34
3.3 Pembuatan Pereaksi
Pereaksi yang akan dibuat adalah aquades bebas karbondioksida, NaOH 10, NaOH 0,5, HCl 0,1 N, larutan NaCl jenuh, FeCl
3
5
,
HCl 0,1, HCl 1:3 NH
4
OH 2 dan NH
4
OH 10. Aquades bebas karbondioksida dibuat dengan cara mendidihkan selama
lima menit atau lebih, ditutup, didiamkan sampai dingin. NaOH 10 dibuat dengan cara melarutkan 10 g natrium hidroksida dalam aquades bebas
karbondioksida hingga 100 ml. NaOH 0,5 dibuat dengan cara melarutkan 500 mg natrium hidroksida dalam aquades bebas karbondioksida hingga 100 ml. HCl
0,1 N dibuat dengan cara mengencerkan 8,5 ml HCl 37 dengan aquades hingga 1000 ml. HCl 1:3 dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml HCl pekat dengan
75 ml aquades di dalam gelas beker lalu dihomogenkan. HCl 0,1 dibuat dengan cara mengencerkan 0,68 ml HCl 37 dengan aquades hingga 250 ml Ditjen
POM, 1995. NH
4
OH 2 dibuat dengan cara melarutkan 20 ml NH
4
OH 25 dengan etanol 70 hingga 250 ml. NH
4
OH 10 dibuat dengan cara melarutkan 100 ml NH
4
OH 25 dengan etanol 70 hingga 250 ml. Larutan NaCl jenuh dibuat dengan cara melarutkan 30 g NaCl p.a dengan 100 ml aquades di dalam
gelas beker kemudian diaduk hingga NaCl tersebut tidak larut lagi. FeCl
3
5 dibuat dengan cara melarutkan 5 g FeCl
3
dengan 100 ml aquades di dalam beaker glass lalu diaduk sampai homogen Ditjen POM, 2006.
3.4 Metode Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel saus cabai dilakukan secara purposif yaitu didasarkan pada produk yang beredar dipasaran baik yang bermerek dan yang tidak
Universitas Sumatera Utara
35
bermerek. Pengambilan sampel didasarkan atas pertimbangan bahwa sampel yang diambil dapat mewakili seluruh populasi sampel yang beredar di kota Medan dan
sampel yang dianalisis dianggap sebagai sampel yang representatif Sudjana, 2002.
Lokasi pengambilan sampel yang bermerek dilakukan di Swalayan Carrefour di Jalan Jamin Ginting, dan untuk sampel yang tidak bermerek
dilakukan di beberapa kantin di Universitas Sumatera Utara, dan di beberapa tempat penjual makanan jajanan yang ada di Jalan Jamin Ginting, Jalan dr.
Mansur, dan Jalan Setia Budi di Kota Medan.
3.5 Prosedur Kerja 3.5.1 Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B
3.5.1.1 Metode Kromatografi Lapis Tipis
Bulu domba direndam selama 24 jam dengan sabun, dicuci hingga bersih dengan air, dikeringkan. Bulu domba kering direndam dengan n-heksan,
dikeringkan Ditjen POM, 2000.
Larutan A dibuat dengan cara menimbang 30 g sampel, dilarutkan dalam 50 ml aquades, ditambahkan 2 ml asam asetat 6, dimasukkan 50 mg bulu
domba, dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk sampai warna terserap. Bulu domba berwarna dicuci berulang-ulang dengan 100 ml aquades hingga
bersih. Bulu domba bersih dimasukkan ke cawan penguap, ditambahkan 10 ml NH
4
OH 10, dipanaskan di atas penangas air hingga warna bulu domba luntur. Larutan dikumpulkan dalam cawan penguap, diuapkan di atas penangas air hingga
kering lalu dilarutkan dalam 2 ml aquades Ditjen POM, 2000.
Universitas Sumatera Utara
36
Larutan B dibuat dengan cara menimbang 30 g sampel, dilarutkan dengan 50 ml aquades. Ditimbang 50 mg rhodamin B, dimasukkan ke setiap larutan
sampel, dicampur homogen, tambahkan asam asetat 6, kemudian dibuat
perlakuan yang sama seperti pembuatan larutan A Ditjen POM, 2000. Larutan C
dibuat dengan cara menimbang 50 mg rhodamin B, dilarutkan dalam 100 ml
aquades Ditjen POM, 2000.
Plat kromatografi lapis tipis KLT diaktifkan dengan cara dipanaskan di dalam oven pada suhu 100°C selama 30 menit. Larutan A, B, C, masing-masing
ditotolkan pada plat menggunakan pipa kapiler pada jarak 2 cm dari bagian bawah plat dan jarak antar noda adalah 1 cm, dibiarkan beberapa saat hingga mengering.
Plat KLT yang mengandung cuplikan dimasukkan ke chamber yang terlebih dahulu telah dijenuhkan dengan 60 ml eluen berupa n-butanol, asam asetat glasial
dan aquades 40 : 10 : 24, chamber ditutup dan dibiarkan eluen naik sampai batas atas plat. Plat diangkat, dibiarkan kering di udara. Bercak diamati, jika
dilihat secara visual bercak berwarna merah jambu dan di bawah sinar uv 254 nm berfluoresensi kuning, menunjukkan adanya rhodamin B. Selanjutnya dihitung
harga Rf bercak Ditjen POM, 2000. Rumus perhitungan harga Rf Stahl, 1985:
Harga Rf = awal
titik dari
depan garis
jarak awal
titik dari
bercak pusat
k jarak titi
3.5.1.2 Metode Spektrofotometri Sinar Tampak
Larutan uji sebanyak 50 ml dibuat dengan cara menimbang 15 g sampel saus cabai yang telah dihomogenkan, dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml,
ditambah dengan 100 ml larutan amonium hidroksida 2, didiamkan 24 jam
Universitas Sumatera Utara
37
sehingga semua pewarna larut. Larutan disaring, diuapkan di atas penangas air hingga kering. Sisa penguapan dilarutkan secara kuantitatif dengan 30 ml
aquades, dimasukkan ke dalam corong pisah 250 ml, ditambahkan 6 ml natrium hidroksida 10, diekstraksi dengan 30 ml dietil eter. Ekstrak dietil eter
dipisahkan, dicuci dengan 30 ml natrium hidroksida 0,5. Ekstrak dietil eter diekstraksi tiga kali, tiap kalinya dengan 10 ml asam klorida 0,1 N, lapisan dietil
eter dibuang. Ekstrak asam klorida 0,1 N ditampung dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan asam klorida 0,1 N sampai tanda. Ekstrak asam klorida dipipet 5 ml,
dimasukkan dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan asam klorida 0,1 N sampai tanda lalu larutan diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang
gelombang 450-750 nm Ditjen POM, 2006.
3.5.2 Penetapan Kadar Rhodamin B 3.5.2.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Rhodamin B
3.5.2.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku I
Rhodamin B ditimbang 50 mg, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan asam klorida 0,1 N. Selanjutnya diencerkan dengan asam
klorida 0,1 N sampai garis tanda. Konsentrasi larutan induk baku I =
50 mg 50 ml
x 1000 mcgml = 1000 mcgml.
3.5.2.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku II
Larutan induk baku I dipipet 2,5 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml. Selanjutnya diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda.
Konsentrasi larutan induk baku II =
2,5 ml 50 ml
x 1000 mcgml = 50 mcgml.
Universitas Sumatera Utara
38
3.5.2.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Rhodamin B
Larutan induk baku II dipipet 3 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda, diukur serapan
pada panjang gelombang 450-750 nm. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko.
3.5.2.3 Penentuan Waktu Kerja Rhodamin B
Larutan induk baku II dipipet 3 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda, diukur serapan
pada panjang gelombang 557 nm selama 30 menit. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko.
3.5.2.4 Kurva Kalibrasi Larutan Rhodamin B
Larutan induk baku II dipipet sebanyak 2; 2,5; 3; 3,5; 4 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan asam klorida 0,1 N sampai garis tanda
konsentrasi larutan 2; 2,5; 3; 3,5; 4 mcgml. Serapannya diukur pada panjang gelombang 557 nm. Asam klorida 0,1 N digunakan sebagai blanko.
3.5.2.5 Penetapan Kadar Rhodamin B pada Sampel
Rhodamin B pada sampel saus cabai diisolasi prosedur kerja 3.5.1.2. Diukur serapannya pada panjang gelombang 557 nm. Asam klorida 0,1 N
digunakan sebagai blanko. Kadar rhodamin B dalam sampel dapat dihitung dengan persamaan regresi y = ax + b.
Rumus perhitungan kadar rhodamin B: K =
X x V x Fp Berat sampel g
Keterangan: K = Kadar rhodamin B dalam sampel mcgg X = Kadar rhodamin B sesudah pengenceran
V = Volume sampel ml Fp = Faktor pengenceran
Universitas Sumatera Utara
39
3.5.3 Pemeriksaan Kualitatif Natrium Benzoat
Larutan uji dibuat dengan cara menimbang 50 g sampel, dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, ditambahkan dengan 10 ml natrium hidroksida 10, dilarutkan
dengan larutan natrium klorida jenuh sampai garis batas, dihomogenkan. Larutan dibiarkan selama 2 jam, dikocok, disaring, filtratnya dimasukkan ke dalam corong
pisah sebanyak 50 ml, diasamkan filtratnya dengan asam klorida 1:3 pH 2,5-4, diekstraksi dengan 10-15 ml dietil eter. Lapisan dietil eter dipisahkan ke gelas
erlenmeyer, diuapkan di atas penangas air. Sisa penguapan ditambahkan 1 ml larutan amonium hidroksida 2, diuapkan lalu diuji dengan larutan besi III
klorida 5. Endapan kecoklatan yang terbentuk menunjukkan adanya natrium
benzoat dalam sampel Departemen Perindustrian RI, 1992. 3.5.4 Penetapan Kadar Natrium Benzoat pada Sampel
3.5.4.1 Pembuatan Larutan Baku Asam Benzoat
Asam benzoat ditimbang 50 mg, dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dilarutkan dengan dietil eter, diencerkan dengan dietil eter sampai garis tanda.
Konsentrasi larutan induk baku =
50 mg 100 ml
x 1000 mcgml = 500 mcgml.
3.5.4.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Benzoat
Larutan baku asam benzoat dipipet 6 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan dietil eter sampai garis tanda, diukur serapan pada panjang
gelombang 200-400 nm. Dietil eter digunakan sebagai blanko.
3.5.4.3 Kurva Kalibrasi Asam Benzoat
Larutan baku asam benzoat dipipet 3,0; 4,5; 6,0; 7,5; 9,0 ml, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan dietil eter hingga garis tanda
Universitas Sumatera Utara
40
konsentrasi larutan asam benzoat adalah 30; 45; 60; 75; 90 ppm. Serapan diukur pada panjang gelombang 271 nm. Dietil eter digunakan sebagai blanko.
3.5.4.4 Penetapan Kadar Natrium Benzoat pada Sampel
Larutan uji dibuat dengan menimbang 5 g sampel, dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, ditambahkan larutan natrium klorida jenuh hingga 100 ml,
disaring. Filtrat diasamkan dengan 1 ml asam klorida pekat, dihomogenkan sampai sempurna, dimasukkan ke corong pisah, diekstrak dengan 15 ml dietil eter.
Lapisan eter dipisahkan ke erlenmeyer sedangkan lapisan bawah diekstrak lagi dengan 10; 5; 15 ml dietil eter. Lapisan dietil eter dimasukkan ke corong pisah,
dicuci dengan 15 ml asam klorida 0,1. Lapisan bawah dibuang, lapisan atas dicuci lagi dengan 10 ml asam klorida 0,1 sebanyak dua kali. Ekstrak dietil eter
dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, diencerkan dengan dietil eter hingga garis tanda lalu dihomogenkan. Ekstrak dietil eter sebanyak 25 ml diencerkan dengan
dietil eter dalam labu tentukur 50 ml hingga sampai garis tanda, dihomogenkan. Serapan diukur dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 271
nm Anonim, 2000. Menurut Rohman 2007, kadar asam benzoat dalam sampel dapat
dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi: y = ax + b
Rumus perhitungan kadar asam benzoat: K =
X x V x Fp Bs
Keterangan: K = Kadar asam benzoat dalam sampel mcgg X = Kadar asam benzoat sesudah pengenceran
V = Volume sampel ml Fp = Faktor pengenceran
Bs = Berat sampel g
Universitas Sumatera Utara
41
Kadar natrium benzoat dapat ditentukan dari berat molekulnya BM. Kadar natrium benzoat = kadar asam benzoat x
BM natrium benzoat BM asam benzoat
3.6 Analisis Data Secara Statistik
Menurut Rohman 2007, kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
t
hitung
= | Xi – X
n - 1 | Dengan dasar penolakan apabila t hitung ≥ t tabel. Untuk mencari kadar
sebenarnya dengan α = 0,05, dk = n - 1, digunakan rumus:
= X ± t x SD
√n Keteranganμ = Kadar sebenarnya
X = Kadar sampel n = Jumlah pengulangan
t = Harga t
tabel
sesuai dk dk = derajat kebebasan dk = n - 1
α = Tingkat kepercayaan
Universitas Sumatera Utara
42
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel saus cabai yang diambil untuk pemeriksaan kualitatif dan kuantitatif rhodamin B dan natrium benzoat sebanyak 30 buah, yang terdiri dari
14 buah saus cabai bermerek dan 16 buah saus cabai tidak bermerek.
4.1 Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B pada Sampel
Sebelum dilakukan analisa kuantitatif rhodamin B pada sampel, perlu dilakukan identifikasi untuk mengetahui ada tidaknya rhodamin B pada sampel
dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis KLT. Pemeriksaan dilakukan dengan cara menotolkan sampel yang telah
dipekatkan pada plat KLT kemudian dielusi dengan menggunakan pengembang n-butanol : asam asetat glasial : akuades dengan perbandingan 40 : 10 : 24.
Kemudian noda hasil KLT dilihat secara visual dan di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm Ditjen POM, 2000. Hasil pemeriksaan kualitatif
rhodamin B pada sampel diperoleh data, seperti ditunjukkan pada Tabel 5.
Universitas Sumatera Utara