BAB III METODE KERJA
3.1. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2012 sampai Juli 2012 di Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumber Daya
Lahan serta Lahan milik CV. Meori Agro Jl.Atang Sanjaya KM 4 Pasir Gauk, Bogor.
3.2. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN 3.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Laminar air flow, autoclave, oven, Spectrophotometer, refrigerator, perangkat elektroforesis,
perangkat PCR, Scope UV, timbangan, cawan petri, batang penyebar, erlenmeyer, tabung reaksi, pH meter, shaker, mikropipet, tip mikro, magnetik stirer, inkubator,
tabung ependoff, jarum ose, gelas ukur, alumunium foil, karet gelang, spidol, polybag.
3.2.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terbagi menjadi empat bagian antara lain :
1. Isolasi dan Perbanyakan Mikrob :
Isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro dengan kode P2, J2, PS4, Media Pikovskaya, larutan fisiologis 0.85, Media NB, Media NA.
2. Pengujian Kualitatif dan Kuantitatif :
Larutan PB, Larutan PC, Modified Universal Buffer MUB 1x, 0.5 N NaOH, 0.115 M p-nitro phenyl phosphate p-NPP, 1 mgml p-nitrophenol p-NP ,
akuades, alkohol 95, 3.
Identifikasi Molekuler : Larutan SDS 10, aquabidest steril, bufer TAE, bufer TE yang mengandung
lysozyme, agarosa, larutan loading buffer, NaCl, NaCl-CTAB,
Kloroform:Isoamil 24:1, isopropanol, etanol 70, 16F27 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG- 3’ dan 16R1492 5’- TAC GGY TAC CTT GTT
ACG ACT T-3’, 10 mM dNTP deoxynucleotide triphosphates, 10x bufer Polymerase Chain Reaction PCR, 50 mM MgSO4, enzim Taq DNA
polimerase, dan Etidium Bromida EtBr 4.
Penanaman tanaman sawi sendok : Bibit tanaman sawi sendok berumur 2 minggu, tanah latosol, pupuk kandang,
pupuk anorganik SP-36 dan KCl.
3.3. METODE PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan dalam dua tahap yaitu secara in vitro dan in vivo.
3.3.1. Penelitian secara in vitro
Penelitian secara in vitro dilakukan dalam beberapa tahap yaitu :
a. Tahap Persiapan
Tahapan persiapan penelitian ini meliputi persiapan alat-alat, pembuatan bahan-bahan dan sterilisasi alat serta media yang akan dipakai dalam penelitian.
b. Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Tanah
Pengambilan sampel tanah dan pengisolasian bakteri pelarut fosfat asal tanah latosol dilakukan sebagai pembanding terhadap isolat koleksi CV. Meori Agro.
Tahapan pengambilan tanah dilakukan dengan mengambil tanah di sekitar rizosfer tanaman jagung kemudian tanah tersebut dikeringudarakan. Kemudian sebanyak
10 gram tanah dari bahan tanah dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 90 ml larutan fisiologis kemudian dibuat serial pengenceran sampai 10
-5
. Sebanyak 1 ml dari pengenceran 10
-3
,10
-4
dan 10
-5
dituang di cawan petri kemudian media pikovskaya dituangkan secara merata secara steril dan diinkubasi
selama 2-3 hari pada suhu ruang. Koloni-koloni bakteri pelarut fosfat yang diinginkan selanjutnya dimurnikan dan disimpan di dalam medium agar-miring
Pikovskaya.
c. Identifikasi Molekuler
Identifikasi molekuler ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut, yaitu isolasi DNA genom bakteri, elektroforesis DNA, Polymerase Chain
Reaction PCR, dan sekuensing DNA.
Isolasi DNA Genom Bakteri. Sebanyak 2 ml kultur sel BPF yang
ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu ruang di dalam medium NB disentrifugasi 8049,6 x g, 15 menit untuk memisahkan koloni bakteri dari medium. Supernatan
hasil sentrifugasi dibuang dan pelet dicuci dengan 250 µl bufer TE kemudian pelet diresuspensi menggunakan mikropipet. Hasil resuspensi diinkubasi pada suhu
37 C selama 30 menit kemudian ditambahkan 5
0 μl larutan SDS 10 dan dibolak balik. Selanjutnya suspensi kembali diinkubasi pada suhu 37
C selama 60 menit kemudian ditambahkan 65
μl NaCl dan 80 µl CTAB-NaCl dan diinkubasi dalam waterbath 65ºC, 20 menit. Pada campuran tersebut kemudian ditambahkan 450
μl kloroform: isoamil 24:1, kemudian tabung Eppendoff yang berisi campuran DNA dibolak-balik secara halus. Suspensi yang telah teremulsi disentrifugasi
6763,9 x g, 15 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung Eppendoff steril dan ditambahkan isopropanol yang dingin -20ºC. DNA
diendapkan dengan sentrifugasi pada suhu 4
Proses Elektroforesis DNA. Larutan 50x bufer TAE diencerkan menjadi
2x bufer TAE. Kemudian dibuat gel agarosa 1, yaitu 0,2 gram agarosa dalam 20 ml 2x bufer TAE dan ditambahkan 2 µl Et-Br yang selanjutnya dituang ke dalam
cetakan gel agarosa. Setelah gel membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi 1x bufer TAE sehingga gel terendam. Sebanyak 3
μl dari masing-masing DNA dicampur dengan 1,2
μl loading buffer sebagai pemberat. Suspensi larutan DNA dengan loading buffer diinjeksikan ke dalam
C dengan kecepatan 8049,6 x g selama 20 menit. Supernatan dibuang kemudian dilakukan pencucian
menggunakan etanol 70 dingin dan disentrifugasi 8049,6 x g, 2 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan pelet DNA dikeringudarakan. DNA
yang telah didapatkan siap digunakan untuk elektroforesis atau disimpan sebagai stock pada suhu -20ºC.
sumur-sumur pada gel elektroforesis. Setelah semua sumur terisi, power supply perangkat elektroforesis dinyalakan dengan voltase sebesar 75 V selama ± 45
menit. Selanjutnya DNA dapat dilihat dan difoto menggunakan perangkat UV Transilluminator.
Proses Polymerase Chain Reaction PCR. Proses PCR diawali dengan
pembuatan campuran komponen reaksi untuk PCR sebanyak 50 μl dengan
komposisi sebagai berikut : primer 10 μl 16F27 5’-AGA GTT TGA TCM TGG
CTC AG- 3’, primer 10 μl 16R1492 5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT
T-3’ , 2 μl template DNA, PCR mix 25 µl dan 19 μl aquabidest steril. Running
PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi sebagai berikut, denaturasi siklus awal atau pra-denaturasi 95ºC selama 5 menit, diikuti denaturasi untuk
siklus selanjutnya pada suhu 95ºC selama 1 menit. Penempelan primer annealing dilakukan selama 1 menit pada suhu 55ºC. Polimerisasi dilakukan
selama 2 menit pada suhu 72ºC dan pada siklus terakhir, yaitu siklus ke-35 dilakukan perpanjangan waktu polimerisasi selama 10 menit. Produk hasil PCR
divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.0 dalam 2x bufer TAE dengan voltase 75 volt selama ± 30 menit.
Sekuensing DNA. Produk hasil PCR dikirimkan pada PT. Genetika
Science untuk disekuen di Malaysia. Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen pada database European Bioinformatics Institute EBI
menggunakan piranti FASTA pada situs http:www.ebi.ac.uk.
d. Peremajaan Tiga Isolat Bakteri Koleksi
Kategori