METODOLOGI PENELITIAN Penganrh Salep Ekstrak I)aun Binahong (Anredera cordifulia (Tenore) Steenis) terhadap Pembentukan Jaringan Granulasi pada Luka Bakar Tikus Sprngue dawley (Studi Pendahuluan Lama Paparan Luka Bakar 30 Detik dengan Plat Besi

38

3.7 Alat dan Bahan

3.7.1 Alat Penelitian 1. Plat besi berukuran 4 x 2 cm 2. Hot Plate Magnetic stirrer 3. Beker glass 4. Gunting dan Pinset 5. Pisau cukur 6. Karton 7. Staples 8. Pot obat 9. Kandang hewan coba 10. Timbangan elektronik 11. Termometer 12. Lumpang dan Alu 13. Cawan porselen 14. Spatula 15. Stopwatch 16. Mikroskop 3.7.2 Bahan Penelitian 1. Ekstrak daun binahong Anredera cordifoliaTenoreSteenis 2. Adeps lanae 3. Vaselin album 4. Formalin 5. Eter 6. Pelarut etanol 96 . 39

3.8 Alur Penelitian

Gambar terlampir pada lampiran 5 Aklimatisasi sampel selama 1 minggu Pemilihan sampel Persiapan Penelitian Pembuatan Luka Bakar pada Tikus Pemberian salep ekstrak daun binahong, kontrol positif, dan kontrol negatif selama 5 hari Pembuatan salep ekstrak daun Binahong di BALITRO dan Laboratorium Farmakologi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pada hari ke - 6 , dilakukan eksisi luka Sampel jaringan ditempatkan di dalam pot lalu dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi FKUI untuk dibuat preparat Proses pengamatan histopatologi kulit di Laboratorium Histologi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Pengolahan data hasil pengamatan preparat histopatologi kulit Pembuatan Laporan Hasil Penelitian Determinasi tanaman oleh LIPI Bogor 40

3.9 Cara Kerja Penelitian

3.9.1 Pembuatan Luka Bakar pada tikus 50 3.9.2 Pembuatan Ekstrak Daun Binahong Anredera cordifolia Tenore Steenis a. Persiapan Sampel Daun binahong diperoleh dari Pusat Penjualan Binahong yang berlokasi di Palmerah, Jakarta Barat. Daun binahong dikeringkan selama 3 hari. Kemudian daun binahong yang telah kering diblender hingga halus. b. Determinasi Sampel Determinasi tanaman dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor dengan surat determinasi terlampir. Lampiran 1 c. Ekstrak Sampel Daun binahong basah didapatkan sebanyak 4 kg setelah pengeringan didapatkan sebanyak 530,6 gr dan dihaluskan. 41 Sampel yang telah halus direndam dalam pelarut etanol 96 sebanyak 2500 ml dengan perbandingan 1 kg daun : 5 liter pelarut etanol 96. Sampel sebanyak 530,6 gr yang telah direndam di dalam etanol dikocok selama 2 – 3 jam, kemudian didiamkan selama 24 jam. Setelah didiamkan selama 24 jam, sampel kemudian disaring dengan kertas saring. Hasil filtrat penyaringan kemudian dirotavapor. Saat dirotavapor, pelarut etanol divakum lalu didestilasi sehingga menjadi cair. Cairan pelarut etanol dari hasil destilasi kemudian ditampung. Jika pelarut sudah menguap semua akan didapatkan ekstrak kental daun binahong. Didapatkan ekstrak kental daun binahong sebanyak 26,2 gr.

3.9.3 Pembuatan Salep Ekstrak Daun Binahong

a. Persiapan Bahan Salep Bahan yang akan digunakan untuk membuat basis salep dan ekstrak daun Binahong ditimbang sesuai dengan takaran.  Basis Salep Basis yang akan digunakan basis berlemak yaitu adeps lanae dan vaseline album. Sebelum dibuat basis salep, dipanaskan lumpang dan alu di dalam oven dengan suhu 50 C hingga panas, kemudian lumpang dan alu yang telah panas dikeluarkan dari oven dan masukkan adeps lanae terlebih dahulu dan diaduk hingga lebur kemudian dilanjutkan dengan memasukkan vaselin album dan diaduk dengan kecepatan konstan hingga homogen dengan membentuk basis salep. b. Pencampuran Basis Salep dengan Ekstrak Daun Binahong Basis salep yang telah dibuat, ditambahkan dengan ekstrak daun Binahong dan diaduk hingga homogen dengan menggunakan lumpang dan alu yang panas yang disesuaikan dengan masing – masing konsentrasi. 42 Formula standar basis salep yang digunakan menurut Niswah Paju et al 2013 ialah : R Adeps lanae 15 g Vaseline Album 85 g m.f salep 100 g Sediaan salep yang akan digunakan pada penelitian ini memiliki masing – masing konsentrasi ekstrak daun Binahong yaitu 10, 20 dan 40 dibuat sebanyak 30g. a. Formulasi salep ekstrak daun Binahong 10 R Ekstrak daun Binahong 3 g Basis salep 27 g m.f salep 30 g b. Formulasi salep ekstrak daun Binahong 20 R Ekstrak daun Binahong 6 g Basis salep 24 g m.f salep 30 g c. Formulasi salep ekstrak daun Binahong 40 R Ekstrak daun Binahong 12 g Basis salep 18 g m.f salep 30 g c. Pengujian Sediaan Salep Untuk mengetahui homogenitas salep dilakukan uji homogentitas, yaitu dengan mengoleskan sediaan pada sekeping kaca transparan dimana sediaan diambil pada bagian atas, tengah, dan bawah. Gambar 3.1 Hasil Tes Homogenitas Salep Ekstrak Daun Binahong 43 Salep dikatakan homogen apabila basis salep dan ekstrak daun binahong sudah tercampur merata dan ketika dioleskan di atas kaca tidak menggumpal. 3.9.4 Perlakuan Pada Hewan Coba Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus. Kategori perlakuan hewan coba, yaitu: 1. Kontrol negatif: 5 ekor tikus diberikan salep yang hanya berisi basis salep vaselin album dan adeps lanae 2. Kontrol positif: 5 ekor tikus diberikan salep silver sulfadiazine SSD 3. Kelompok Perlakuan I: 5 ekor tikus diberikan salep ekstrak daun Binahong dengan konsentrasi 10 4. Kelompok Perlakuan II: 5 ekor tikus diberikan salep ekstrak daun Binahong dengan konsentrasi 20 5. Kelompok Perlakuan III: 5 ekor tikus diberikan salep ekstrak daun Binahong dengan konsentrasi 40 Sebelum perlakuan, sampel diaklimatisasi selama 1 minggu. Setelah dilakukan pembuatan luka bakar, kelima kelompok tersebut diberikan masing – masing sediaan salep pada pagi dan sore hari selama 5 hari. Pada hari ke -6 dilakukan eksisi pada luka untuk menilai histopatologi kulit yang mengalami luka. 3.9.5 Persiapan Eksisi Luka Sebelum dieksisi, hewan dianestesi dengan eter. Eksisi luka dengan cara pembedahan. Preparat luka yang telah diambil dimasukkan kedalam larutan formalin 10 lalu dikirim ke Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia FKUI. 3.9.6 Pembuatan Preparat Histopatologi Kulit 44 Pembuatan preparat dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Hematoxylin Eosin HE dan pewarnaan trichrome . Pewarnaan HE digunakan untuk melihat sel fibroblas dan neovaskularisasi sedangkan pewarnaan trichrome untuk menilai deposit kolagen. Pembuatan preparat dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FKUI. 3.9.7 Pengamatan Histopatologi Pengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x – 400x di Laboratorium Histologi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan menggunakan Mikroskop Olympus BX41 yang dilengkapi dengan software aplikasi DP2-BSW.

3.9.7.1 Cara Pengukuran

 Kepadatan Deposit Kolagen Kepadatan deposit kolagen diukur dengan membuat foto sediaan kulit dorsal yang telah diberi luka bakar dengan menggunakan mikroskop. Hasil foto disimpan dan dianalisis secara kuantitatif dengan mengukur serapan warna RGB Red,Green, Blue atau format RGB menggunakan program komputer adobe Photoshop 6.  Jumlah Sel Fibroblas Jumlah sel fibroblas diukur dengan membuat foto sediaan kulit dorsal yang telah diberi luka bakar dengan menggunakan mikroskop. Hasil foto disimpan dan dianalisis secara kuantitatif dengan menghitung jumlah sel fibroblas dari 5 lapang pandang yang berbeda dan dipilih secara acak. Jumlah sel fibroblas dari kelima lapang pandang tersebut kemudian dirata – rata.  Neovaskularisasi Jumlah neovaskularisasi diukur dengan membuat foto sediaan kulit dorsal yang telah diberi luka bakar dengan menggunakan mikroskop. Hasil foto disimpan dan 45 dianalisis secara kuantitatif dengan menghitung jumlah pembuluh darah yang terbentuk dari 5 lapang pandang yang berbeda dan dipilih secara acak. Jumlah neovaskularisasi dari kelima lapang pandang tersebut kemudian dirata – rata.

3.9.7.2 Cara Penggunaan program Adobe Photoshop 6.0

Cara pengukuran kepadatan deposit kolagen menggunakan program Adobe Photoshop 6.0 adalah sebagai berikut : 1. Preparat difoto dengan kamera mikroskop fotografi dengan pembesaran 200x. Foto – foto tersebut kemudian disimpan. 2. Langkah – langkah untuk memperoleh nilai mean RGB  Membuka program adobe photoshop 6.0  Buka file foto yang sudah disimpan  Klik magic wound tool terletak di sebelah kiri  Tempatkan kursor pada foto di bagian warna yang akan dihilangkan . Misal, di dalam foto tersebut terdapat warna ungu dan warna biru. Warna ungu menggambarkan lapisan sel epitel sedangkan warna biru menggambarkan kepadatan kolagen dengan pewarnaan trichrome. Pada penelitian ini, akan dinilai kepadatan kolagen sehingga warna ungu harus dihilangkan. Letakan kursor pada daerah warna ungu.  Klik menu edit, pilih submenu cut. Maka warna ungu tadi akan hilang semua. Demikian seterusnya untuk warna lain yang akan dihilangkan. Sehingga hanya tampak warna yang akan dianalisis saja. 46 Gambar 3.2 Contoh Hasil Pengolahan Foto dengan Menggunakan Program Adobe Photoshop 6.0 A. Foto sebelum dilakukan pengolahan masih terdapat warna lain selain warna biru B. Foto setelah dilakukan pengolahan dominasi warna biru Pewarnaan trichrome, perbesaran 200x  Selanjutnya, klik menu image, pilih submenu histogram. Klik blue, maka nilai mean akan tampak. Nilai mean ini merupakan jumlah titik atau pixels yang menandakan ketebalan pulasan kolagen warna biru Gambar 3.3 Hasil Penilaian Kepadatan Deposit Kolagen dengan Menggunakan Histogram Format RGB Blue Sumber: Printscreen dari Program Adobe Photoshop 6.0 A B 47

3.9.7.3 Cara Menghitung Sel Menggunakan Aplikasi ImageJ

Langkah – langkah menghitung sel dengan menggunakan aplikasi ImageJ adalah sebagai berikut : 1. Buka aplikasi ImageJ 2. Buka gambar yang akan dihitung jumlah sel nya , klik File, lalu pilih Open, pilih gambar yang akan dihitung jumlah selnya 3. Klik Plugin, lalu pilih Analysis, selanjutnya pilih Cell counter 4. Klik Keep original . 5. Setelah itu, pilih Initiate untuk meng-copy gambar yang akan dihitung jumlah sel nya 6. Klik Type 1 untuk menandai sel yang akan dihitung. Jika ingin menghitung lebih dari satu jenis sel bisa memilih Type 2,Type 3 dan seterusnya. Dalam penelitian ini, Type 1 menandakan sel fibroblas. 7. Letakan kursor pada inti sel yang akan dhitung, lalu tekan pada inti sel tersebut. Setelah ditekan akan muncul sebuah titik yang menandakan bahwa sel tersebut sudah dihitung sehingga mengurangi resiko terhitung kembali. 8. Jumlah sel sama dengan jumlah inti sel yang ditandai. Banyaknya jumlah penanda akan secara otomatis terhitung dan hasilnya dapat dilihat pada Result.

3.9.7.4 Cara menghitung jumlah pembuluh darah pada foto preparat

Berikut langkah – langkah yang dilakukan untuk menghitung jumlah pembuluh darah baru neovaskularisasi pada foto preparat, antara lain : 1. Buka aplikasi Adobe Photoshop CS3 48 2. Buka foto yang akan dihitung jumlah pembuluh darahnya dengan cara, klik file, lalu pilih open, pilih foto yang akan dihitung jumlah pembuluh darahnya 3. Untuk memudahkan dalam penghitungan dan meminimalisasi kesalahan dalam penghitungan gunakan garis bantu grid line. 4. Untuk memunculkan grid line, tekan Ctrl + K secara bersamaan sehingga nanti akan muncul tampilan sebagai berikut : Gambar 3.4 Pengaturan Grid Line pada Program Adobe Photshop CS3 Sumber: Printscreen dari Program Adobe Photoshop CS3 5. Selanjutnya pilih Guides, Grid Slices, sehingga akan muncul tampilan sebagai berikut : Gambar 3.5 Pengaturan Guides, Grid Slices pada Program Adobe Photoshop CS3 Sumber: Printscreen dari Program Adobe Photoshop CS3 49 Atur warna garis yang diinginkan dan jarak dari setiap garis, setelah itu klik OK. 6. Tekan Ctrl + „ untuk memunculkan grid line Gambar 3.6 Grid line yang muncul pada Program Adobe Photoshop CS3 Sumber: Printscreen dari Program Adobe Photoshop CS3 7. Hitung pembuluh darah yang terlihat pada foto. Pembuluh darah ditandai dengan adanya lumen yang dilapisi sel endotel atau lumen yang berisi sel darah baik yang terpotong secara memanjang atau melintang. Penghitungan dilakukan pada semua kotak dimulai dari kotak paling atas kiri hingga ke kotak paling bawah kanan. Selanjutnya jumlah pembuluh darah dari setiap kotak dijumlahkan. 3.10 Analisis Data Data hasil penelitian pengaruh pemberian salep ekstrak daun binahong Anredera cordifoliaTenoreSteenis dianalisis dengan menggunakan program SPSS 16.0 untuk melihat apakah ada efektifitas yang bermakna dari masing – masing sediaan uji yang mengandung kontrol positif, ekstrak daun Binahong dengan berbagai konsentrasi, dan kontrol negatif terhadap pembentukan jaringan granulasi pada luka bakar tikus Sprague dawley dengan lama paparan luka bakar 30 detik dengan plat besi. 50 Data pada penelitian ini berupa variabel kategorik- numerik lebih dari 2 kelompok tidak berpasangan sehingga menggunakan uji one way ANOVA jika distribusi normal. Jika distribusi data tidak normal maka menggunakan uji nonparametrik yakni Uji Kruskall-Wallis. 3.11 Etika Penelitian Pelaksanaan penelitian ini telah disetujui oleh Komisi Etik Penelitian Kesehatan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Hewan coba sebanyak 25 ekor tikus Sprague dawley diberikan makanan dan minuman secara ad libitum. Hewan ditempatkan di kandang yang sesuai dengan habitat tikus. Setiap kandang berisi 1 ekor tikus. Pada leher hewan dipasangkan collar neck agar kepala hewan tidak mengenai luka yang ada dipunggungnya. Setelah diberikan perlakuan selama 5 hari, pada hari ke – 6 dilakukan terminasi dengan menggunakan anestesi eter. Anestesi ini dilakukan agar tikus tidak menderita. Selanjutnya, dilakukan pengambilan sampel jaringan kulit bagian dorsal. Sampel jaringan kemudian dibawa ke Laboratorium Patologi Anatomi FKUI. Bagian tubuh tikus yang tidak diambil untuk sampel jaringan dikuburkan. 51

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Secara makroskopik, gambaran luka bakar pada tikus Sprague dawley yang diberikan paparan luka bakar selama 30 detik dengan plat besi terlihat kulit tikus yang diberikan paparan luka bakar berwarna merah kecoklatan dan terdapat bula pada hari pertama setelah dibuat luka bakar. Selain itu juga terdapat beberapa bagian kulit yang mengelupas. Gambar 4.1 Gambaran Makroskopik Luka Bakar pada tikus Sprague dawley pada hari pertama setelah pembuatan luka Luka bakar kemudian diberikan salep ekstrak daun Binahong dengan konsentrasi 10, 20, dan 40, krim silver sulfadiazin kontrol +, dan basis salep kontrol - selama 5 hari. Pada hari ke-5, terlihat terdapat keropeng pada luka yang berwarna kecoklatan dan bula sudah tidak terlihat. Luas luka cenderung mengecil. 52 Gambar 4.2 Gambaran Makroskopik Luka Bakar pada tikus Sprague dawley pada hari ke -5 setelah pembuatan luka Pada penelitian ini juga dilakukan identifikasi luka bakar secara mikroskopik, yaitu berupa pembentukan jaringan granulasi. Sel fibroblas, deposit kolagen, dan neovaskularisasi merupakan komponen penyusun jaringan granulasi yang digunakan sebagai parameter pembentukan jaringan granulasi dalam penelitian ini.

4.1 Kepadatan Deposit Kolagen

Berikut ini adalah gambaran histopatologi deposit kolagen dalam jaringan granulasi pada luka bakar tikus Sprague dawley dengan lama paparan luka bakar selama 30 detik dengan plat besi. Terlihat deposit kolagen berwarna biru dengan pewarnaan trichrome. Gambar 4.3 Deposit Kolagen biru pada Jaringan Granulasi Luka Bakar. aKelompok P1;b Kelompok P2;c Kelompok P3;d Kontrol positif;e Kontrol negatif Pewarnaan Trichrome, Perbesaran 200X Pada penelitian ini, data kepadatan deposit kolagen yang diambil merupakan rerata ketebalan pulasan kolagen yang dianalisis secara kuantitatif 53 dengan mengukur serapan warna RGB Red, Green, Blue menggunakan program komputer adobe photsoshop 6.0 dari semua kelompok penelitian. Data yang diperoleh adalah sebagai berikut: Tabel 4.1 Rerata Kepadatan Deposit Kolagen Kelompok Perlakuan N Rerata Kepadatan Deposit Kolagen P1 5 187.644 P2 5 169.1192 P3 5 183.5344 K+ 5 226.1024 K- 5 223.414 Grafik 4.1 Rerata Kepadatan Deposit Kolagen Keterangan : P1 = Konsentrasi ekstrak daun binahong sebesar 10 P2 = Konsentrasi ekstrak daun binahong sebesar 20 P3 = Konsentrasi ekstrak daun binahong sebesar 40 K+ = Salep Silver Sulfadiazin K- = Basis salep Dari Tabel 4.1 dan Grafik 4.1 dapat disimpulkan bahwa ketebalan pulasan kolagen yang menggambarkan kepadatan deposit kolagen pada pembentukan jaringan granulasi paling tinggi terdapat pada kelompok kontrol positif yaitu sebesar 226,1024 pixel. Kepadatan deposit kolagen pada kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak daun binahong lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kepadatan deposit kolagen pada kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak daun binahong terendah terdapat pada kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak daun binahong sebesar 20 Kelompok P2. 50 100 150 200 250 Re rat a De pos it K ol age n p ix el Kelompok Penelitian Grafik Rerata Kepadatan Deposit Kolagen p1 p2 p3 k+ k- 54 Selanjutnya dilakukan penghitungan secara statistik menggunakan One-Way Anova karena distribusi data normal dan variasi data homogen. Setelah dilakukan penghitungan didapatkan data sebagai berikut : Tabel 4.2 Hasil Analisis Data Pengaruh Ekstrak Daun Binahong terhadap Kepadatan Deposit Kolagen Kelompok Perlakuan N Mean Standar Deviation P Value Kepadatan Deposit Kolagen P1 5 187,64 12,62492 0,000 P2 5 169,12 13,21485 P3 5 183,53 9,18782 K+ 5 226,10 12,56250 K- 5 223,41 17,08568 Berdasarkan tabel 4.2 di atas, terdapat nilai p sebesar 0,000 p0,05 yang berarti minimal terdapat dua kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wardana 2013 menunjukkan bahwa pemberian topikal ekstrak daun binahong sebanyak 5 dapat meningkatkan deposit kolagen pada penyembuhan luka bakar kulit derajat 3 dibandingkan dengan kontrol negatif. 41 Kandungan zat saponin pada ekstrak daun binahong dapat menstimulasi pembentukan kolagen tipe 1. Selain itu, flavonoid yang terdapat dalam ekstrak daun binahong juga dapat menghambat proses peroksidasi lipid. Adanya penghambatan pada proses peroksidasi lipid meningkatkan sintesis DNA pada fibroblas, mencegah kerusakan sel, dan meningkatkan serat kolagen sehingga viabilitas serat kolagen meningkat. 14 Studi lain menyebutkan bahwa serabut kolagen mulai terlihat pada hari ke- 3 pasca perlukaan yang muncul dari tepi luka. Pada fase proliferasi, serabut kolagen diproduksi oleh fibroblas dan dipengaruhi oleh TGF β dari sel makrofag. Jenis serabut kolagen yang dihasilkan adalah kolagen tipe III. Sintesis kolagen tipe III akan berubah menjadi kolagen tipe I yang memiliki kekuatan regang lebih kuat pada fase remodeling, yaitu pada hari ke - 14 pasca perlukaan. 34 Penelitian yang dilakukan oleh Jiang et al 2004 menunjukan bahwa pembentukan kolagen dipengaruhi oleh kadar keasaman pH. 47 Molekul kolagen berbentuk globular pada pH sekitar 2,5 – 4,5. Pada pH yang lebih tinggi yaitu