Gambar 11. DNA genom bakteri
c. Identifikasi Bakteri Isolasi DNA
Isolasi DNA bakteri digunakan sebagai awal untuk mendapatkan informasi genetik 4 isolat bakteri terpilih. Isolat bakteri asal tanah yang diidentifikasi secara
molekuler merupakan isolat terpilih yang memiliki hasil IP, pelarutan fosfat pada media pikovskaya cair dan kandungan enzim fosfatase yang tinggi yaitu isolat
bakteri T9 sehingga, terdapat empat isolat bakteri yang akan diidentifikasi secara molekuler. Sel bakteri yang telah ditumbuhkan kemudian disentrifugasi untuk
memisahkan supernatan dan pelet kemudian diresuspensi menggunakan bufer TE. Bufer TE mengandung lysozyme yang berfungsi sebagai perusak dinding sel.
Sodium dodekil sulfat SDS 10 yang digunakan dalam isolasi DNA merupakan sejenis deterjen yang dapat digunakan untuk merusak membran sel, hal ini
mengakibatkan sel mengalami lisis. Kotoran debris sel yang disebabkan oleh pengrusakan sel oleh lysozyme dan SDS dibersihkan dengan cara dibolak-balik
sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida DNA dan RNA. Untuk menghilangkan protein dari larutan digunakan larutan isoamil mengikat protein
dan sebagian kecil RNA dan kloroform membersihkan protein dan polisakarida dari larutan Muladno, 2002. Pengambilan fase yang mengandung DNA pada
bagian atas dilakukan dengan sangat hati-hati. Selanjutnya DNA dipresipitasi menggunakan etanol absolut 70. DNA akan terlihat berwarna bening dan kental
di dalam tabung Eppendoff Gambar 11.
1
2000 bp 1000 bp
Elektroforesis Gel Agarosa
DNA yang telah berhasil diisolasi kemudian dilakukan pengujian untuk mendeteksi keberadaan DNA tersebut menggunakan elektroforesis pada gel
agarosa Gambar 12.
Amplifikasi Gen 16S rRNA
Hasil amplifikasi PCR isolat bakteri menggunakan primer 16S rRNA Gambar 13 menghasilkan satu amplikon atau produk PCR berukuran sekitar 1500 bp.
Primer yang digunakan dalam proses PCR ini, yaitu 16F27 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG- 3’ dan 16R1492 5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG
ACT T-3’. Selanjutnya amplikon ini disekuen untuk mengetahui urutan nukleotida pada gen 16S rRNA masing-masing isolat.
Gambar 12. Hasil elektroforesis DNA genom bakteri Keterangan :
1 = 1 kb DNA ladder marker
2 = isolat P2 3 = isolat J2
4 = isolat PS4 5 = isolat T9
3 4
5
Gambar 13. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA Keterangan :
1 = 1 kb DNA ladder marker
2 = isolat P2 3 = isolat J2
4 = isolat PS4 5 = isolat T9
1
2 3
4 5
1500 bp
1 2
3 4
5
Homologi Isolat Bakteri Dengan Program FASTA
Berdasarkan hasil analisis sekuen gen 16S rRNA pada program FASTA diketahui homologi spesies dari empat isolat bakteri yang diuji. Isolat bakteri
koleksi CV. Meori Agro dengan kode P2 memiliki kemiripan sebesar 100 dengan Pseudomonas aeruginosa strain QZX-A
,
isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro dengan kode J2 memiliki kemiripan sebesar 99,3 dengan Bacillus subtilis
strain PARZ2, dan isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro dengan kode PS4 memiliki kemiripan sebesar 100 dengan Burkholderia sp. strain AH83.
Sedangkan Isolat asal tanah yaitu isolat bakteri T9 memiliki kemiripan sebesar 99 dengan Burkholderia sp. strain A-3. Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA
dari tiga isolat BPF pada data GenBank terdapat pada Lampiran 11.
d. Pengujian Kualitatif dan Kuantitatif Isolat Bakteri Koleksi
Kategori