan pelarut kedua (biasanya pelarut organik), yang tidak bercampur dengan pelarut pertama dan menimbulkan perpindahan satu atau lebih zat terlarut (solut) ke dalam pelarut kedua. Proses ekstraksi cair-cair ini dilanjutkan dengan proses presipitasi menggunakan pelarut heksan sehingga perlu dipilih pelarut yang dapat melarutkan limonin, tidak bercampur dengan air saat proses ekstraksi cair-cair dan dapat bercampur dengan heksan saat proses presipitasi. Atas dasar hal tersebut maka pelarut yang dipilih adalah diklorometan, karena diklorometan dapat melarutkan limonin, tidak

bercampur dengan air backwash tetapi dapat bercampur dengan heksan pada saat presipitasi.

Ekstraksi cair-cair dilakukan menggunakan corong pemisah dimana

200 ml air backwash ditambahkan dengan 100 ml pelarut selanjutnya

dilakukan pengocokan supaya limonin yang terdapat pada fase air dapat pindah ke fase diklorometan. Selanjutnya campuran kedua larutan didiamkan selama 15 menit sampai terbentuk dua fase dimana bagian bawah adalah diklorometan dan bagian atas adalah air. Kedua fase tersebut lalu dipisahkan kemudian fase diklorometan dipresipitasi dengan cara ditambahkan heksan sebanyak tiga kali volume pelarut organik lalu didiamkan selama 20 jam pada suhu refrigerasi. Proses ekstraksi cair-cair disajikan pada Gambar 16.

Gambar 16. Proses ekstraksi cair-cair

Tabel 5. Hasil analisis isolasi limonin dari air backwash

Metode Jenis pelarut Hasil analisis

Maserasi endapan Diklorometan Limonin tidak terdeteksi

Aseton _{Limonin tidak terdeteksi}

Ekstraksi cair-cair Diklorometan _{Limonin tidak terdeteksi}

Ekstraksi dengan pelarut diklorometan menghasilkan presipitat putih

yang kemudian dilarutkan dalam acetonitrile sebanyak 0,1 ml dan setelah

dianalisis dengan menggunakan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 503 nm, hasil analisis menunjukkan kandungan limonin pada endapan tersebut tidak terdeteksi.

2. Isolasi Limonin Dari Biji, Kulit Ari dan Sisa Penyaringan Awal Sari Jeruk (Pulp)

Isolasi limonin juga dilakukan dari bagian jeruk yang lain yang diduga mengandung limonin seperti biji jeruk dan kulit ari, sisa

penyaringan jeruk tahap awal (pulp) jeruk dengan metode ekstraksi

bertahap menggunakan perangkat ekstraksi soxhlet. Menurut Noor (2002), proses ekstraksi bertahap dilakukan apabila ekstraksi curah tidak dapat memberikan pemisahan yang cukup atau fraksi produk yang diperoleh tidak mencukupi. Untuk mempermudah proses ekstraksi, bahan yang akan

diekstraksi diberikan perlakuan pendahuluan yaitu pengeringan

menggunakan oven blower suhu 50oC sampai berat bahan tersebut

konstan, selanjutnya dilakukan pengecilan ukuran menggunakan hammer mill. Menurut Seidel (2006), pengeringan bertujuan untuk mengurangi kandungan air pada bahan karena adanya air dapat menghambat penetrasi pelarut ke dalam bahan dan menyebabkan ekstraksi tidak efisien sedangkan pengecilan ukuran bertujuan untuk menambah luas permukaan dan mempermudah penetrasi pelarut ke dalam bahan. Menurut Swisher

dan Swisher dalam Nagy et al. (1997), biji jeruk mengandung 55-60% air,

sedangkan biji jeruk kering mengandung 3-5% air. Biji jeruk yang telah dikeringkan dan dilakukan pengecilan ukuran disajikan pada Gambar 17.

Gambar 17. Biji jeruk hasil pengeringan dan pengecilan ukuran

Isolasi limonin dari biji, kulit ari dan pulp dilakukan secara bertahap

menggunakan beberapa pelarut. Ekstraksi pertama bertujuan untuk menghilangkan senyawa yang bersifat non-polar dari biji, kulit ari dan

pulp. Isolasi senyawa biasanya dilakukan secara bertahap dengan

menghilangkan senyawa yang tidak diinginkan. Limonin tergolong senyawa semi polar dan pada proses isolasi limonin, pemisahan senyawa non polar lebih mudah dilakukan sehingga proses dilakukan terlebih dahulu, selanjutnya dilakukan pemisahan senyawa dengan tingkat kepolaran yang mendekati kepolaran limonin. Senyawa non-polar dari biji,

kulit ari dan pulp perlu dihilangkan karena dikhawatirkan akan

mengganggu pada saat proses presipitasi limonin dimana keberadaan senyawa non-polar akan mengurangi tingkat kemurnian dan rendemen

limonin yang dihasilkan. Hal ini sejalan dengan penelitian Pifferi et al.

(1993) yang menyatakan bahwa isolasi limonin dari biji lemon kering yang

telah dihilangkan minyaknya (defatted) menghasilkan rendemen yang

lebih banyak yaitu 91,5% dibanding isolasi limonin dari biji lemon tanpa proses penghilangan minyak yang menghasilkan limonin dengan rendemen 51,3%.

Ekstraksi senyawa non polar dapat dilakukan menggunakan pelarut yang juga bersifat non polar seperti petroleum eter, karbon disulfida, karbon tetraklorida, benzen dan n-heksan. Ekstraksi berlangsung secara efisien apabila pelarut yang digunakan dapat berpenetrasi ke dalam partikel bahan, tidak beracun baik dalam bentuk gas maupun cair, tidak mudah terbakar dan mempunyai titik didih rendah sehingga mudah dievaporasi tanpa meninggalkan residu ketika dipisahkan bahan. Pelarut yang umum digunakan adalah n-heksan karena hampir memenuhi semua kriteria pelarut yang baik dan ideal seperti stabilitas tinggi, laju penguapan rendah, sifat karat rendah, residu pada senyawa non polar rendah, tidak berpengaruh pada bau dan rasa produk, mudah didaur ulang. Menurut

Swisher dan Swisher dalam Nagy et al. (1997), biji jeruk mengandung

15% minyak. Hasil ekstraksi menunjukkan biji jeruk memiliki kandungan senyawa non-polar berupa minyak biji jeruk yang cukup besar yaitu 30%. Minyak biji jeruk dapat dimanfaatkan sebagai minyak makan maupun untuk aplikasi industri. Minyak biji jeruk merupakan minyak edible yang juga mengandung protein. Minyak biji jeruk disajikan pada Gambar 18.

Gambar 18. Minyak biji jeruk siam

Menurut Swisher dan Swisher dalam Nagy et al. (1977), warna

kuning pada minyak biji jeruk menunjukkan adanya kandungan senyawa

karotenoid terutama β-karoten pada biji jeruk. Kandungan asam lemak

Tabel 6. Komposisi asam lemak pada minyak biji jeruk

Asam Lemak Utama (%)

Linoleat Oleat Linolenat Palmitoleat Palmitat Stearat 37-45 20-25 3-5 0,1-1 22-30 2-5

Sumber : Swisher dan Swisher dalam Nagy et al. (1977)

Minyak biji jeruk bersifat semi drying oil, cocok digunakan untuk

industri kulit dan tekstil, serta memiliki sifat fisikokimia yang hampir sama dengan biji kapas dan kacang kedelai. Minyak biji jeruk juga dapat digunakan sebagai minyak makan, salad dressing dan margarin serta

mengandung antioksidan golongan tokoferol dengan kandungan α

-tokoferol yang dominan (Swisher dan Swisher dalam Nagy et al. 1977).

Ekstraksi kedua dilakukan menggunakan pelarut aseton yang bertujuan untuk mengekstrak limonin. Menurut Seidel (2006), aseton

dengan struktur kimia (CH3)2CO memiliki titik didih 56 oC merupakan

pelarut dengan index polaritas 5,1 yang tergolong pelarut dengan polaritas sedang, biasanya digunakan untuk mengekstrak komponen dengan polaritas sedang seperti beberapa alkaloid dan flavonoid. Pemilihan pelarut aseton didasarkan pada kelarutan limonin dalam aseton karena menurut

Dandekar et al. (2008), limonin memiliki tingkat kepolaran rendah sampai

sedang.

Aseton kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator vacuum

sehingga dihasilkan ekstrak aseton. Hasil ekstraksi biasanya merupakan campuran beberapa senyawa organik dan masih berupa ekstrak yang berbentuk cairan sehingga untuk memperoleh padatan dilakukan proses presipitasi. Evaporasi aseton bertujuan untuk meningkatkan konsentrasi bahan yang terekstrak dalam aseton sehingga memudahkan proses presipitasi. Evaporasi aseton juag bertujuan agar volume pelarut yang digunakan pada saat presipitasi tidak terlalu besar.

Menurut Mullin (2001), presipitasi adalah proses penambahan pelarut pada volume tertentu ke dalam suatu larutan yang menyebabkan kelarutan suatu bahan dari larutan tersebut menurun dan akhirnya mengendap. Kedua pelarut yang digunakan dalam proses presipitasi harus dapat bercampur. Presipitasi bahan terjadi apabila volume pelarut yang bersifat menurunkan kelarutan bahan lebih banyak dibanding pelarut yang bersifat melarutkan bahan sehingga menyebabkan kelarutan bahan menurun dan bahan dapat terpresipitasi.

Presipitasi limonin dari ekstrak aseton dilakukan dengan menambahkan heksan pada volume tertentu yang didasarkan pada sifat limonin yang tidak larut dalam heksan. Menurut Mullin (2001), berdasarkan ikatan inter molekulernya, heksan tergolong pelarut non polar

proctic dimana konstanta dielektriknya rendah dan molekul berinteraksi dengan ikatan van der walls sehingga zat yang bersifat semi polar seperti limonin memiliki kelarutan yang rendah dalam pelarut ini.

Hasil presipitasi berupa endapan berwarna putih kekuningan dan

masih mengandung gum, hal ini sesuai dengan hasil penelitian Pifferi et al.

(1993). Presipitat masih mengandung pengotor berupa alkaloid dan flavonoid yang ikut terekstrak pada waktu ektraksi menggunakan aseton. Alkaloid pada biji jeruk diduga adalah senyawa synepherine sedangkan flavonoid pada biji jeruk diduga adalah senyawa hesperidin (Hanson, 2003). Untuk meningkatkan kadar limonin perlu dilakukan pemurnian yang dilakukan dengan cara melarutkan kembali presipitat dalam pelarut diklorometan kemudian diendapkan dengan penambahan pelarut isopropanol. Pemilihan pelarut isopropanol didasarkan pada jenis senyawa pengotor yaitu flavonoid yang larut dalam isopropanol tetapi limonin tidak larut dalam isopronol sehingga penggunaan isopropanol dapat melarutkan pengotor dan diperoleh limonin dengan konsentrasi yang lebih tinggi.

Proses recovery dilakukan dengan 2 cara yaitu dengan pencucian etanol

dan tanpa pencucian etanol. Kandungan limonin dalam presipitat yang

memberikan hasil kandungan limonin sebesar 0,676 mg limonin/g biji jeruk kering sehingga optimasi dilakukan pada bahan baku biji jeruk dengan metode soxhletasi bertahap tanpa pencucian etanol. Isolasi limonin dari biji jeruk menunjukkan kondisi optimum hasil eksperimen sesuai dengan hasil optimasi berdasarkan metode permukaan respon, yaitu diperoleh pada rasio ekstrak aseton dengan heksan yaitu 1:4 dengan lama presipitasi 20 jam dengan respon jumlah limonin 1,502 mg limonin/g biji kering. Rekayasa proses isolasi limonin pada penelitian ini sudah cukup baik karena dapat mengisolasi limonin sebesar 93% dari biji jeruk siam.

Biji jeruk siam merupakan bahan baku potensial untuk produksi limonin karena kandungan limonin yang tinggi serta ketersediaannya yang mencukupi dan dapat diperoleh dari limbah industri pengolahan sari jeruk. Penelitian ini menghasilkan presipitat dengan tingkat kemurnian limonin sebesar 27%, hal ini berarti limonin ini dapat diaplikasikan dalam produk pangan dan farmasi dan digolongkan dalam phamaceutical grade.

Kata Kunci : limonin, limbah industri pembuatan sari jeruk siam, optimasi proses, presipitasi.

© Hak Cipta Milik Institut Pertanian Bogor (IPB) tahun 2010

Hak cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

REKAYASA PROSES ISOLASI LIMONIN DARI

LIMBAH PEMBUATAN SARI JERUK SIAM

Dewi Cakrawati

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Magister Sains pada

Program Studi Teknologi Industri Pertanian

SEKOLAH PASCA SARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

LEMBAR PENGESAHAN

Judul Tesis : Rekayasa Proses Isolasi Limonin dari Limbah Pembuatan Sari Jeruk Siam

Nama : Dewi Cakrawati NIM : F351070151

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Erliza Noor Dr. Ir. Setyadjit, M.App.Sc Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Teknologi Industri Pertanian

Prof. Dr. Ir. Irawadi Djamaran Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.Si Tanggal ujian : 25 Januari 2010 Tanggal lulus :

PRAKATA

Segala puji hanyalah milik Allah SWT yang telah memperkenankan penulis menyelesaikan penelitian dan menuangkan hasilnya dalam bentuk tesis yang berjudul “Rekayasa Proses Isolasi Limonin dari Limbah Pembuatan Sari Jeruk Siam” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian Insitut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini tidak akan terselesaikan tanpa bantuan dari berbagi pihak, karenanya pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Dr. Ir. Erliza Noor dan Bapak Dr. Ir. Setyadjit, M.App.Sc. selaku komisi pembimbing atas segala bimbingan, arahan, bantuan, dan motivasi baik berupa moril dan materil yang telah diberikan selama penelitian dan penyusunan tesis.

2. Prof. Dr. Ir. Irawadi Djamaran dan Dr. Ir. Ani Suryani, DEA., selaku Ketua dan Sekretaris Program Studi Teknologi Industri Pertanian atas bantuan dan masukan yang diberikan untuk kelancaran studi penulis.

3. Seluruh staf pengajar Sekolah Pasca Sarjana IPB yang telah memberi ilmu pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama menimba ilmu pengetahuan serta laboran dan teknisi laboratorium Departemen Teknologi Industri Pertanian yang telah banyak memberikan bantuan kepada penulis selama melaksanakan penelitian.

4. Sekretariat Jendral Penelitian dan Pengembangan Departemen Pertanian yang telah memberi dukungan finansial bagi pelaksanaan penelitian ini melalui Program Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T).

5. Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian Departemen Pertanian yang telah bersedia memfasilitasi penelitian ini serta staf dan teknisi Balai Besar Litbang Pasca Panen yang telah banyak membantu demi kelancaran pelaksanaan penelitian ini.

6. Rekan-rekan seperjuangan, mahasiswa S1, S2 dan S3 TIP atas bantuan,

dukungan, dan motivasi yang diberikan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan tesis.

7. Ayah H. Wahidin, Ibu Hj. Dewi Laraswati dan adik tercinta atas bantuan, dorongan, iringan doa yang tulus kepada penulis selama menyelesaikan pendidikan S2.

8. Suami tercinta Yuyus Sirhanudin Permana S.Si., Apt, untuk kesabaran, pengertian, dukungan, serta motivasi yang tidak pernah berhenti diberikan kepada penulis selama menyelesaikan pendidikan S2 serta untuk diskusi-diskusi panjang dan masukan yang bermanfaat yang diberikan kepada penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan tesis.

9. Semua pihak yang telah banyak membantu penulis baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis berharap semoga karya ini bisa bermanfaat bagi pihak yang membutuhkan. Semoga dengan mengetahui sedikit tentang limonin bisa menambah keimanan kita kepada Sang Khalik yang Maha Mengetahui Segala Sesuatu.

Bogor, Januari 2010