METODE UMUM PENELITIAN Keragaman dan Struktur Genetik Populasi Jati Sulawesi Tenggara Berdasarkan Marka Mikrosatelit
15 Lokasi Wadila terletak di Gunung Sejuk, Sampolawa, kabupaten Buton.
Lokasi ini awalnya merupakan lokasi pertanaman jati yang pernah ditebang habis pada tahun 1958, kemudian dibiarkan sampai sekarang, dan pada lokasi ini
kemudian tumbuh secara alami tanaman jati dan sekarang dikenal oleh masyarakat sebagai jati alam.
Tabel 3.1. Koordinat posisi geografis populasi jati dari Sulawesi Tenggara
Populasi Lintang Bujur Lokasi
Dolok 4.63 LS
122.70 BT Pulau Muna
Warangga 4.84 LS
122.65 BT Pulau Muna
Sampolawa 5.53 LS
122.68 BT Pulau Buton
Pengambilan sampel tanaman berupa daun muda serta buah jati ditujukan untuk mempelajari keragaman genetik, struktur genetik serta aspek dinamika
akibat adanya perpindahan informasi genetik berupa aliran gen gene flow melalui serbuk sari dan biji, serta untuk mempelajari sistem perkawinan mating
system pada tanaman jati.
Gambar 3.1. Peta lokasi tempat pengambilan sampel populasi jati di Kabupaten Muna Dolok dan Warangga dan Kabupaten Buton Sampolawa
16 Material jaringan daun yang diambil untuk diekstrasi DNA nya adalah
daun yang masih muda dan masih akan berkembang, kira-kira berukuran 8 - 12 cm dan diambil sebanyak 5 - 7 helai. Daun-daun tersebut kemudian diletakan di
antara dua kertas yang dapat menyerap air kemudian dikeringkan pada ruangan ber AC air-conditioning room atau dikering anginkan. Material daun dapat juga
disimpan dalam kantong ziplock yang berisi silika gel. Jaringan tersebut juga dapat diambil langsung dilapang menggunakan tabung microtube 1.5-2.0 ml yang
mengandung buffer ekstraksi, namun dengan cara ini daun tersebut harus segera di gerus untuk diekstrasi atau dapat disimpan dalam waktu cukup lama sebelum
diekstrak pada suhu -20
o
C. Sedangkan benih diambil dengan cara memanen benih sebanyak 100-150
biji dari 15-20 pohon yang dianggap sebagai induk potensial, untuk masing- masing populasi. Benih-benih tersebut dikecambahkan untuk kemudian diisolasi
DNA nya.
Prosedur Molekular dengan Marka Mikrosatelit Isolasi DNA
Isolasi DNA daun jati dilakukan menggunakan metode CTAB. Sebanyak 1 gram daun jati muda ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dengan
mortal, serbuk halusnya kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf . Untuk sampel sebanyak 0.3 g yang telah dimasukkan ke dalam tabung eppendorf
tersebut kemudian ditambahkan 700 µL buffer CTAB 100 mM Tris-HCL pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2 bv CTAB, yang sebelumnya dipanaskan pada
suhu 65
o
C dan 0.2 β-mercaptoethanol yang ditambahkan pada saat melakukan
ekstraksi dan digoyang-goyang supaya tercampur sempurna selama 30 detik. Sampel dalam buffer diinkubasi dalam penangas air pada suhu 65
o
C selama 30 menit dan sesekali dibolak-balik secara perlahan supaya buffer tercampur
sempurna dengan sampel. Kemudian campuran tersebut dibiarkan pada suhu ruang selama beberapa menit untuk menurunkan suhu.
Untuk memisahkan larutan DNA dengan kotoran lainnya ditambahkan kloroformisoamilalkohol 24:1 sebanyak 700 µL dan digoyang-goyang sampai
terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 15
17 menit pada suhu ruang. Larutan bagian atas dipipet dan dimasukan ke dalam
tabung yang baru kemudian ditambahkan 750 µL isopropanol dingin dan digoyang-goyang secara perlahan. Penambahan isopropanol dingin akan
menyebabkan terbentuknya benang-benang DNA yang halus berwarna putih. Pengendapan DNA dilakukan dengan sentifugasi pada kecepatan 15000
rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Larutan bagian atas dibuang dan pellet dicuci dengan 200 µL ethanol 70 dengan cara mengoyang-goyang dan
disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit kemudian ethanol 70 dibuang dengan cara dipipet kemudian pellet dikeringkan dengan cara membalikan tabung di atas
kertas tisue dan divacum selama 10 menit sampai kering. Endapan DNA dilarutkan dengan 50 µL aquabidest dengan cara digoyang-goyang secara
perlahan dan diinkubasi selama 30 menit atau satu malam pada suhu 37
o
C, sebelum digunakan disimpan pada -20
o
C , untuk analisa selanjutnya.
Penetapan Kualitas dan Kuantitas serta Visualisasi DNA.
Ukuran dan integritas DNA ditentukan berdasarkan elektroforesis gel agarose 1. Pembuatan gel agarose 1 bv dilakukan dengan cara melarutkan
1.0 g tepung agarose ke dalam 100 ml larutan buffer 1 x TAE 50 x TAE untuk 1 L mengandung 242 g Tris-base, 57.1 mL asam asetat glasial dan 100 mL 0.5 M
EDTA-Na
2
pH 8.0 kemudian dipanaskan dalam microwave selama 2 menit sampai agarose benar-benar larut. Larutan agarose diinkubasi selama 30 menit
untuk menurunkan suhunya hingga mencapai 65
o
C. Kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah dipasang sisir dan dibiarkan sampai mengeras kira-
kira 1 jam kemudian sisir dicabut dari gel secara perlahan. Gel yang telah mengeras dimasukan ke dalam bak elektroforesis dengan posisi sisir pada
elektroda negatif dan ke dalam bak dimasukkan larutan buffer 1 x TAE sampai seluruh terendam.
Pengujian dilakukan dengan menggunakan 10 µL sampel DNA dilarutkan dengan 5 µL aquabides dan 5 µL loading buffer FDEU 90 delonized
formamide, 0.1 M EDTA, 10 xylene cyanol, 10 bromophenol blue dan 8 wv urea dan dicampur merata. Elektroforesis DNA dilakukan dengan
memasukan sebanyak 20 µL campuran DNA, aquabides dan loading buffer ke dalam lubang gel. Alat elektroforesis dihubungkan dengan power suplai listrik
18 model 1000500 BIORAD pada tegangan konstan 75 volt, setelah pewarna
pewarna mencapai jarak 1 cm dari pinggir bawah gel, power suplai listrik dimatikan kira-kira selama 60 menit. Gel hasil elektroforesis direndam dalam
larutan buffer 1 x TAE yang diberi 0.5 µgmL etidium bromida sambil digoyang- goyangkan selama 20 menit kemudian dibilas dengan aquades selama 10 menit.
Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan transiluminator UV model T2202 Sigma untuk melihat pendaran DNA yang diberikan etidium bromida dan
hasilnya difoto dengan menggunakan film Polaroid 667.
Amplifikasi DNA.
DNA diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik yang telah dikembangkan untuk jati dari proyect ICA4-2000-20053 Tabel 3.2. Reaksi
amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 25 µL yang merupakan campuran larutan yang terdiri atas AmpliTaq DNA polimerase dan Stoffel fragment, dNTPs
masing-masing dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP 0.4 mM, 2.5 µg bovine serum albumin BSA dan buffer 3 mM MgCl
2
, 30 mM KCl dan 10 mM Tris, pH 8.3, 25 pmol primer, 2 µL DNA cetakan, dan 18 µL dH
2
O supaya mencapai volume akhir 25 µL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf volume 500 µL dispin secara
pelahan lahan supaya semua larutan tercampur sempurna. Minyak mineral ditambahkan keatas campuran larutan PCR dan DNA cetakan sebanyak 20 µL
untuk menghindari penguapan selama berlangsungnya reaksi.
19 Tabel 3.2. Nama dan sekuen primer mikrosatelit berasal dari project jati
TEAKDIV ICA4-2000-20053
No Primer
Sekuen
1 AG04
for: 5’-AGAGGAGGTGCAGAGAGCAG-3’ rev: 5’-TAGCATTTGCTGCAAGCTGT-3’
2 AG16
for: 5’-ATGCAAAAACGGAGTCTTGG-3’ rev: 5’-GGCAGAGCTATCTGAAGATCC-3’
3 AGT10
for: 5’-TGCAGATAAAATGCTTGTGGA-3’ rev: 5’-CGCGAGAAATAGACCAGTGC-3’
4 AC44
for: 5’-ACGCGGGTGTTAGGAAAATG-3’ rev: 5’-CCCATCAAACTGAGACAACCA-3’
5 AC01
for: 5’-CATGTTGTATCATGAATGTG-3’ rev: 5’-CCTAGAAGAGAACCCCATGC-3’
6 AG14
for: 5’-TCCACGACTCATGCAGGCTA-3’ rev: 5’-CCAACCAACCCTTTCAAATCC-3’
7 ATC02
for: 5’-TCAAAGCTTGGCTACCACCA-3’ rev: 5’-GCCGAATTGGGACGACTTTA-3’
8 AC28
for: 5’-ACGGCTATCAGACCAGCAGA-3’ rev: 5’-ATGCATGGCATGTTCTACCC-3’
9 AAG10
for: 5’-GTGCACCAAGTCCGAGCAAT-3’ rev: 5’-CGAGAACCCGAACCTAACCA-3’
10 CPIMS
for: 5’-TTTCCCGTTATGTAGAGAATTGA-3’ rev: 5’-CCCAAATTGTGAACGATGAA-3’
Tabung berisi campuran larutan PCR dan DNA cetakan dimasukkan ke dalam mesin PCR. Reaksi amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan
mesin PCR Gene Amp PCR system 2400 Perkin-Elmer dan diprogramkan untuk PCR
awal pada suhu 95
o
C selama 5 menit satu siklus. Denaturasi DNA cetakan dari utas ganda menjadi utas tunggal pada suhu 95
o
C selama 1 menit, penempelan primer ke DNA cetakan pada suhu 36
o
C selama 1 menit dan pemanjangan pada 72
o
C selama 2 menit sebanyak 45 siklus, dan pemanjangan akhir pada suhu 72
o
C selama 5 menit satu siklus, dan pendinginan pada suhu 4
o
C selama tidak terhingga satu siklus.