Efektivitas Ekstrak Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) Terhadap Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans Secara In Vitro

RENCANA ANGGARAN PENELITIAN

Biaya:

1. Pembelian jeruk purut : Rp 100.000,-

2. Ekstraksi kulit jeruk purut di Lab. Farmasi USU : Rp 500.000,-

3. Uji bakteri di UNAIR : Rp 2.000.000,-

4. Identifikasi tanaman jeruk purut di LIPI : Rp 100.000,- 5. Transportasi ke Surabaya untuk pengujian bakteri : Rp 4.000.000,-

6. Lain-lain : Rp 500.000,- +

DAFTAR PUSTAKA

1. Deshpande N, Deshpande A, Mafoud S. Evaluation of intake of green tea on gingival and periodontal status: An experimental study. J Interdisciplinary Dent 2012; 2: 108-11.

2. Chrysanthakopoulos NA. Periodontal disease status in an isolated greek adult population. J Dent 2012; 9: 195-206.

3. Roeslan MO. Regenerasi jaringan periodontal dengan sel punca. J Ilmiah dan Teknologi Kedokteran Gigi 2011; 8: 36-41.

4. Cappelli DP, Mobley CC. Prevention in clinical oral health care. Missouri: Mosby Elsevier, 2008: 14-7, 222.

5. Eke PI, et al. Prevalence of periodontitis in adults in the United States: 2009 and 2010. J Dent Res 2012; 91: 914-20.

6. Situmorang N. Profil penyakit periodontal penduduk di dua kecamatan kota medan tahun 2004 dibandingkan dengan kesehatan mulut tahun 2010 (WHO). dentika Dent J 2003; 9: 71-7.

7. Zubardiah L. Efek antibakteri daun Lawsonia inermis L. terhadap Actinobacillus actinomycetemcomitans secara in vitro. Scientific J Dent 2006; 21: 47-53.

8. Umeda JE, Demuth DR, Ando ES, Faveri M, Mayer MPA. Signaling transduction analysis in gingival epithelial cells after infection with Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Molecular oral microbiology 2012; 27: 23-33.

9. Shaikh I, Utthamani J, Kulkarni V. The role of anti-oxidant and diets on periodontal disease. The IDA Times 2012. Aug: 12-3.

10.Palombo EA. Traditional medical plant extracts and natural product with activity againts oral bacteria: Potential application in the prevention and

treatment of oral diseases. Evidence Based Complementary And Alternative Medicine 2011: 1-15.

11.Sanz M, Lau L, Herrera D, Morillo JM, Silva A. Methods of detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forshthensis in periodontal microbiology, with special emphasis on advance molecular tehniques: A review. J Clin Periodontol 2004; 31: 1034-47.

12.Brito B, et al. A. Actinomycetemcomitans induced periodontal disease promotes systemic and local responses in rat periodontium. J Clin Periodontol 2012; 39: 333-41.

13.Henderson B, Ward JM, Ready D. Aggregatibacter (Actinobacillus actinomycetemcomitans: A triple a periodontopathogen. Periodontology 2000 2010; 54: 78-105.

14.Bandhaya P, Saraithong P, Likittanasombat K, Hengprasith B, Torrungruang K. Aggregatibacter actinomycetemcomitans serotypes, the JP2 clone and cytolethal distending toxin genes in Thai population. J Clin Periodontol 2012; 39: 519-25.

15.Henderson B, Wilson M, Sharp L, Ward JM. Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Med Microbial 2002; 51: 1013-20.

16.Dumitrscu AL. Etiology and pathogenesis of periodontal disease. Heidelberg: Springer, 2010: 42.

17.Tjandra A, Rahayu RP, Jularso E. The role of immunoglobulin G2 (Ig G2) in to aggressive periodontitis. Oral Biology Dent J 2010; 2: 12-20.

18.Agarwal G, Vemanaradhya GG, Metha DS. Evaluation of chemical compotition and efficacy of Chinese propolis extract on porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans: An in vitro study. Contemp Clint Dent 2012; 3: 256-61.

19.Wagner A, et al. Antibacterial activity of the essential oil from Rosmarinus officinalis and its major components againts oral pathogen. Z Naturforsch 2010; 65: 588-93.

20.Munawaroh S, Handayani PA. Ekstraksi minyak daun jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) dengan pelarut etanol dan n-heksana. J Kompetensi Teknik 2010; 2: 73-8.

21.Backupccrc. Jeruk purut (Citrus hystrix D.C.). http://backupccrc.wordpress.com/ensiklopedia/eksiklopedia-tanaman-anti-kanker/j/jeruk-purut-citrus-hystrix-dc/ (Juli 15. 2013).

22.Chaisawadi S, Thongbute D, Methawiriyasilp W. Preliminary study of antimicrobial activities on medical herbs of thai food ingredients. Bioprospecting & Ethopharmacology 2005; 1: 111-4.

23.Setyohadi, Sumarno, Budiarti D. Uji efektivitas ekstrak etanol kulit buah jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) sebagai antibakteri terhadap Streptococcus mutans secara in vitro. Majalah Dwita Budiarti 2013: 1-8.

24.Tsuzukibashi O, et al. A novel of selective medium for isolation of Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans. J Periodontal Research 2008; 43: 544-8.

25.Johansson A, Claesson R, Hanstrom L, Kalfas S. Serum-mediated release of leukotoxin from the cell surface of the periodontal pathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans. Eur J Oral Sci 2003; 111: 209-15.

26.Eley BM, Soory M, Manson JD. Periodontics. Edinburgh: Saunders Elsevier, 2010: 69, 356-7.

27.Plantamor. Jeruk purut (Citrus hystrix D.C.). http://www.plantamor.com /index.php?plant=345 (Juli 15. 2013).

28.Nastiti PT. Jeruk purut segarkan badan lelah. http://www.solopos.com /2012/08/24/tips-herbal-jeruk-purut-segarkan-badan-lelah-321536 (Juli 15. 2013).

29.Hariana A. Tumbuhan obat dan khasiatnya. Jakarta: Penebar Swadaya, 2008: 151.

30.Obat Tradisonal. Jeruk purut (Citrus hystrix D.C.). pdpersi.co.id (Juli 15. 2013).

31.Mathur A, et al. Evaluation in vitro antimicrobial and antioxidant activities of peel and pul of some citrus fruit. J Biotechnology and Biotherapeutics 2011; 1: 1-17.

32.Kirbaslar FG, Tavman A, Dulger B, Turker G. Antimicrobial activity of turkish citrus peel oils. Pak J Bot 2009; 41: 3207-12.

33.Kawaguchi K, et al. Suppression of infection-induced endotoxin shock in mice by a citrus flavone naringin. Planta Med 2004;70: 17-22.

34.Sellekchem. Naringin (naringoside). http://www.selleckchem.com/products/ Naringin%28Naringoside%29.html (Juli 15. 2013).

35.Doss A, Mubarack M, Dhanabalan R. Antibacterial activity of tannins from the leaves of Solanum trilobatum Linn. Indian J Science and Technology 2009; 2: 41-3.

36.Sung SH, et al. Antibacterial and antioxidant activities of tannins extracted from agricultural by-products. J Med Plants Research 2012; 6: 3072-9.

37.The world wide wine. Tannin. http://www.theworldwidewine.com/Glossaries/ Wine/bt.php (Juli 15. 2013).

38.Jyothi KS, Seshagiri M. In-vitro activity of saponins of Bauhinia purpurea, Madhuca longifolia, Celastrus paniculatus, and Semecarpus anacardium on selected oral pathogens. J Dent 2012; 9:216-22.

39.Soetan KO, Oyekunle MA, Aiyelaagbe OO, Fafunso MA. Evaluation of the antimicrobial activity of saponins extract of Sorghum bicolor L. Moench. African J Biotechnology 2006; 5: 2405-7.

40.Francis G, Kerem Z, Makkar HPS, Becker K. The biological action of saponins in animal systems: A review. British J Nutrition 2002; 88: 587-605. 41.Wikipedia. Saponin. http://en.wikipedia.org/wiki/Saponin (Juli 15. 2013). 42.Chita DF. Uji aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit buah jeruk purut (Citrus

hystrix D.C.) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. http://alumni.unair.ac.id/kumpulanfile/44543815694_abs.pdf (Juli 15. 2013).

43.Dorees SH, et al. Preliminary evaluation on the antibacterial activities of Citrus hystrix oil emulsions stabilized by tween 80 and span 80. International J Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2011; 3: 209-11.

44.Nanasombat S, Lohasupthawee P. Antibacterial activity of crude ethanolic extracts and essential oils of spices againts Salmonellae and other enterobacteria. KMITL Sci Tech J 2005; 5: 527-37.

45.Samaranayake L. Essential microbiology for dentistry. 3 rd ed., Edinburgh : Churchill Livingstone Elsevier, 2006: 57-8.

46.Arifin H, et. al. Standarisasi ekstrak etanol daun Eugenia cumini Merr. J Sains Tek Far 2006; 11: 88-93.

47.Zuhud EAM, et. al. Aktivitas antimikroba ekstrak kedawung (Parkia roxburghii G. Don) terhadap bakteri patogen. J Tek dan Industri Pangan 2001; 9 (1): 6-11.

48.Chowdury A, et. al. Antimicrobial, antioxidant and cytoxic activities of citrus hystrix D.C. fruits. J Pharm Sci 2009; 8 (2): 177-80.

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian kuasi eksperimental laboratorium dengan rancangan penelitian post test only control group design.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

3.2.1 Tempat Penelitian : 1. Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU

2. Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Universitas Airlangga

3.2.2 Waktu Penelitian : September 2013 – November 2013 3.3 Sampel dan Besar Sampel Penelitian

3.3.1 Sampel Penelitian

Koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans Serotipe-C yang telah diisolasi dan dibiakkan dalam media Triptic Soy Agar (TSA).

3.3.2 Besar Sampel Penelitian

Adapun penentuan besar sampel dilakukan berdasarkan SOP (Standard Operational Procedure) di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Universitas Airlangga. Jumlah pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus Federer yaitu:

Keterangan:

t = jumlah kelompok perlakuan dalam penelitian (t-1) (r-1) ൒ 15

r = banyak replikasi (perlakuan ulang)

Pada penelitian ini digunakan 5 perlakuan, yakni ekstrak kulit jeruk purut dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%. Oleh karena itu, banyak replikasi pada penelitian ini adalah sebagai berikut:

(t-1) (r-1) ൒ 15 (5-1) (r-1) ൒ 15 4 (r-1) ൒ 15 r-1 ൒ 3,75 r ൒ 4,75

Jumlah perlakuan ulang (r) yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5 kali perulangan.

a. Penentuan nilai KHM

- Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100% = 5 sampel - Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50% = 5 sampel - Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25% = 5 sampel - Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5% = 5 sampel - Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25% = 5 sampel - Kelompok VI : kontrol Mac Farland = 1 sampel

- Kelompok VII : kontrol negatif (ekstrak kulit jeruk purut tanpa suspensi Aggregatibacter actinomycetemcomitans) = 1 sampel

Jumlah sampel = 27 sampel

b. Penentuan nilai KBM

Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra.

- Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100% = 5 sampel - Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50% = 5 sampel

- Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25% = 5 sampel - Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5% = 5 sampel - Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25% = 5 sampel - Kelompok VI : kontrol Mac Farland = 1 sampel

- Kelompok VII : kontrol negatif (ekstrak kulit jeruk purut tanpa suspensi Aggregatibacter actinomycetemcomitans) = 1 sampel

Jumlah sampel = 27 sampel

3.4 Variabel Penelitian Variabel Bebas

- Ekstrak kulit jeruk purut dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%

Variabel Tergantung

- Pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans pada media TSA dengan pengukuran nilai KHM dan KBM.

Variabel Terkendali

- Keseragaman kondisi jeruk purut yang digunakan - Cara ekstraksi

- Lama penyimpanan, lama pengiriman, suhu saat pengiriman bahan coba (ekstrak etanol kulit jeruk purut) ke laboratorium

- Cara pengeringan - Waktu pengeringan Variabel Tak Terkendali

- Pola pemeliharaan tanaman jeruk purut

- Kondisi tanah tempat tanaman jeruk purut ditanam

3.5 Definisi Operasional

- Ekstrak kulit jeruk purut adalah ekstrak yang diperoleh dengan melakukan ekstraksi kulit jeruk purut yang telah diperkolasi dengan pelarut etanol 96% sehingga diperoleh ekstrak kental kulit jeruk purut.

- Koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang berasal dari stem cell Aggregatibacter actinomycetemcomitans Serotipe-C dan kemudian dikultur pada media TSA dalam suasana anaerob.

- KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) adalah konsentrasi minimum bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan mulai tidak tumbuh koloni bakteri pada media pembenihan dengan menggunakan metode dilusi.

- KBM (Konsentrasi Bakterisidal Minimum) adalah konsentrasi minimum bahan coba yang dapat membunuh 99,9% atau 100% bakteri setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat dengan menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra.

3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian

- Buah jeruk purut sebanyak 2000 gram

- Pelarut etanol 96% sebanyak 5 liter (Kimia Farma, Indonesia)

- Suspensi Aggregatibacter actinomycetemcomitans Serotipe-C (UNAIR, Indonesia)

- Media Triptic Soy Agar (Difco, USA) - NaCl 0,9% 1 liter (Kimia Farma, Indonesia) 3.6.2 Alat Penelitian

- Lemari pengering - Kertas perkamen

- Vaccum Rotary Evaporator (Heidolph VV 2000, Germany) - Perkolator

- Kapas (Bio Panca, Indonesia) - Alumunium foil 1 gulungan - Erlenmeyer (Pyrex, USA)

- Destilator

- Lemari penyimpan petri - Piring petri (Pyrex, Japan) - Blender (Panasonic, Japan)

- Kertas saring (Whatman no.42, England) - Autoklaf (Tomy, Japan)

- Inkubator CO2 (Sanyo, Japan)

- Electronic Balance (Ohyo JP2 6000, Japan) - Vortex/whirli mixer (Iwaki model TM 100, Japan) - Pipet mikro dan tips (Gilson, France)

- Kaca pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan) - Ose

- Spiritus

3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut

Buah yang dipakai adalah buah yang segar. Buah jeruk purut diperoleh dari Kelurahan Tegal Sari, Kecamatan Medan Denai. Bahan baku berupa buah jeruk purut sebanyak 2000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikupas kulitnya. Selanjutnya kulit jeruk purut diiris tipis-tipis dan dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari.

Gambar 6. Tanaman buah jeruk purut yang berasal dari Kelurahan Tegal Sari,

Kecamatan Medan Denai

Gambar 7. Jeruk purut dicuci dan dibersihkan dari kotoran

(a)

Gambar 8. Kulit jeruk purut (a) diiris tipis-tipis dan (b) dikeringkan dalam lemari pengering

Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96%. Diaduk sesekali dalam keadaan etanol cukup merendam sampel. Selanjutnya simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring.

Gambar 9. Kulit jeruk purut yang sudah kering dihaluskan (b)

Gambar 10. Simplisia dimaserasi dalam etanol 96% selama 3 jam

Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes/ menit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam dalam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih.

Gambar 11. Penampungan perkolat

Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan <1 ATM dengan temperatur ൑50˚C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit jeruk purut.

Gambar 12. Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator

3.7.2 Pengenceran Bahan Coba

Ekstrak kulit jeruk purut ditimbang menggunakan Electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Triptic Soy Broth (TSB). Disediakan 5 buah tabung, pada tabung pertama diisi 2 ml ekstrak kulit jeruk purut sehingga diperoleh ekstrak kulit jeruk purut dengan konsentrasi 100%. Empat buah tabung yang lainnya kemudian diisi masing-masing 1 ml TSB. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil setengah dari ekstrak kulit jeruk purut konsentrasi 100% menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit jeruk purut 50% (pengenceran ganda). Demikian seterusnya sampai didapatkan konsentrasi 25%, 12,5% dan 6,25%. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.

3.7.3 Pembuatan Media Bakteri

Proses pembiakan spesimen dilakukan setelah pembuatan media TSA. Sebanyak 20 gram TSA dilarutkan ke dalam 500 ml aquadest untuk 40 petri (20 ml/petri). Media disterilkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121˚C. Apabila telah disterilkan, media disimpan di dalam lemari

Gambar 13. Ekstrak kental kulit jeruk purut

pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.

Gambar 14. Media dimasukkan ke dalam (a) autoklaf dan (b) dituangkan ke masing-masing petri

3.7.4 Pembiakan Spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO2. Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang digunakan adalah spesimen Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang telah dibiakkan secara murni pada media TSA yang telah dipersiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9% sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 108 _CFU/ml.

Gambar 15. Biakan murni Aggregatibacter actinomycetemcomitans

3.7.5 Penentuan KHM bahan coba

Bahan coba ekstrak kulit jeruk purut yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%. Masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam mikro plate kemudian diberi label sesuai dengan konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing mikro plate bahan coba yang telah diberi label kamudian divoteks. Lalu mikro plate tersebut diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam pada inkubator CO2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimum ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Aggregatibacter actinomycetemcomitans dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.

Gambar 16. Suspensi bakteri (a) dimasukkan ke bahan coba dan (b) diinkubasi selama 24 jam

3.7.6 Penentuan KBM bahan coba

Penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% masing-masing divoteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat (Triptic Soy Agar) direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator

CO2 dengan suhu 37˚C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri

dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit)/ ml cairan (suspensi).

Apabila telah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena konsentrasi yang akan dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).

Gambar 17. Metode Drop Plate Mills Mesra 3.8 Skema Alur Penelitian

Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut

Pembuatan Media Bakteri

Pembiakan Spesimen

Penentuan KHM Bahan Coba

Penentuan KBM Bahan Coba

Analisis Data Pengenceran Bahan Coba

3.9 Analisis Data

Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan memakai uji statistik sebagai berikut:

- Uji analisis varian satu arah (ANOVA), untuk melihat perbedaan efek antibakteri ekstrak etanol kulit jeruk purut terhadap pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

BAB 4

HASIL PENELITIAN

4.1 Ekstraksi Kulit Jeruk Purut

Ekstrak kulit keruk purut yang diperoleh berasal dari 2000 gram buah jeruk purut yang kemudian dihaluskan menjadi bentuk simplisia sehingga didapatkan 250 gram simplisia. Simplisia tersebut kemudian diperkolasi dengan menggunakan pelarut etanol 96% dan didapat maserat cair sebanyak 4 liter dari proses tersebut. Kemudian maserat cair diuapkan dalam alat vacuum rotary evaporator sehinggga diperoleh ekstrak kental berwarna kecoklatan sebanyak 70 gram. Ekstrak kental dimasukkan ke dalam wadah tertutup dan disimpan dalam lemari pendingin.

Gambar 18. Ekstrak kental kulit jeruk purut

4.2 Uji Efektivitas Antibakteri

Pengujian daya antibakteri dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba (100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%). Penetapan konsentrasi berdasarkan pada standard Laboratorium Tropical Disease, UNAIR dengan metode pengenceran ganda (dilusi).

Pada penentuan KHM yang dilihat adalah tabung perlakuan yang mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol Mac Farland. Dari hasil pengujian antibakteri ekstrak kulit jeruk purut terhadap Aggregatibacter actinomycetemcomitans setelah dicampur dengan menggunakan voteks dan diinkubasi selama 24 jam, ternyata setelah diamati kekeruhan, penentuan KHM sulit dilakukan. Terlihat semua suspensi dalam tabung yang telah berkontak dengan bahan coba berwarna.

Penelitian dilanjutkan dengan perhitungan KBM menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra pada suasana anaerob dengan inkubasi 37°C selama 24 jam. Pada penentuan KBM, yang dicari adalah konsentrasi minimum yang dapat membunuh bakteri pada media TSA (steril). Hasil pengujian bakteri didapat pada konsentrasi 100% s/d 25% (Gambar 19) memperlihatkan zona bening yang tidak dijumpai pertumbuhan koloni bakteri atau senilai 0 CFU/ml yang menunjukkan pada konsentrasi ini memberikan efek antibakteri, sedangkan pada pengujian efek antibakteri ekstrak jeruk purut dengan konsentrasi 12,5% dan 6,25% (Gambar 20) dijumpai adanya pertumbuhan bakteri dengan bentuk koloni bakteri yang tidak tampak jelas karena koloni bakteri tersebut saling tumpang tindih satu sama lain sehingga memberikan hasil TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung).

Gambar 19. Hasil peletakan tetesan ekstrak kulit jeruk purut dengan konsentrasi (a) 100%, (b) 50%, dan (c) 25%

Gambar 20. Hasil peletakan tetesan ekstrak kulit jeruk purut dengan konsentrasi (a) 12,5% dan (b) 6,25%

(a) (b)

(c)

Tabel 1. Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba ekstrak kulit jeruk purut

Keterangan: 0 CFU/ml = steril, tidak dijumpai pertumbuhan bakteri; TBUD = Tidak Bisa Untuk Dihitung.

Pada Tabel 1. ditunjukkan bahwa koloni bakteri terbentuk setelah bakteri berkontak dengan ekstrak kulit jeruk purut pada berbagai konsentrasi dimana masing-masing konsentrasi mengalami lima kali replikasi.

Berdasarkan data hasil penelitian tersebut, diperoleh hasil bahwa konsentrasi minimum ekstrak kulit jeruk purut yang dapat membunuh bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans pada penelitian ini adalah sebesar 25%. Sedangkan KHM pada penelitian ini tidak dapat ditentukan karena terlihat semua suspensi dalam tabung yang telah berkontak dengan bahan coba berwarna.

Secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji statistik secara parametrik uji ANOVA karena data yang tersedia tidak direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD) serta data lainnya memperoleh nilai perhitungan 0 CFU/ml.

Bahan Uji Ekstrak Kulit Jeruk Purut

Replikasi 1 2 3 4 5

Konsentrasi 100%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml

Konsentrasi 50%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml

Konsentrasi 25%

0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml 0 CFU/ml

Konsentrasi 12,5%

TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD

Konsentrasi 6,25%

BAB 5

PEMBAHASAN

Tujuan uji aktivitas antibakteri secara in vitro adalah untuk mengetahui bahan uji antibakteri yang dapat digunakan untuk mengatasi masalah infeksi oleh mikroorganisme. Uji aktivitas antibakteri pada dasarnya dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu metode difusi cakram dan metode dilusi. Penelitian dengan menggunakan metode dilusi dilakukan untuk mengamati KHM dan KBM terhadap pertumbuhan bakteri. Konsentrasi minimum dari suatu obat yang dapat menghambat pertumbuhan dari organisme yang diuji/ konsentrasi terendah yang akan menghambat pertumbuhan yang tampak secara in vitro disebut sebagai kadar hambat minimum (KHM)/ Minimum Inhibitory Concentration (MIC), sedangkan, konsentrasi minimum yang dibutuhkan suatu obat untuk membunuh organisme/ konsentrasi minimum dari suatu obat yang dapat membunuh 99,9% dari mikroorganisme yang diuji disebut sebagai kadar bunuh minimum (KBM)/ Minimum Bactericidal Concentration (MBC). Penentuan KHM dan KBM akan memberikan suatu penaksiran secara kuantitatif terhadap potensi dari suatu antimikroba.45

Dalam penelitian ini, ekstraksi kulit jeruk purut dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol. Pelarut etanol adalah pelarut yang dapat melarutkan seluruh bahan aktif yang terkandung dalam suatu bahan alami, baik bahan aktif yang bersifat polar, semipolar maupun non polar. Selain itu, pelarut etanol juga diketahui memiliki kemampuan untuk mengendapkan protein dan menghambat kerja enzim sehingga dapat terhindar dari proses hidrolisis dan oksidasi. Etanol yang digunakan adalah etanol 96%. Konsentrasi 96% adalah konsentrasi etanol yang ideal digunakan untuk ekstraksi sampel segar.46

Buah jeruk purut yang digunakan adalah buah jeruk purut yang masih segar, bertujuan untuk menghindari rusaknya kandungan zat akibat proses enzimatis. Buah jeruk purut yang digunakan sebanyak 2000 gram karena diperkirakan dapat

menghasilkan ekstrak kental kulit jeruk purut yang cukup untuk melakukan pengujian antibakteri terhadap Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Kulit jeruk purut terlebih dahulu diiris kecil-kecil dengan tujuan untuk mempercepat proses maserasi. Sampel kulit jeruk purut yang diiris kecil akan memperbanyak permukaan serta memperpendek jarak antar sel sehingga bahan coba dapat berkontak langsung dan lebih banyak dengan pelarut etanol sehingga pelarut etanol akan dapat dengan sempurna berdifusi ke dalam molekul-molekul senyawa kulit jeruk purut. Untuk menghindari terjadinya pembusukan, kulit buah yang diiris harus dikeringkan terlebih dahulu di dalam lemari pengering.

Irisan kering kulit jeruk purut kemudian dihaluskan hingga menjadi serbuk yang disebut simplisia lalu dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol. Metode ekstraksi yang dipilih adalah maserasi, alasannya karena pelaksanaannya sederhana serta untuk mengurangi kemungkinan terjadinya penguraian zat aktif yang terkandung dalam kulit jeruk purut oleh pengaruh suhu, karena dalam maserasi tidak terjadi proses pemanasan. Tujuan maserasi adalah untuk memberikan kesempatan pada simplisia berdifusi ke dalam pelarut. Kemudian diperkolasi hingga diperoleh 4 liter maserat cair yang akan dilakukan penguapan dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator yang bekerja dengan cara menurunkan tekanan udara dari tekanan udara luar menjadi <1 ATM, sehingga tekanan uap pelarut serta titik didih pelarut menurun. Penurunan tekanan akan berbanding lurus dengan penurunan temperatur sehingga menghindari penguraian kandungan kimia maserat cair yang diekstraksi.

Senyawa aktif kulit jeruk purut yang berkhasiat sebagai antibakteri adalah naringin, tanin, saponin, dan minyak atsiri. Naringin telah terbukti efektif terutama dalam menghambat pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans dan Porphyromonas gingivalis secara signifikan dalam waktu 3 jam dan menunjukkan efek yang lebih dengan peningkatan waktu inkubasi dan konsentrasi naringin. Naringin dapat menurunkan jumlah bakteri dan dapat menurunkan level dari plasma lipopolisakarida (LPS). Selain itu, naringin juga dapat menekan Tumor Necrosis Factor (TNF-α) dan menstabilkan faktor pembekuan darah yang disebabkan oleh infeksi.10,33

Tanin merupakan senyawa polifenol kompleks yang dapat ditemukan pada beberapa tanaman. Sama halnya dengan polifenol, tanin juga dapat menunjukkan efek antioksidan dan aktivitas antibakteri. Tanin menghambat pertumbuhan bakteri dan merusak dinding sel sitoplasma, yang menyebabkan kerusakan stuktur bakteri secara cepat. Beberapa penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa efek antimikroba tanin yaitu dengan menginaktivasi adhesin mikroba dan enzim hidrolitik sepeti protease dan karbohidrolase dan sel transpot protein.35,36

Saponin dapat menstimulasi sistem imun yang dimediasi sel untuk meningkatkan produksi dari antibodi. Saponin juga dapat menghambat infeksi dari beberapa protozoa seperti Plasmodium falciparum, Giardia trophozoites, dan Leishmania. Saponin memiliki efek deterjen terhadap membran sel. Saponin memiliki aktivitas antifungi dan antibakterial berspektrum luas, gugus lipofilik pada saponin dapat merusak membran sel. Saponin juga dapat meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri, menyebabkan denaturasi protein membran sehingga membran sel akan rusak dan lisis.23,40

Minyak atsiri dari jeruk purut memiliki efek antibakteri terhadap beberapa bakteri seperti Propionibacterium acnes, Bacillus, Staphylococcus epidermis, Escerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus. Kandungan minyak atsiri dari kulit jeruk purut dapat menghambat respirasi dari sel bakteri.43,44

Penelitian ini menggunakan metode dilusi yang dikombinasikan dengan metode Drop Plate Mills Mesra yakni bakteri yang diuji ditanam dalam media TSA selama 24 jam. Pada penelitian ini, pengenceran dilakukan sebesar setengah dari konsentrasi awal, yaitu 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%. Setiap konsentrasi dilakukan replikasi 5 sampel sehingga didapat jumlah sampel yang digunakan pada penentuan KHM dan KBM masing-masing adalah 27 sampel. Penentuan konsentrasi tersebut disesuaikan berdasarkan standar konsentrasi pengujian bakteri yang ada di Laboratorium Tropical Disease, UNAIR. Dalam pengujian antibakteri, tiap konsentrasi bahan coba dilakukan replikasi sebanyak 5 kali agar diperoleh hasil yang lebih akurat dan mengetahui berapa rerata jumlah bakteri yang tumbuh pada ekstrak kulit jeruk purut dalam berbagai konsentrasi karena pada konsentrasi yang sama

belum tentu jumlah bakteri yang tumbuh juga sama.

Penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi minimum bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C yang dapat dilihat secara makroskopis dari hasil biakan pada mikro plate yang mulai tampak jernih. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dari semua konsentrasi bahan coba yang diuji ternyata tidak terdapat larutan yang mulai tampak jernih. Hal ini diduga akibat ekstrak kulit jeruk purut itu sendiri berwarna kecoklatan sehingga ketika disuspensikan dengan bakteri, bahan coba berwarna coklat keruh dan setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, bahan coba tetap berwarna coklat keruh atau tidak mengalami perubahan dengan warna sebelumnya. Oleh karena itu, semua konsentrasi berwarna keruh dan dianggap tidak representatif untuk dicari nilai KHM.

Nilai KBM diperoleh dari konsentrasi minimum bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri. Konsentrasi 100% akan secara langsung membunuh bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans karena tingginya konsentrasi antibakteri yang terkandung di dalamnya. Begitu juga pada konsentrasi 50% dan 25% tidak dijumpai pertumbuhan bakteri (steril atau 0 CFU/ml) yang artinya pada konsentrasi 100%, 50% dan 25% bersifat bakterisid. Sedangkan pada konsentarsi 12,5% dan 6,25% terlihat adanya pertumbuhan bakteri, namun jumlah bakteri yang tersebut tidak bisa dihitung (TBUD) karena koloni yang tumbuh terlalu banyak (>300 koloni). Jika jumlah koloni bakteri yang tumbuh > 300 koloni, maka perhitungan tidak dilanjutkan karena akan memberikan hasil yang bias. Oleh sebab itu, hasil pada konsentrasi 12,5% dan 6,25% termasuk ke dalam kategori TBUD.

Hipotesis penelitian ini yaitu ekstrak jeruk purut dapat menghambat/ memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans diterima. Hal ini terbukti dengan diperolehnya nilai perhitungan bakteri pada konsentrasi terendah yang dapat membunuh bakteri pada penelitian ini yaitu pada konsentrasi 25% sebesar 0 CFU/ml.

Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Chaisawadi terhadap bakteri Bacillus cereus,Salmonella typii, dan Staphylococcus aureus yang

menunjukkan bahwa kulit jeruk purut memiliki daya antibakteri. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit jeruk purut efektif terhadap bakteri negatif Gramm maupun bakteri positif Gramm.22

Penelitian Setyohadi menunjukkan bahwa KBM (Kadar Bunuh Minimum) konsentrasi ekstrak kulit buah jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Streptococcus mutans adalah pada konsentrasi 4%.23 Nilai Kadar Bunuh Minimum (KBM) ekstrak kulit jeruk purut terhadap bakteri Streptococcus mutans yang dilakukan oleh Setyohadi berbeda bila dibandingkan dengan Aggregatibacter actinomycetemcomitans pada penelitian ini disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel kedua bakteri tersebut. Streptococcus mutans merupakan bakteri positif Gramm, sedangkan Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan bakteri negatif Gramm. Bakteri negatif Gramm memiliki ketahanan yang lebih baik terhadap senyawa antimikroba dibandingkan dengan bakteri positif Gramm. Bakteri negatif Gramm memiliki sistem seleksi terhadap zat-zat asing yaitu pada lapisan lipopolisakarida. Struktur dinding sel bakteri positif Gramm relatif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antimikroba untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja, sedangkan struktur dinding sel bakteri negatif Gramm relatif lebih kompleks, berlapis tiga yaitu lapisan luar yang berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa lipopolisakarida dan lapisan dalam peptidoglikan.47

Hal ini juga sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Chowdury yang menunjukkan bahwa aktivitas antimikroba dari ekstrak kulit jeruk purut memiliki zona hambat yang lebih besar pada beberapa bakteri positif Gramm seperti Bacillis cereus, B. megaterium, B. subtilis, Staphylococcus aureus, dan Sarcina lutea.48

Asal jeruk purut yang berbeda kemungkinan akan memberikan hasil uji yang berbeda pula. Hal ini disebabkan oleh keadaan geografis tanaman dari masing-masing daerah sehingga kadar senyawa aktif pada kulit jeruk purut seperti tanin, steroid triterpenoid, minyak atsiri yang mengandung sitrat, saponin, polifenol, sirtonellal, linalol, geraniol, hidroksi sitronellal, linalil asetat, flavonoid rutin, naringin, dan hesperidin dari masing-masing tanaman juga berbeda.21

BAB 6

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa konsentrasi minimum ekstrak kulit jeruk purut yang mampu membunuh pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah sebesar 25% dengan hasil perhitungan jumlah koloni bakteri 0 CFU/ml. Nilai KBM pada penelitian ini kemungkinan berada di antara konsentrasi 12,5%-25%. Namun, nilai KHM pada penelitian ini tidak dapat ditentukan.

6.2 Saran

Penelitian ini disarankan untuk selanjutnya diperlukan:

1. Penelitian lebih lanjut dengan menggunakan metode lain untuk menentukan nilai KHM.

2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antibakteri ekstrak jeruk purut dengan konsentrasi di antara 12,5%-25% untuk mengetahui nilai KBM.

3. Uji fitokimia pada ekstrak kulit jeruk purut untuk mengetahui senyawa aktif mana yang memiliki aktivitas antibakteri paling besar.

4. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek kulit jeruk purut secara in vivo sehingga didapat konsentrasi yang dapat digunakan secara klinis.

5. Penelitian untuk menguji efektivitas kulit jeruk purut terhadap mikroba lain yang patogen dalam jaringan periodontal.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Aggregatibacter actinomycetemcomitans 2.1.1 Karakteristik Umum

Patogen utama yang sering dihubungkan dengan penyakit periodontal adalah Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah bakteri negatif Gramm nonmotile yang berada pada rongga mulut dan sering dihubungkan dengan endokarditis.12 Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan bakteri negatif Gramm fakultatif anaerob yang berperan dalam etiologi periodontitis agresif dan periodontitis kronis.14 Aggregatibacter actinomycetemcomitans dapat merusak jaringan dengan cara merangsang inflamasi, menyebabkan destruksi jaringan dan menghambat penyembuhan jaringan.15

Pada tahun 1996, tiga bakteri yaitu Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia dan Porphyromonas gingivalis, ditetapkan sebagai agen etiologi dari periodontitis. Pencantuman Aggregatibacter actinomycetemcomitans dalam daftar etiologi didasarkan oleh hasil penelitian yang dilakukan terhadap subjek yang sehat dan subjek yang menderita penyakit periodontal. Adanya kehadiran bakteri tersebut dapat mencetuskan terjadinya penyakit periodontal.13

Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan anggota dari Pasteurellaceae. Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan bakteri yang sangat halus, fakultatif anaerob, nonmotile, tidak berspora, merupakan bakteri batang kecil negatif Gramm, dan memiliki ukuran 0,4-0,5 μm x 1,0-1,5 μm. Secara mikroskopis, selnya akan tampak seperti coccobacillary, terutama jika koloninya langsung diisolasi dari medium padat. Bentuk yang panjang akan terlihat pada pewarnaan gram dari kultur yang berumur lebih dari 3 hari atau dari pertumbuhan sel dalam glucose-containing liquid medium. Agen imunodominan dari Aggregatibacter

actinomycetemcomitans merupakan sebuah massa bermolekul tinggi O-polisakarida dari lipopolisakarida.13

Gambar 1. Aggregatibacter actinomycetemcomitans24

2.1.2 Peranan dalam Penyakit Periodontal

Aggregatibacter actinomycetemcomitans dapat menghasilkan faktor virulensi yang dapat meningkatkan kemampuannya untuk bertahan pada rongga mulut. Faktor-faktor virulensi tersebut terlibat dalam patogenesis periodontitis. Faktor-Faktor-faktor virulensi tersebut antara lain:

1. Faktor yang mendorong kolonisasi dan ketahanan pada rongga mulut: adesin, invasin, bakteriosin, ketahanan terhadap antibiotik.

2. Faktor yang menghalangi pertahanan inang: leukotoksin, penghambat kemotaktik, protein imunosupresif, dan fc-binding protein.

3. Faktor yang merusak jaringan inang: sitotoksin, kolagenase, agen resorpsi tulang, stimulator dari mediator inflamasi.

4. Faktor yang menghambat kemampuan inang untuk memperbaiki jaringan: penghambat proliferasi fibroblas, penghambat pembentukan tulang.16

2.1.2.1 Leukotoksin

Leukotoksin Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan protein yang termasuk dalam anggota dari toksin RTX (Repeats in Toxin). Produksi dari leukotoksin diatur oleh genotip dan faktor lingkungan. Leukotoksin tersimpan dalam vesikel membran dari bakteri.25 Toksin RTX dapat diproduksi oleh berbagai bakteri negatif Gramm (E. Coli, Bordetella pertussis, Vibrio cholera, Vibrio vulnificus, dan lain-lain), dan belakangan ini, anggota dari Pasteurellaceae juga diketahui dapat memproduksi toksin ini.13

Oleh karena adanya leukotoksin pada bakteri ini, maka bakteri dapat menginduksi faktor pro-inflamasi dan agen kerusakan jaringan, menghambat aksi pembunuhan oleh komponen antibakterial dari imunitas (fagosit) dan melindungi bakteri dari immune mediated killing. Leukotoksin juga telah menunjukkan dapat membunuh polimorfonuklear leukosit dan monosit, serta limfosit. Selain itu, leukotoksin juga dapat memblok proses dari pengambilan bakteri untuk difagositosis. Pembunuhan terhadap leukosit dapat menginduksi terjadinya apoptosis. Apoptosis merupakan suatu proses yang kompleks yang dapat menginduksi kematian dari reseptor permukaan sel dan jalur pengaturan mitokondria.13

2.1.2.2 Lipopolisakarida

Lipopolisakarida merupakan komponen utama pada membran terluar dari bakteri negatif Gramm.26 Lipopolisakarida (endotoksin) memiliki efek yang besar terhadap terjadinya kerusakan dari sel dan jaringan inang. Lipopolisakarida yang dihasilkan Aggregatibacter actinomycetemcomitans dapat menstimulasi makrofag untuk menghasilkan interleukin (interleukin 1α, interleukin 1 ) dan Tumor Necrosis Factor (TNF) yang kemudian berdampak pada terjadinya inflamasi dan resorpsi tulang alveolar.16 Mekanisme dari resopsi tulang tersebut terjadi karena lipopolisakarida mengaktivasi komplemen yang kemudian menstimulasi prostaglandin.26

2.1.2.3 Kolagenase dan Sitotoksin

Pengurangan dari kepadatan serat kolagen gingiva merupakan gambaran yang umum tampak pada pernyakit periodontal. Aggregatibacter actinomycetemcomitans mempunyai kemampuan untuk menghasilkan kolagenase yang dapat mempengaruhi kepadatan dari serat kolagen.16 Selain itu, Aggregatibacter actinomycetemcomitans juga dapat menghasilkan kolagenolitik proteinase yang dapat meyerang kolagen tipe 1. Hal ini akan menyebabkan degradasi dari kolagen dan kerusakan jaringan ikat pada jaringan periodontal.26 _{Aggregatibacter actinomycetemcomitans juga menghasilkan} sitotoksin yang dapat menghambat proliferasi dari fibroblas yang merupakan salah satu sel yang penting dalam jaringan ikat gingiva.16

2.2 Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.)

Jeruk purut termasuk suku Rutaceae yang berasal dari Asia Tenggara dan banyak ditanam di beberapa negara termasuk Indonesia.20 _{Jeruk purut mempunyai} beberapa nama umum yaitu Jeruk purut (Indonesia), Caffir lime (Inggris), Limau purut (Melayu), Luuk makruut (Thailand), Kabuyaw (Filipina), Ma feng cheng (China), dan Kobu mikan (Jepang).27

Secara taksonomi, buah jeruk purut atau Citrus hystrix D.C. diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Sprematophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (Berkeping dua/ dikotil) Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Sapindales Famili : Rutaceae Genus : Citrus

Gambar 2. Jeruk purut28

2.2.1 Morfologi Tanaman

Citrus hystrix D.C. termasuk tumbuhan berkayu, mempunyai pohon dengan tinggi 5 - 7,5 m. Pohonnya memiliki batang tegak, bulat, percabangan simpodial, berduri, dan berwarna hijau. Daunnya tunggal, lonjong, ujung meruncing, pangkal membulat, panjang 4 - 5,5 cm, lebar 2 - 2,5 cm, petulangan menyirip, dan memiliki permukaan yang berbintik hijau. Bunganya majemuk, berbentuk tandan, dengan tangkai yang berbentuk silindris, panjang ± 2 cm, dan dengan kelopak berbentuk bintang berwarna hijau kekuningan. Benang sarinya silindris, panjang 3 - 6 mm berwarna putih, sedangkan tangkai putik berbentuk silindris dengan panjang 3 - 5 mm, kepala putik bulat kuning, mahkota lima helai, bentuk bintang dan berwarna putih. Bakal buahnya berkedudukan lebih tinggi daripada tepi dasar bunga dan tidak berlekatan dengan dasar bunga. Buahnya bulat, diameter 4 - 5 cm, dengan permukaan berkerut dan berwarna hijau. Bijinya bulat telur berwarna putih. Daging buahnya hijau, rasanya sangat asam dan agak pahit. Akarnya merupakan akar tunggal berwarna putih kekuningan.21

2.2.2 Kandungan Kimia

Jeruk purut memiliki rasa agak asin, kelat, dan bersifat sebagai stimulan serta penyegar.29 Citrus hystrix D.C. mengandung (S)-3,7dimetil-6-oktenal, oktilen, α -pinen, kamfen, -pinen, -felandren, metil heptanon, -terpinen, d-limonen, oktil aldehid, α-terpineol, sitral, linalil asetat, bisabolen, kadinen, suatu seskuiterpen

alkohol, asam-asam, asam asetat, sitronellal, senyawa berdasar pheophorbide-a dan – b, serta gliseroglikolipid.21

Kulit buahnya mengandung tanin, steroid triterpenoid, minyak atsiri yang mengandung sitrat, saponin, polifenol, miyak atsiri sirtonellal, linalol, geraniol, hidroksi sitronellal, linalil asetat, flavonoid rutin, naringin, dan hesperidin.21

2.3 Efek Farmakologis Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.)

Secara umum, jeruk purut dapat digunakan untuk mengobati influenza, kulit yang bersisik atau mengelupas, badan yang terasa lelah, dan mewangikan rambut.30 Selain itu, efek fakmakologis lain dari jeruk purut yaitu dapat digunakan sebagai antispasmodik dan antiseptik.29

2.3.1 Naringin

Buah jeruk merupakan sumber buah yang kaya akan flavon dan polymethoxylated flavonoid yang jarang terkandung pada tumbuhan lainnya. Naringin merupakan salah satu polymethoxylated flavonoid.31,32 Naringin merupakan suplemen yang diakui oleh Food and Drugs Association, yang terbukti dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen yang menjadi penyebab penyakit periodontal dan mikroorganisme lainnya yang secara umum terdapat pada rongga mulut. Naringin telah terbukti efektif terutama dalam menghambat pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans dan Porphyromonas gingivalis secara signifikan dalam waktu 3 jam dan menunjukkan efek yang lebih dengan peningkatan waktu inkubasi dan konsentrasi naringin.10 Naringin dapat menurunkan jumlah bakteri dan dapat menurunkan level dari plasma lipopolisakarida (LPS). Selain itu, naringin juga dapat menekan Tumor Necrosis Factor (TNF-α) dan menstabilkan faktor pembekuan darah yang disebabkan oleh infeksi.33

Gambar 3. Struktur kimia naringin34

2.3.2 Tanin

Tanin merupakan polifenol yang dapat diperoleh dari berbagai bagian dari tanaman. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa tanin memiliki efek antiviral, antibakteri, dan antiparasit. Beberapa tahun terakhir juga telah dilakukan penelitian yang menunjukkan efek tanin dalam melawan kanker dengan mekanisme yang berbeda. Penelitian juga menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi dari tanin sejalan dengan peningkatan antibakterinya.35

Tanin merupakan senyawa polifenol kompleks yang dapat ditemukan pada beberapa tanaman. Sama halnya dengan polifenol, tanin juga dapat menunjukkan efek antioksidan dan aktivitas antibakteri. Tanin menghambat pertumbuhan bakteri dan merusak dinding sel sitoplasma yang menyebabkan kerusakan stuktur bakteri secara cepat. Beberapa penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa efek antimikroba tanin yaitu dengan menginaktivasi adhesin mikroba dan enzim hidrolitik sepeti protease dan karbohidrolase dan sel transpot protein.36

2.3.3 Saponin

Tanaman-tanaman merupakan sumber saponin. Aktivitas antimikroba dari beberapa tipe saponin yang berbeda dari beberapa ekstrak tanaman telah dipercaya memiliki aktivitas bakterisidal dan fungisidal. Beberapa penelitian juga menunjukkan bahwa saponin yang diperoleh dari ekstrak beberapa tumbuhan memilki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Streptococcus mitis, Staphylococcus aureus dan Lactobacillus acidophilus.38 Penelitian lainnya menunjukkan bahwa saponin dapat menghambat pertumbuhan S. aureus pada konsentrasi 50 dan 25 mg/ml.39 _Saponin dapat menstimulasi sistem imun yang dimediasi sel untuk meningkatkan produksi dari antibodi. Saponin juga dapat menghambat infeksi dari beberapa protozoa seperti Plasmodium falciparum, Giardia trophozoites, dan Leishmania. Saponin memiliki efek deterjen terhadap membran sel.40

Saponin memiliki aktivitas antifungi dan antibakterial berspektrum luas, gugus lipofilik pada saponin dapat merusak membran sel. Saponin juga dapat meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri, menyebabkan denaturasi protein membran sehingga membran sel akan rusak dan lisis.23

Gambar 5. Struktur kimia saponin41

2.3.4 Minyak Atsiri

Salah satu alternatif antibakteri alami adalah minyak atsiri dari kulit buah jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) yang mengandung D-Limonen, Simena, Sitronela, pinena yang merupakan senyawa dengan khasiat antibakteri. Zat antibakteri tersebut memiliki mekanisme untuk melawan bakteri Escherichia coli sebagai salah satu

penyebab diare dan Staphylococcus aureus sebagai penyebab timbulnya abses pada luka.42

Komposisi kimia dari minyak atsiri kulit jeruk purut adalah monoterpene hydrocarbons, dengan limonene (30,73%) dan -pinene (18,76%) sebagai komponen utama, sedangkan komponen minornya adalah terpinene-4-ol (10,63%), α-terpineol (8,35%), -terpinene (6,18%), α-terpinene (5,09%), dan terpinolene (4,33%). Minyak atsiri dari jeruk purut memiliki efek antibakteri terhadap beberapa bakteri seperti Propionibacterium acnes, Bacillus, Staphylococcus epidermis, Escerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.43 _{Kandungan minyak atsiri} dari kulit jeruk purut dapat menghambat respirasi dari sel bakteri.44

2.4 Pengujian Laboratorium untuk Mengetahui Sensitivitas Antimikroba Aksi dari obat antimikroba dalam melawan pertumbuhan organisme dapat dihitung secara kualitatif yaitu dengan pengujian difusi cakram dan secara kuantitatif yaitu untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (KHM) atau konsentrasi bunuh minimum (KBM). Pengujian dengan difusi cakram merupakan metode yang paling umum digunakan untuk menguji sensitivitas mikroorganisme terhadap agen antimikroba. Bakteri yang akan diuji diisolasi kemudian ditempatkan pada keseluruhan permukaan dari plat agar, kemudian kertas cakram penyaring yang telah berisi obat ditempatkan. Setelah dilakukan inkubasi selama satu malam pada suhu 37˚C, zona hambat diamati pada sekeliling masing-masing cakram, yang tergantung pada sensitivitas dari masing-masing organisme.45

Penentuan KHM dan KBM akan memberikan suatu penaksiran secara kuantitatif terhadap potensi dari suatu antimikroba. Metode ini biasanya juga disebut sebagai metode dilusi tabung. Konsentrasi minimum dari suatu obat yang dapat menghambat pertumbuhan dari organisme yang diuji/ konsentrasi terendah yang akan menghambat pertumbuhan yang tampak secara in vitro disebut sebagai kadar hambat minimum (KHM)/ Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Sedangkan, konsentrasi minimum yang dibutuhkan suatu obat untuk membunuh organisme/ konsentrasi minimum dari suatu obat yang dapat membunuh 99,9% dari

mikroorganisme yang diuji disebut sebagai kadar bunuh minimum (KBM)/ Minimum Bactericidal Concentration (MBC).45

2.5 Kerangka Teori Penyakit Periodontal Obat Herbal Antibiotik Jeruk Purut Naringin Buah Minyak Atsiri Saponin Tanin Menghambat respirasi dari sel bakteri Meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri Menginaktivasi adhesin mikroba dan enzim hidrolitik Menurunkan jumlah bakteri dan lipopolisakarida Periodontitis

Daun Kulit Plak Bakteri Daya Antibakteri Patogen Periodontal Aggregatibacter actinomycetemcomitans

2.6 Kerangka Konsep

Variabel Bebas:

Ekstrak kulit jeruk purut (100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%).

Variabel Tergantung:

Pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans

- Uji hambat bakteri (metode dilusi)

Variabel Tekendali:

- Keseragaman kondisi jeruk purut yang digunakan - Cara ekstraksi

- Lama penyimpanan, lama pengiriman, suhu saat pengiriman bahan coba (ekstrak etanol kulit jeruk purut) ke laboratorium - Cara pengeringan - Waktu pengeringan

Variabel Tak Terkendali:

- Pola pemeliharaan tanaman jeruk purut

- Kondisi tanah tempat tanaman jeruk purut ditanam

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit periodontal merupakan inflamasi kronis dari jaringan periodontal.1 Penyakit ini ditandai dengan perdarahan pada gingiva, kerusakan pada jaringan pendukung dan kehilangan tulang alveolar.2 Penyakit periodontal diderita oleh hampir 90% penduduk dunia dan merupakan penyebab terbesar kehilangan gigi pada individu dewasa yang berusia 30 tahun ke atas.3 Secara umum, penyakit periodontal terbagi dua yaitu gingivitis dan periodontitis.4 Pada tahun 2009 sampai 2010, total prevalensi periodontitis pada individu dewasa di Amerika Serikat yang berusia 30 tahun ke atas adalah 47,2%.5 _{Laporan Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT)} Depkes RI pada tahun 2001 menyatakan bahwa prevalensi karies gigi dan penyakit periodontal di Indonesia merupakan yang tertinggi, meliputi 60% jumlah penduduk di Indonesia.3 _{Penelitian oleh Situmorang N. di kota Medan menunjukkan bahwa} prevalensi penyakit periodontal mencapai 96,58% pada semua kelompok umur.6

Penyakit periodontal merupakan jenis penyakit yang diakibatkan oleh akumulasi plak bakteri sebagai etiologi utama disertai dengan faktor lingkungan, sistemik, dan faktor lainnya yang berperan sebagai faktor sekunder.1,7 Semua spesies bakteri yang ditemukan dalam plak diyakini mampu menimbulkan penyakit periodontal.7 Pada penyakit periodontal akan terjadi interaksi antara bakteri patogen dengan jaringan gingiva host.8 Penyakit periodontal secara dominan disebabkan oleh bakteri negatif Gramm, anaerob, atau mikroaerofilik yang terdapat pada daerah subgingiva.9

Periodontitis merupakan suatu kondisi yang dihubungkan dengan bakteri anaerob negatif Gramm seperti Aggregatibacter sp., Porphyromonas gingivalis, Prevotella sp. dan Fusobacterium sp.10 Salah satu patogen yang berkaitan dengan

periodontitis adalah Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan bakteri yang berasal dari famili Pasterurellaceae.11 Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah bakteri negatif Gramm nonmotile yang berada pada rongga mulut.12 Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan bakteri yang sangat halus, fakultatif anaerob, tidak berspora, dan memiliki ukuran 0,4-0,5 μm x 1,0-1,5 μm.13 Mikroorganisme ini memproduksi berbagai faktor virulensi, seperti lipopolisakarida, leukotoksin, cytolethal distending toxin (CDT).14

Aggregatibacter actinomycetemcomitans dapat merusak jaringan dengan cara merangsang inflamasi, menyebabkan destruksi jaringan dan menghambat penyembuhan jaringan.15 _{Lipopolisakarida yang dihasilkan Aggregatibacter} actinomycetemcomitans dapat menstimulasi makrofag yang berdampak pada terjadinya inflamasi dan resorpsi tulang alveolar.16 _{Bakteri Aggregatibacter} actinomycetemcomitans juga memiliki kemampuan yang tinggi dalam memproduksi leukotoksin yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan periodontal.7 Leukotoksin juga bersifat toksik terhadap sel imun host.17

Penggunaan terapi mekanis terhadap penyakit peridontal belum dapat menghilangkan bakteri yang menginvasi jaringan lunak periodontal secara keseluruhan. Antimikroba digunakan untuk menunjang keefektivitasan dari terapi secara mekanis seperti scaling dan root planing.4 Akan tetapi, penggunaan antimikroba dapat menyebabkan perkembangan dari mikroorganisme yang multiresisten dan dapat menimbulkan berbagai efek samping.18

Tanaman obat telah digunakan sebagai pengobatan tradisional pada berbagai penyakit yang ada selama beberapa tahun. Pada negara-negara berkembang, khususnya daerah pedesaan, tanaman obat telah digunakan sebagai sumber pengobatan yang utama. Sekitar 80% dari penduduk negara berkembang menggunakan obat tradisional untuk menjaga kesehatan. Produk alami yang berasal dari tanaman obat telah terbukti kaya akan sumber biologi yang aktif.10 _{Tanaman obat} telah banyak digunakan pada negara-negara berkembang sebagai pengobatan alternatif untuk masalah kesehatan. Beberapa tanaman telah diteliti melalui aktivitas

aktimikroba terhadap beberapa bakteri patogen di rongga mulut. Beberapa penelitian juga menunjukkan bahwa produk alam memiliki agen antibakteri alami terhadap beberapa bakteri patogen di rongga mulut.19

Salah satu tanaman yang memiliki aktivitas antimikroba adalah tanaman jeruk purut. Tanaman jeruk purut termasuk suku Rutaceae yang berasal dari Asia Tenggara dan banyak ditanam di beberapa negara termasuk Indonesia.20 Kulit buahnya mengandung tanin, steroid triterpenoid, minyak atsiri yang mengandung sitrat, saponin, polifenol, sirtonellal, linalol, geraniol, hidroksi sitronellal, linalil asetat, flavonoid rutin, naringin, dan hesperidin.21 _{Penelitian yang dilakukan oleh} Chaisawadi menunjukkan bahwa kulit jeruk purut memiliki daya antibakteri terhadap bakteri Bacillus cereus,Salmonella typii, dan Staphylococcus aureus.22 _Penelitian yang dilakukan Ellyana pada tahun 2008 secara in vitro menunjukkan bahwa pemberian ekstrak kulit buah jeruk purut memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Salmonella typii dengan KHM (Kadar Hambat Minimum) pada konsentrasi 0,625% dan KBM (Kadar Bunuh Minimum) pada konsentrasi 1,25 - 2,5%. Penelitian lainnya oleh Setyohadi menunjukkan bahwa KBM (Kadar Bunuh Minimum) konsentrasi ekstrak kulit buah jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Streptococcus mutans adalah pada konsentrasi 4%.23

Berdasarkan kandungan yang ada pada kulit jeruk purut tersebut, penulis merasa tertarik dan perlu untuk melakukan penelitian mengenai “Efektivitas ekstrak kulit jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans”.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah ekstrak kulit jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans dan berapa konsentrasi daya hambat serta daya bunuh minimum ekstrak kulit jeruk purut yang dapat menghambat bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans?

1.3 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui daya hambat ekstrak kulit jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans dan untuk mengetahui konsentrasi daya hambat serta daya bunuh minimum ekstrak kulit jeruk purut yang dapat menghambat bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

1.4 Hipotesis Penelitian

Ekstrak kulit jeruk purut dapat menghambat bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

1.5 Manfaat Penelitian

1. Potensi pendayagunaan kulit buah jeruk purut yang ada di Indonesia sebagai bahan alternatif medikamen khususnya pada perawatan penyakit periodontal.

2. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi tambahan ilmu pengetahuan dalam bidang kedokteran gigi mengenai daya hambat ekstrak kulit jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Fakultas Kedokteran Gigi Departemen Periodonsia Tahun 2014

Widianto Meydhyono

Efektivitas Ekstrak Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) Terhadap Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans Secara In Vitro

xii + 45 halaman

Penyakit periodontal merupakan inflamasi kronis dari jaringan periodontal. Penyakit periodontal secara dominan disebabkan oleh bakteri negatif Gramm, anaerob, atau mikroaerofilik yang terdapat pada daerah subgingiva. Secara umum, penyakit periodontal terbagi dua yaitu gingivitis dan periodontitis. Salah satu patogen yang berkaitan dengan periodontitis adalah Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Aggregatibacter actinomycetemcomitans dapat merusak jaringan dengan cara merangsang inflamasi, menyebabkan destruksi jaringan dan menghambat penyembuhan jaringan.

Antimikroba digunakan untuk menunjang keefektivitasan dari terapi secara mekanis. Tanaman obat telah digunakan sebagai pengobatan tradisional pada berbagai penyakit. Salah satu tanaman yang memiliki aktivitas antimikroba adalah tanaman jeruk purut. Kulit jeruk perut memiliki senyawa antibakteri seperti naringin, tanin, saponin, dan minyak atsiri. Beberapa penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kulit jeruk purut efektif terhadap beberapa bakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas ekstrak kulit jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Penelitian ini dimulai dengan pembuatan ekstrak kulit jeruk purut sehingga diperoleh ekstrak kental kulit jeruk purut. Penelitian dilanjutkan dengan melakukan pengenceran bahan coba sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%. Selanjutnya dilakukan pembuatan media bakteri dan pembiakan spesimen. Penelitian dilanjutkan dengan pengujian efektivitas kulit jeruk purut terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans untuk mengetahui nilai KHM dan KBM.

Hasil penelitian didapatkan pada konsentrasi 100% s/d 25% memperlihatkan zona bening yang tidak dijumpai pertumbuhan koloni bakteri atau senilai 0 CFU/ml, sedangkan pada pengujian efek antibakteri ekstrak jeruk purut dengan konsentrasi 12,5% dan 6,25% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri. Hal ini menujukkan bahwa ekstrak kulit jeruk purut efektif terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans dengan nilai KBM sebesar 25%.

Faculty of Dentistry

Department of Periodontology 2014

Widianto Meydhyono

Effectiveness of Kaffir Lime Peel Extract (Citrus hystrix D.C.) Against Aggregatibacter actinomycetemcomitans Bacteria In Vitro

xii + 45 pages

Periodontal disease is a chronic inflammation of the periodontal tissues. Periodontal disease is predominantly caused by the Gramm negative bacteria, anaerobic, or microaerophilic contained in the subgingival area. In general, periodontal disease is divided into two, namely gingivitis and periodontitis. One of the pathogens associated with periodontitis is Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Aggregatibacter actinomycetemcomitans can damage tissue by stimulating inflammation, leading to tissue destruction and inhibit tissue healing.

Antimicrobials are used to support the effectiveness of mechanical therapy. Medicinal plants have been used as a traditional medicine in various diseases. One of the plants that have antimicrobial activity is kaffir lime. Kaffir lime peel has antibacterial compounds such as naringin, tannins ,saponins, and essential oils. Several previous studies have shown that kaffir lime peel effective against some bacteria. The purpose of this study was to determine the effectiveness of kaffir lime peel extract (Citrus hystrix D.C.) against Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria.

kaffir lime peel extract. Research is continuing with making dilution of the sample to obtain the extract concentration of 100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, and 6.25 %. Furthermore done media creation and breeding of bacteria specimens. Research is continuing to test the effectiveness of kaffir lime peel against Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria to determine the MIC and MBC values.

Research results obtained at a concentration of 100 % - 25 % showed a clear zone and bacterial colony growth is not found or value 0 CFU / ml, whereas the antibacterial effects testing lime extract with a concentration of 12.5 % and 6.25 % found the growth of bacteria. This shows that the kaffir lime peel extract is effective against Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria with MBC value of 25%. References : 48 (2001-2013).

EFEKTIVITAS EKSTRAK KULIT JERUK PURUT

(Citrus hystrix D.C.) TERHADAP BAKTERI

Aggregatibacter actinomycetemcomitans

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi tugas dan melengkapi syarat memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi

Oleh :

WIDIANTO MEYDHYONO NIM : 100600045

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Fakultas Kedokteran Gigi Departemen Periodonsia Tahun 2014

Widianto Meydhyono

Efektivitas Ekstrak Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) Terhadap Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans Secara In Vitro

xii + 45 halaman

Penyakit periodontal merupakan inflamasi kronis dari jaringan periodontal. Penyakit periodontal secara dominan disebabkan oleh bakteri negatif Gramm, anaerob, atau mikroaerofilik yang terdapat pada daerah subgingiva. Secara umum, penyakit periodontal terbagi dua yaitu gingivitis dan periodontitis. Salah satu patogen yang berkaitan dengan periodontitis adalah Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Aggregatibacter actinomycetemcomitans dapat merusak jaringan dengan cara merangsang inflamasi, menyebabkan destruksi jaringan dan menghambat penyembuhan jaringan.

Antimikroba digunakan untuk menunjang keefektivitasan dari terapi secara mekanis. Tanaman obat telah digunakan sebagai pengobatan tradisional pada berbagai penyakit. Salah satu tanaman yang memiliki aktivitas antimikroba adalah tanaman jeruk purut. Kulit jeruk perut memiliki senyawa antibakteri seperti naringin, tanin, saponin, dan minyak atsiri. Beberapa penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kulit jeruk purut efektif terhadap beberapa bakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas ekstrak kulit jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Penelitian ini dimulai dengan pembuatan ekstrak kulit jeruk purut sehingga diperoleh ekstrak kental kulit jeruk purut. Penelitian dilanjutkan dengan melakukan pengenceran bahan coba sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%. Selanjutnya dilakukan pembuatan media bakteri dan pembiakan spesimen. Penelitian dilanjutkan dengan pengujian efektivitas kulit jeruk purut terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans untuk mengetahui nilai KHM dan KBM.

Hasil penelitian didapatkan pada konsentrasi 100% s/d 25% memperlihatkan zona bening yang tidak dijumpai pertumbuhan koloni bakteri atau senilai 0 CFU/ml, sedangkan pada pengujian efek antibakteri ekstrak jeruk purut dengan konsentrasi 12,5% dan 6,25% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri. Hal ini menujukkan bahwa ekstrak kulit jeruk purut efektif terhadap bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans dengan nilai KBM sebesar 25%.

Faculty of Dentistry

Department of Periodontology 2014

Widianto Meydhyono

Effectiveness of Kaffir Lime Peel Extract (Citrus hystrix D.C.) Against Aggregatibacter actinomycetemcomitans Bacteria In Vitro

xii + 45 pages

Periodontal disease is a chronic inflammation of the periodontal tissues. Periodontal disease is predominantly caused by the Gramm negative bacteria, anaerobic, or microaerophilic contained in the subgingival area. In general, periodontal disease is divided into two, namely gingivitis and periodontitis. One of the pathogens associated with periodontitis is Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Aggregatibacter actinomycetemcomitans can damage tissue by stimulating inflammation, leading to tissue destruction and inhibit tissue healing.

Antimicrobials are used to support the effectiveness of mechanical therapy. Medicinal plants have been used as a traditional medicine in various diseases. One of the plants that have antimicrobial activity is kaffir lime. Kaffir lime peel has antibacterial compounds such as naringin, tannins ,saponins, and essential oils. Several previous studies have shown that kaffir lime peel effective against some bacteria. The purpose of this study was to determine the effectiveness of kaffir lime peel extract (Citrus hystrix D.C.) against Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria.

kaffir lime peel extract. Research is continuing with making dilution of the sample to obtain the extract concentration of 100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, and 6.25 %. Furthermore done media creation and breeding of bacteria specimens. Research is continuing to test the effectiveness of kaffir lime peel against Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria to determine the MIC and MBC values.

Research results obtained at a concentration of 100 % - 25 % showed a clear zone and bacterial colony growth is not found or value 0 CFU / ml, whereas the antibacterial effects testing lime extract with a concentration of 12.5 % and 6.25 % found the growth of bacteria. This shows that the kaffir lime peel extract is effective against Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria with MBC value of 25%. References : 48 (2001-2013).

PERNYATAAN PERSETUJUAN

Skripsi ini telah disetujui untuk dipertahankan di hadapan tim penguji skripsi

Medan, 28 Januari 2014

Pembimbing: Tanda tangan

1. Pitu Wulandari, drg., S. Psi., Sp. Perio ….……… NIP : 197905142005022001

TIM PENGUJI SKRIPSI

Skripsi ini telah dipertahankan di hadapan tim penguji pada tanggal 28 Januari 2014

TIM PENGUJI

KETUA : Pitu Wulandari, drg., S. Psi., Sp. Perio ……..……… ANGGOTA : 1. Irmansyah Rangkuti, drg., Ph.D ……..………. 2. Aini Hariyani Nasution, drg., Sp. Perio ……..……….

Mengetahui, KETUA DEPARTEMEN

Irmansyah Rangkuti, drg., Ph.D ……..……….

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi.

Rasa terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada kedua orang tua tersayang yang senantiasa menyayangi, mendoakan dan mendukung penulis sehingga penulis dapat mengecap masa pendidikan hingga selesai di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara Medan.

Dalam penulisan skripsi ini, penulis juga telah banyak mendapat bimbingan, bantuan, motivasi, saran-saran serta doa dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati serta penghargaan yang tulus penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. Nazaruddin, drg., C.Ort., PhD., Sp.Ort, selaku Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

2. Irmansyah R., drg., PhD, selaku Ketua Departemen Periodonsia Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

3. Pitu Wulandari, drg., S.Psi., Sp.Perio, selaku dosen pembimbing skripsi yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan pikirannya dalam memberikan bimbingan, masukan dan semangat kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

4. Dosen penguji skripsi (Irmansyah R., drg., PhD dan Aini Hariyani Nasution, drg., Sp.Perio) atas saran dan masukan sehingga skripsi ini dapat lebih

baik.

5. Cut Nurliza, drg., M.Kes, selaku dosen pembimbing akademik yang telah memberikan perhatian dan motivasi kepada penulis selama menjalani pendidikan di FKG USU.

6. Seluruh staf pengajar di Departemen Periodonsia FKG USU yang telah banyak memberikan saran dalam penyelesaian skripsi ini.

7. Drs. Awaluddin Saragih, M.Si, Apt., selaku Kepala Laboratorium Obat Tradisional Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah meluangkan waktu, tenaga, pikiran dan bimbingan dalam melakukan pembuatan ekstrak.

8. Wahyu Hidayatningsih, S.Si., M.Kes, selaku penanggung jawab pengujian di Rumah Sakit Penyakit Tropik Infeksi Universitas Airlangga yang telah meluangkan waktu, tenaga, pikiran dan bimbingan dalam melakukan uji bakteri.

9. M. Zulkarnain, drg., M.Kes., selaku Pembantu Dekan I FKG USU yang telah memberikan izin untuk melakukan penelitian.

10. Terima kasih penulis sampaikan kepada teman-teman seperjuangan skripsi di Departemen Periodonsia, Gebby, Nazim, Arisma, Shinta, Hazwani, Shelly, Brian, Izza, Yolanda, Ayu, Nastiti, dan Vika.

11. Para sahabat penulis, Franky, Wilson, Kelvin, Robin, Sondi, Roderick yang telah memberikan semangat, doa dan dukungan selama studi dan penelitian ini.

Penulis menyadari penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna karena ada kelemahan dan keterbatasan ilmu yang penulis miliki, namun penulis mengharapkan kiranya hasil karya sederhana ini dapat memberikan sumbangan pikiran yang berguna bagi fakultas, pengembangan ilmu dan masyarakat.

Medan, 28 Januari 2014 Penulis,

(Widianto Meydhyono) NIM : 100600045

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ...

HALAMAN PERSETUJUAN ... HALAMAN TIM PENGUJI SKRIPSI ...

KATA PENGANTAR ... iv

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR TABEL ... ix

DAFTAR GAMBAR ... x

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian ... 4

1.4 Hipotesis Penelitian ... 4

1.5 Manfaat Penelitian ... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ... 5

2.1.1 Karakteristik Umum ... 5

2.1.2 Peranan dalam Penyakit Periodontal ... 6

2.1.2.1 Leukotoksin ... 7

2.1.2.2 Lipopolisakarida ... 7

2.1.2.3 Kolagenase dan Sitotoksin ... 8

2.2 Jeruk Purut ... 8

2.2.1 Morfologi Tanaman ... 9

2.2.2 Kandungan Kimia ... 9

2.3 Efek Farmakologis Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.)... 10

2.3.1 Naringin ... 10

2.3.2 Tanin ... 11

2.3.3 Saponin ... 12

2.4 Pengujian Laboratorium untuk Mengetahui Sensitivitas

Antimikroba ... 13

2.5 Kerangka Teori ... 15

2.6 Kerangka Konsep ... 16

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1Jenis Penelitian ... 17

3.2Tempat dan Waktu Penelitian ... 17

3.2.1 Tempat Penelitian ... 17

3.2.2 Waktu Penelitian ... 17

3.3Sampel dan Besar Sampel Penelitian ... 17

3.3.1 Sampel Penelitian ... 17

3.3.2 Besar Sampel Penelitian ... 17

3.4 Variabel Penelitian ... 19

3.5 Definisi Operasional... 19

3.6Bahan dan Alat Penelitian ... 20

3.6.1 Bahan Penelitian ... 20

3.6.2 Alat Penelitian ... 20

3.7Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data ... 21

3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut ... . 21

3.7.2 Pengenceran Bahan Coba ... 25

3.7.3 Pembuatan Media Bakteri ... 25

3.7.4 Pembiakan Spesimen ... 26

3.7.5 Penentuan KHM Bahan Coba ... 27

3.7.6 Penentuan KBM Bahan Coba ... 28

3.8 Skema Alur Penelitian... 29

3.9 Analisis Data ... 30

BAB 4 HASIL PENELITIAN 4.1 Ekstraksi Kulit Jeruk Purut ... 31

4.2 Uji Efektivitas Antibakteri ... 31

BAB 5 PEMBAHASAN ... 35

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ... 40

6.2 Saran ... 40

DAFTAR PUSTAKA ... 41 LAMPIRAN

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1 Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba ekstrak kulit jeruk

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ... 6

2 Jeruk purut ... 9

3 Struktur kimia naringin ... 11

4 Struktur kimia tanin ... 11

5 Struktur kimia saponin ... 12

6 Tanaman buah jeruk purut yang berasal dari Kelurahan Tegal Sari, Kecamatan Medan Denai ... 22

7 Jeruk purut dicuci dan dibersihkan dari kotoran ... 22

8 Kulit jeruk purut diiris tipis-tipis dan dikeringkan dalam lemari pengering ... 23

9 Kulit jeruk purut yang sudah kering dihaluskan ... 23

10 Simplisia dimaserasi dalam etanol 96% selama 3 jam ... 24

11 Penampungan perkolat ... 24

12 Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator ... 25

13 Ekstrak kental kulit jeruk purut ... 25

14 Media dimasukkan ke dalam autoklaf dan dituangkan ke masing-masing petri ... 26

15 Biakan murni Aggregatibacter actinomycetemcomitans ... 27

16 Suspensi bakteri dimasukkan ke bahan coba dan diinkubasi selama 24 jam ... 28

18 Ekstrak kental kulit jeruk purut ... 31 19 Hasil peletakan tetesan ekstrak kulit jeruk purut dengan

konsentrasi 100%, 50%, dan 25% ... 33 20 Hasil peletakan tetesan ekstrak kulit jeruk purut dengan

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1 Jadwal kegiatan

2 Rencana anggaran penelitian

3 Data hasil perhitungan jumlah bakteri 4 Hasil identifikasi/ determinasi tumbuhan

vii DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... HALAMAN PERSETUJUAN ... HALAMAN TIM PENGUJI SKRIPSI ...

KATA PENGANTAR ... iv

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR TABEL ... ix

DAFTAR GAMBAR ... x

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian ... 4

1.4 Hipotesis Penelitian ... 4

1.5 Manfaat Penelitian ... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ... 5

2.1.1 Karakteristik Umum ... 5

2.1.2 Peranan dalam Penyakit Periodontal ... 6

2.1.2.1 Leukotoksin ... 7

2.1.2.2 Lipopolisakarida ... 7

2.1.2.3 Kolagenase dan Sitotoksin ... 8

2.2 Jeruk Purut ... 8

2.2.1 Morfologi Tanaman ... 9

2.2.2 Kandungan Kimia ... 9

2.3 Efek Farmakologis Kulit Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.)... 10

2.3.1 Naringin ... 10

2.3.2 Tanin ... 11

2.3.3 Saponin ... 12

2.4 Pengujian Laboratorium untuk Mengetahui Sensitivitas

Antimikroba ... 13

2.5 Kerangka Teori ... 15

2.6 Kerangka Konsep ... 16

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1Jenis Penelitian ... 17

3.2Tempat dan Waktu Penelitian ... 17

3.2.1 Tempat Penelitian ... 17

3.2.2 Waktu Penelitian ... 17

3.3Sampel dan Besar Sampel Penelitian ... 17

3.3.1 Sampel Penelitian ... 17

3.3.2 Besar Sampel Penelitian ... 17

3.4 Variabel Penelitian ... 19

3.5 Definisi Operasional... 19

3.6Bahan dan Alat Penelitian ... 20

3.6.1 Bahan Penelitian ... 20

3.6.2 Alat Penelitian ... 20

3.7Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data ... 21

3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut ... . 21

3.7.2 Pengenceran Bahan Coba ... 25

3.7.3 Pembuatan Media Bakteri ... 25

3.7.4 Pembiakan Spesimen ... 26

3.7.5 Penentuan KHM Bahan Coba ... 27

3.7.6 Penentuan KBM Bahan Coba ... 28

3.8 Skema Alur Penelitian... 29

3.9 Analisis Data ... 30

BAB 4 HASIL PENELITIAN 4.1 Ekstraksi Kulit Jeruk Purut ... 31

4.2 Uji Efektivitas Antibakteri ... 31

BAB 5 PEMBAHASAN ... 35

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ... 40

6.2 Saran ... 40

DAFTAR PUSTAKA ... 41 LAMPIRAN

ix

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1 Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba ekstrak kulit jeruk

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ... 6

2 Jeruk purut ... 9

3 Struktur kimia naringin ... 11

4 Struktur kimia tanin ... 11

5 Struktur kimia saponin ... 12

6 Tanaman buah jeruk purut yang berasal dari Kelurahan Tegal Sari, Kecamatan Medan Denai ... 22

7 Jeruk purut dicuci dan dibersihkan dari kotoran ... 22

8 Kulit jeruk purut diiris tipis-tipis dan dikeringkan dalam lemari pengering ... 23

9 Kulit jeruk purut yang sudah kering dihaluskan ... 23

10 Simplisia dimaserasi dalam etanol 96% selama 3 jam ... 24

11 Penampungan perkolat ... 24

12 Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator ... 25

13 Ekstrak kental kulit jeruk purut ... 25

14 Media dimasukkan ke dalam autoklaf dan dituangkan ke masing-masing petri ... 26

15 Biakan murni Aggregatibacter actinomycetemcomitans ... 27

16 Suspensi bakteri dimasukkan ke bahan coba dan diinkubasi selama 24 jam ... 28

xi

18 Ekstrak kental kulit jeruk purut ... 31 19 Hasil peletakan tetesan ekstrak kulit jeruk purut dengan

konsentrasi 100%, 50%, dan 25% ... 33 20 Hasil peletakan tetesan ekstrak kulit jeruk purut dengan

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1 Jadwal kegiatan

2 Rencana anggaran penelitian

3 Data hasil perhitungan jumlah bakteri 4 Hasil identifikasi/ determinasi tumbuhan