Bahan dan Alat Penelitian .1 Bahan Penelitian Skema Alur Penelitian Analisis Data

- KBM Konsentrasi Bakterisidal Minimal adalah konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh bakteri setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat dengan menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. 3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian - Buah jeruk purut sebanyak 2000 gram - Pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter - Suspensi Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 - Media Triptic Soy Agar TSA - NaCl 0,9 1 liter 3.6.2 Alat Penelitian - Vacuum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany - Aluminium foil 1 gulungan - Erlenmeyer Pyrex, USA - Deslitator - Lemari penyimpanan petri - Blender Panasonik, Japan - Kertas Saring Whatman no. 42, England - Autoklaf Tomy, Japan - Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan - Pipet mikro dan tips Gilson, France - Kaca Pembesar Ootsukda ENV-CL, Japan - Ose, Spirtus 3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut Buah yang dipakai adalah buah yang segar. Bahan baku berupa buah jeruk purut sebanyak 2000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikupas kulitnya. Selanjutnya kulit jeruk purut dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari. Universitas Sumatera Utara Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkulator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkulator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes menit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam dalam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur ≤40˚C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit jeruk purut. Universitas Sumatera Utara Gambar 7. Kulit jeruk purut Gambar 8. Pengeringan kulit jeruk purut Gambar 9. Kulit jeruk purut Gambar 10. Proses penghalusan telah dihaluskan Gambar 11. Proses perendaman Gambar 12. Proses perkolasi Gambar 13. Proses penguapan dengan rotavapor Universitas Sumatera Utara

3.7.2 Pengenceran Bahan Coba

Ekstrak kulit jeruk purut ditimbang menggunakan Electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Triptic Soy Broth TSB. Disediakan 6 buah tabung, pada tabung pertama diisi 2 ml ekstrak kulit jeruk purut sehingga diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 100. Kemudian lima tabung lainnya kemudian diisi masing-masing 1 ml TSB. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil setengah dari ekstrak kulit jeruk purut konsentrasi 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit jeruk purut 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai didapatkan konsentrasi 25, 12,5 dan 6,25. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.

3.7.2 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Triptic Soy Agar TSA. Sebanyak 20 gram bubuk TSA dilarutkan ke dalam 500 ml aquades dan dimasukkan ke dalam wadah kaca tertutup. Selanjutnya media disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121 o C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Ketika akan digunakan, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri sebanyak 20 mlpetri dan dibiarkan hingga dingin. Universitas Sumatera Utara Gambar 14. Bubuk TSA Gambar 15. Sterilisasi dengan autoklaf

3.7.3 Pembiakan Spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO 2 . Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah spesimen Porphyromonas gingivalis yang telah dibiakkan secara murni pada media TSA yang telah dipersiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10 8 CFUml. Gambar 16. Porphyromonas Gambar 17. Kekeruhan standar Gingivalis ATCC 3327 Mac Farland Universitas Sumatera Utara

3.7.4 Penetuan KHM bahan coba

Bahan coba ekstrak kulit jeruk purut yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai dengan konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kamudian divoteks. Lalu tabung-tabung tersebut tersebut diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 24 jam pada inkubator CO 2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut. Gambar 18. Bahan coba Gambar 19. Proses inkubasi divoteks Gambar 20. Bahan coba dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 Universitas Sumatera Utara

3.7.5 Penentuan KBM bahan coba

Setelah KHM didapatkan, penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 masing-masing divoteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat TSA direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 ˚C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang akan dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetasan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml. Gambar 21. Masing-masing konsentrasi bahan coba di dalam cawan petri Universitas Sumatera Utara

3.8 Skema Alur Penelitian

3.9 Analisis Data

Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan memakai uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek antibakteri ekstrak etanol kulit jeruk purut terhadap pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis. Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL PENELITIAN

4.1 Ekstraksi kulit jeruk purut Citus hystrix D.C.

Ekstrak kulit jeruk purut berasal dari 250 gram serbuk simplisia yang dilanjutkan dengan pelarut etanol 96 kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental berwarna coklat kehitaman sebanyak 70 gram. Ekstrak kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup dan disimpan di dalam lemari pendingin.

4.2 Uji efektivitas antibakteri

Pada penentuan KHM yang diperhatikan adalah tabung perlakuan yang mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol. Dari hasil pengujian antibakteri ekstrak kulit jeruk purut terhadap bakteri Porphyromonas gingivalis setelah divorteks dan diinkubasi selama 24 jam, KHM tidak dapat ditentukan karena warna bahan coba berwarna coklat kehitaman sehingga tidak representatif untuk mendapatkan nilai KHM. Pada penentuan KBM yang dicari adalah konsentrasi minimal yang dapat membunuh bakteri pada media TSB steril. Hasil pada uji antibakteri yang didapat pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 memperlihatkan zona bening yang tidak dijumpai pertumbuhan koloni bakteri atau 0 CFUml yang artinya bahwa pada konsentrasi tersebut sudah mampu memberikan efek antibakteri, sedangkan pada konsentrasi 6,25 dijumpai adanya pertumbuhan bakteri dengan rerata pertumbuhan bakteri sebesar 41,732 . 10 2 CFUml. Universitas Sumatera Utara