sumur-sumur pada gel elektroforesis. Setelah semua sumur terisi, power supply perangkat elektroforesis dinyalakan dengan voltase sebesar 75 V selama ± 45
menit. Selanjutnya DNA dapat dilihat dan difoto menggunakan perangkat UV Transilluminator.
Proses Polymerase Chain Reaction PCR. Proses PCR diawali dengan
pembuatan campuran komponen reaksi untuk PCR sebanyak 50 μl dengan
komposisi sebagai berikut : primer 10 μl 16F27 5’-AGA GTT TGA TCM TGG
CTC AG- 3’, primer 10 μl 16R1492 5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT
T-3’ , 2 μl template DNA, PCR mix 25 µl dan 19 μl aquabidest steril. Running
PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan kondisi sebagai berikut, denaturasi siklus awal atau pra-denaturasi 95ºC selama 5 menit, diikuti denaturasi untuk
siklus selanjutnya pada suhu 95ºC selama 1 menit. Penempelan primer annealing dilakukan selama 1 menit pada suhu 55ºC. Polimerisasi dilakukan
selama 2 menit pada suhu 72ºC dan pada siklus terakhir, yaitu siklus ke-35 dilakukan perpanjangan waktu polimerisasi selama 10 menit. Produk hasil PCR
divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.0 dalam 2x bufer TAE dengan voltase 75 volt selama ± 30 menit.
Sekuensing DNA. Produk hasil PCR dikirimkan pada PT. Genetika
Science untuk disekuen di Malaysia. Sekuen DNA yang diperoleh dibandingkan dengan sekuen pada database European Bioinformatics Institute EBI
menggunakan piranti FASTA pada situs http:www.ebi.ac.uk.
d. Peremajaan Tiga Isolat Bakteri Koleksi
Ketiga isolat bakteri koleksi CV. Meori Agro yang akan dipergunakan digoreskan pada media pikovskaya menggunakan jarum ose untuk peremajaan.
Perlakuan ini dilakukan di dalam Laminar Air Flow agar tidak terjadi kontaminasi.
e. Pengujian Kualitatif Isolat Bakteri asal Tanah dan Isolat Bakteri
Isolat terpilih dan isolat koleksi yang telah diremajakan kemudian dilakukan pengujian pelarutan P secara kualitatif. Isolat diujikan pada media pikovskaya
padat kemudian pengamatan dilakukan sampai terbentuknya zona bening di sekitar bakteri. Koloni yang dikelilingi zona bening menunjukkan adanya
pelarutan fosfat. Pengujian secara kualitatif dilakukan dengan cara menghitung besarnya zona bening berbanding besarnya koloni bakteri. Perhitungan pelarutan
fosfat pada media menggunakan Indeks pelarutan IP.
Satu bakteri pelarut fosfat yang unggul selanjutnya disimpan di dalam medium agar-miring Pikovskaya untuk pengujian selanjutnya.
f. Pengujian Kuantitatif Isolat Bakteri Pengujian Kemampuan Bakteri Koleksi dan Asal Tanah dalam
Pikovskaya cair
Mikrob terpilih diuji kemampuannya dalam melarutkan senyawa P sukar larut Ca
3
PO
4 2
di medium pikovskaya cair. Mikrob yang akan diuji diremajakan terlebih dahulu kemudian diambil 1 ose mikrob tersebut diinokulasikan pada
pikovskaya cair dan diinkubasi selama 5 hari. Kultur diinkubasi diatas shaker secara periodik. Pada akhir inkubasi kultur disentrifugasi dengan kecepatan
1048,12 x g selama 20 menit. Filtrat jernih yang diperoleh ditentukaan P larutnya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang α 660 nm dan dibandingkan dengan kontrol.
A B
IP :
Keterangan : A : Lebar Zona bening
B : Lebar Koloni Bakteri
A B
Gambar 4. Penghitungan Indeks Pelarutan
Pengujian Bakteri Pelarut Fosfat dalam Menghasilkan Enzim Fosfatase
Sebanyak 50 ml kultur sel BPF yang ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu ruang di dalam medium Pikovskaya cair. Sebanyak 1 ml kultur, kemudian
ditambahkan 1 ml Buffer fosfat, dan 1 ml 0.115 M p-nitro phenyl phosphate p- NPP, kemudian diinkubasi selama 2 jam di dalam waterbath pada suhu 38ºC.
Setelah diinkubasi selama 2 jam, ditambahkan 1 ml CaCl 0,5 M dan 4 ml 0.5 M NaOH kemudian dikocok dan disentrifuse. Larutan akan berubah menjadi warna
kuning, hal ini menandakan bahwa bakteri menghasilkan enzim fosfatase. Semakin pekat warna kuning yang terbentuk, maka semakin tinggi enzim
fosfatase yang dihasilkan. Kemudian dilakukan pengenceran 10x dengan mengambil 1 ml filtrat ditambahkan dengan 9 ml aquadest. Pengukuran
absorbansi dilakukan pada panjang gelombang α = 400 nm menggunakan
Spectrophotometer.
g. Pengukuran Kurva Standar Bakteri
