Setelah netralisasi, dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan cairan supernatan dengan padatan endapan. Sentrifugasi berlangsung selama 30 menit dengan
kecepatan putar 4000 rpm. Xilan terkandung dalam supernatan. Etanol ditambahkan ke dalam supernatan untuk memisahkan xilan yang larut di
dalamnya. Perbandingan supernatan dengan etanol yang ditambahkan adalah 1:2 Yoshida et al., 1994. Sebagai tahap akhir, dilakukan pemisahan antara xilan
yang diperoleh dengan cairan campuran supernatan-etanol yang tidak ikut mengendap sebagai xilan.
4. Purifikasi Xilan
Hemiselulosa A endapan yang diperoleh dari ekstraksi xilan dilarutkan dalam aquades 1:12,5 bv, disentrifuga dengan kecepatan putaran 6000 rpm selama 30
menit. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam NaOH 4 . Larutan alkali yang mengandung xilan tersebut kemudian disaring untuk memisahkan kotoran-kotoran
yang terdapat di dalamnya. Filtrat yang diperoleh diasamkan dengan HCl 6 N hingga pH 4,5-5,0, kemudian dilakukan sentrifuga 4000 rpm selama 30 menit
untuk memperoleh endapan xilan murni selanjutnya disaring. Xilan dapat didispersikan kembali dalam etanol.
5. Produksi Enzim Xilanase
Tahap ini dilakukan untuk mendapatkan enzim xilanase dalam jumlah besar yang akan digunakan untuk hidrolisis xilan menjadi xilooligosakarida. Produksi enzim
xilanase dilakukan dengan mengikuti prosedur fermentasi fase padat dengan menggunakan kondisi optimum pada penetapan waktu optimum hidrolisis jerami
padi. Enzim xilanase diproduksi pada media YM cair dengan komposisi : 4,0 g ekstrak khamir, 10 g ekstrak malt, 15 g glukosa, dan 0,5 xilan birchwood
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 hari. Sebanyak 7 ose isolat Actinomycetes dimasukkan ke dalam media inokulum. Selanjutnya 100 mL inokulum
ditambahkan pada 100 g jerami padi ukuran 1-2 cm. Pemanenan dilakukan pada waktu optimum selama 15 hari dengan menambahkan 1000 mL 0,2 M buffer
fosfat pH 7 kemudian diaduk dan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh digunakan sebagai ekstrak kasar enzim xilanase yang akan
diukur aktivitasnya.
6. Pengukuran Aktivitas Enzim Xilanase
Aktivitas xilanase diujikan dengan substrat birchwood xilan menggunakan reagen DNS Miller, 1959. Sebanyak 1000 μ L substrat 0,5 xilan birchwood
ditambahkan 900 μ L 0,02 M bufer fosfat pH 7. Kemudian larutan ini ditambahkan 100 μ L ekstrak kasar xilanase dihomogenisasi lalu diinkubasi pada
suhu ruang selama 30 menit lalu ditambahkan 200 μ L pereaksi DNS dan segera dipanaskan pada 100
o
C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Sebagai kontrol sebanyak 1000 μ L substrat 0,5 xilan birchwood ditambahkan
900 μ L 0,02 M bufer fosfat pH 7. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit lalu ditambahkan 100 μ L ekstrak kasar xilanase dan 200 μ L pereaksi
DNS kemudian segera dipanaskan pada 100
o
C selama 15 menit dan didinginkan
pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi masing-masing larutan dilakukan pada λ 540 nm. Satu unit aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah μ mol xilosa
yang dihasilkan permenit untuk setiap mL enzim pada kondisi optimumnya.
7. Pengendapan Xilanase Menggunakan Aseton
