14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan April - November 2012 dan bertempat di
Laboratorium Biosain, Puslit Biologi, LIPI Cibinong, Bogor.
3.2 Bahan Tumbuhan
Sampel akar Lasianthus reticulatus Blume diambil dari tumbuhan yang berlokasi di Kalimantan Tengah pada bulan Maret 2011. Sampel
diidentifikasi jenisnya di Herbarium Bogoriensis, Puslit Biologi-LIPI Bogor.
3.3 Alat dan Bahan
a. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain rotary evaporator Heidolph, labu evaporator Duran, erlenmeyer Pyrex,
neraca analitik, refrigerator Sanyo, lemari asam, Laminar Air Flow LAF, autoklaf Hirayama, cawan petri Pyrex, inkubator WTC
Binder, jarum ose, spreader, tabung reaksi Pyrex, rak tabung reaksi, oven, pipet tetes, vial, inkubator, shaker incubator, pinset, corong, freeze
dry Eyela, spatula, kaca arloji, pendeteksi fluoresensi UV Camag, kolom kromatografi tinggi kolom 111 cm dengan diameter 4,5 cm; dan
tinggi kolom 61 cm dengan diameter 2,5 cm, plat KLT silica gel 60 F
254
Merck
b. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain n-heksan, etil asetat, metanol, aqua bidest, Nutrient Agar Criterion Hardy Diagnostic,
Nutrient Broth DIFCO, Brain Heart Infussion Merck, Agar Wako, Aquadest steril, kloramfenikol Sigma, etanol, DMSO, pereaksi warna
Serium IV sulfat, pereaksi warna Vanillin-HCl, pereaksi warna Dragendorf, Sephadex LH-20 Merck, silica gel 60 0,063-0,200 mm 70-
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
230 mesh Merck, kapas, seasand Merck, celite Merck, aseton, larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT Sigma.
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Maserasi Akar Lasianthus reticulatus Sampel akar Lasianthus reticulatus yang diperoleh dari Kalimantan
Tengah diambil dalam keadaan segar kemudian dioven pada temperatur 50
o
C selama 24 jam, lalu digunting hingga diperoleh ukuran yang lebih kecil. Akar kemudian digiling hingga diperoleh serbuk akar ginseng hitam.
Serbuk akar ginseng hitam diekstraksi dengan cara maserasi bertingkat, dimana penggantian pelarut dilakukan secara berturut-turut
dengan menggunakan pelarut n –heksan, etil asetat, kemudian metanol.
Sampel direndam dengan pelarut n-heksan sebanyak 500 mL dengan pergantian pelarut sebanyak 3 kali selama 24 jam. Kemudian residu dari n-
heksan direndam dengan pelarut etil asetat sebanyak 500 mL dengan pergantian pelarut sebanyak 3 kali selama 24 jam. Terakhir residu dari etil
asetat direndam dengan pelarut metanol sebanyak 500 mL dengan pergantian pelarut sebanyak 5 kali selama 48 jam. Kemudian masing-masing
filtrat disaring dengan kapas dan dipekatkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.
Perhitungan rendemen ekstrak: Rendemen ekstrak =
x 100
3.4.2 Bioautografi Antibakteri 3.4.2.1 Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat dilakukan sesuai dengan bahan dan jenis masing- masing alat. Alat yang akan disterilkan harus dalam keadaan bersih dan
kering. Tabung reaksi, vial, erlenmeyer ditutup mulutnya dengan alumunium voil, dan petri dish dibungkus dengan plastik tahan panas
hingga rapat kemudian disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121
o
C selama 20 menit. Sementara pinset, jarum ose disterilkan dengan cara
dipijarkan pada nyala api Bunsen.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.2.2 Pembuatan Medium
a. Nutrient Agar NA
Pada pembenihan bakteri S. aureus pada agar miring menggunakan medium Nutrient Agar NA. Sebanyak 1,15 g serbuk
NA dilarutkan dalam 50 ml aquadest, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121
o
C selama 20 menit. b.
Nutrient Broth NB Sebanyak 0,4 g serbuk NB dilarutkan dalam 50 ml aquadest,
kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121
o
C selama 20 menit.
c. Brain Heart Infussion dan Agar 0,9 wv BHI+A
Sebanyak 3,7 g serbuk BHI dicampur dengan 0,9 g Agar dan dilarutkan dengan 100 ml aquadest steril, kemudian disterilkan dalam
autoklaf pada temperatur 121
o
C selama 20 menit.
3.4.2.3 Pembiakkan Bakteri Uji Bakteri uji S. aureus LIPI-MC diinokulasikan ke media Nutrient
Agar NA miring dengan menggunakan ose yang disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen, lalu diinkubasi pada temperatur 37
o
C selama 24 jam.
3.4.2.4 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Bakteri uji S. aureus LIPI-MC diinokulasi ke media Nutrient Broth
NB sebanyak 1 ose yang telah disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api Bunsen, lalu diinkubasi di dalam shaker incubator dengan
temperatur 37
o
C kecepatan 100 rpm selama 24 jam.
3.4.2.5 Pembuatan media bioautografi Suspensi bakteri uji S. aureus dalam media NB diambil sebanyak
10 mL, kemudian dicampur ke dalam campuran media BHI dan Agar 0,09 wv dalam petri dish dan diratakan dengan spreader.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.2.6 Pembuatan larutan kloramfenikol Larutan kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 8 µgmL.
Kloramfenikol ditimbang sebanyak 0,2 mg kemudian dilarutkan ke dalam 25 mL DMSO 10.
3.4.2.7 Penyiapan plat kromatografi Plat disimpan didalam oven pada temperatur 60
o
C selama 1 jam. Kemudian masing-masing ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol
dengan konsentrasi 10 mgmL ditotol pada plat yang berbeda sebanyak 20µL dan dielusi dengan pelarut yang sesuai, yaitu untuk ekstrak n-heksan
menggunakan campuran pelarut n-heksan – etil asetat 4:1, untuk ekstrak
etil asetat dengan campuran pelarut etil asetat – n-heksan 4:1, dan untuk
ekstrak metanol dengan campuran pelarut diklorometan-metanol-air 8:2:1. Kemudian ditotol dengan ekstrak yang tidak dielusi di samping
ekstrak yang telah di elusi sebelumnya. Pada plat yang berbeda, ditotolkan kloramfenikol sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 8 µgmL. Plat
disimpan di dalam desikator hingga siap untuk digunakan.
3.4.2.8 Uji bioautografi antibakteri Choma, 2006; Valgas, et al, 2006 Plat yang telah disiapkan sebelumnya dicelupkan selama 5 detik
ke dalam media BHI dan Agar yang telah dicampur dengan suspensi bakteri uji, kemudian disimpan di dalam petri dish, lalu diinkubasi selama
16 jam pada temperatur 37
o
C. Kemudian plat disemprot dengan larutan p- iodonitrotetrazolium violet INT, lalu diinkubasi selama 1 jam pada
temperatur 37
o
C. Aktivitas inhibisi terlihat dengan terbentuknya zona bening dengan latar belakang warna ungu pada plat.
3.4.3 Isolasi ekstrak akar Lasianthus reticulatus Kromatografi
3.4.3.1 Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mencari kondisi
pemisahan yang baik. Ekstrak ditotol pada plat kromatogram kemudian dielusi dengan pelarut yang sesuai, dimana senyawa pada plat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kromatogram dapat terpisah dengan baik. Ekstrak n-heksan dielusi dengan pelarut n-heksan-etil asetat 4:1, ekstrak etil asetat dielusi dengan pelarut
etil asetat-n-heksan 4:1, dan ektrak metanol dielusi dengan campuran pelarut diklorometan-metanol-air 8:2:1. Selanjutnya plat kromatografi
diamati di bawah sinar UV dan disemprot dengan pereaksi warna serium, vanillin-HCl, atau dragendorf untuk memperjelas pola kromatogramnya.
Peraksi serium merupakan pereaksi warna untuk senyawa secara umum, pereaksi warna vanillin-HCl merupakan pereaksi spesifik untuk senyawa
golongan flavonoid, dan pereaksi warna dragendorf spesifik untuk senyawa golongan alkaloid.
3.4.3.2 Kromatografi Kolom Kromatografi kolom yang digunakan yaitu kromatografi kolom
dengan fasa normal, dimana fasa diamnya Sephadex LH-20 yang menggunakan kolom buret dengan tinggi 111 cm dan diameter 4,5 cm.
Fase gerak yang digunakan yaitu etanol 96 dengan laju alir 5 mLmenit, ditampung ke dalam tabung reaksi sebanyak 30 mL yang menghasilkan 14
fraksi. Fraksi yang dihasilkan kemudian dilakukan kromatografi kolom lebih lanjut dengan fase diam Silica gel 60 yang menggunakan kolom
buret dengan tinggi kolom 61 cm dan diameter 2,5 cm. Fase gerak yang digunakan yaitu campuran dari pelarut n-heksan dan etil asetat dengan laju
alir 5 mLmenit dan ditampung ke dalam tabung reaksi sebanyak 30 mL. Untuk fraksi 5 menggunakan fase gerak n-heksan-etil asetat 5:1 yang
menghasilkan 11 fraksi. Untuk fraksi 4 menggunakan fase gerak n-heksan- etil asetat 3:1 yang menghasilkan 14 fraksi. Fraksi 4.5; 5.3; 5.4; 5.5; 5.6;
5.7; 5.8 dan 5.9 dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
3.4.3.3 KLT preparatif Hasil fraksinasi dengan kolom kromatografi yaitu fraksi 4.5; 5.3;
5.4; 5.5; 5.6; 5.7; 5.8 dan 5.9 dilanjutkan KLT preparatif dengan menggunakan plat KLT ukuran 20x10 cm dan n-heksan-etil asetat 2:1
sebagai fasa geraknya.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.4 Analisis struktur kimia dengan NMR
Identifikasi senyawa dilakukan dengan spektroskopi Proton NMR
1
H-NMR JEOL
500 MHz.
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori