megaterium MS941 REKOMBINAN YANG MENGANDUNG GEN

OPTIMASI PRODUKSI PENISILIN ASILASE PAc MENGGUNAKAN

B. megaterium MS941 REKOMBINAN YANG MENGANDUNG GEN

pac DARI B. thuringiensis BGSC BD1 DENGAN METODE RESPON PERMUKAAN FENTRI PARAMITHA PUTRI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Optimasi Produksi Penisilin Asilase PAc Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2014 Fentri Paramitha Putri NIM P051114041 RINGKASAN FENTRI PARAMITHA PUTRI. Optimasi Produksi Penisilin Asilase PAc Menggunakan B. megaterium MS941 Rekombinan yang Mengandung Gen pac dari B. thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan. Dibimbing oleh KHASWAR SYAMSU dan ASTUTIATI NURHASANAH Penisilin asilase PAc, EC 3.5.1.11 adalah enzim yang sangat berperan dalam reaksi hidrolisis benzilpenisilin untuk menghasilkan asam 6-amino penisilanat 6-APA yang merupakan bahan dasar antibiotika penisilin semisintetis. Ukuran gen btpac-bd1 hasil amplifikasi PCR adalah 2397 bp. Respon surface methodology RSM atau metode permukaan respon dengan menggunakan dua variabel yang ditambahkan di media produksi, yaitu dengan xilosa sebagai induser dan CaCl 2 sebagai kation divalent, telah digunakan untuk mendapatkan aktivitas dan aktivitas spesifik enzim PAc maksimal oleh B. megaterium btpacBD1. Untuk dapat mencapai tujuan ini, kombinasi lima tingkat konsentrasi xilosa dengan rentang 0.13 s.d 0.87 dengan lima tingkat konsentrasi CaCl 2 dengan rentang 0.64 mM s.d 4.36 mM sebanyak 22 percobaan telah diujicobakan. Kultivasi batch dilakukan menggunakan labu erlenmeyer kocok pada suhu 28 ° C agitasi 180 rpm selama 48 jam kultivasi dengan volume kerja 100 mL dan 100 µL tetrasiklin sebagai media seleksi. Setiap percobaan diinokulasi dengan 10 inokulum dengan OD 578nm sebesar 0.6 – 0.8 Rajendhran et al. 2002. Pemisahan enzim dari media kultivasi dilakukan dengan sentrifugasi suhu 4 ° C 6000 rpm selama 15 menit. Aktivitas enzim PAc pada ekstrak enzim kasar diuji dengan metode Balasingham et al. 1972. Penentuan kadar protein menggunakan metode Bradford 1976 mengggunakan Bovine Serum Albumin sebagai standar. Aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim per milligram protein. Hasil komposisi media optimal diujicoba pada bioreaktor skala 10 Liter dengan volume kerja 5 Liter. Metode Central Composite Design CCD yang digunakan untuk menganalisa pengaruh antara kombinasi xilosa dan CaCl 2 ketika B. megaterium btpacBD1 dikultivasi pada skala labu erlenmeyer menunjukkan bahwa xilosa dan CaCl 2 memberikan pengaruh yang nyata terhadap aktivitas PAc dari B. megaterium btpacBD1 dan model kuadratik dipilih berdasarkan hasil percobaan dengan R 2 =0.86 nilai p 0.0001. Aktivitas spesifik PAc tertinggi tercapai dan saat konsentrasi xilosa dan CaCl 2 0.49 dan 2.40 mM pada pH medium sekitar 7. Pada kondisi itu, aktivitas PAc yang didapatkan sebesar 1.318 ± 0.406 UmL dengan kadar protein 0.0101 ± 0.01 mgmL dan aktivitas spesifik 130.669 ± 50.241 Umg. Verifikasi hasil komposisi media optimal pada labu Erlenmeyer dilakukan dan menghasilkan aktivitas enzim PAc 1.294 ± 0.171 UmL dengan kadar protein 0.0102 ± 0.0003 mgmL dan aktivitas spesifik 125.910 ± 13.309 Umg. Komposisi media optimal digunakan pada skala bioreaktor 10 L. Aktivitas tertinggi 2.0687 ± 0.0820 UmL dan kadar protein tertinggi 0.0078 ± 0.0008 mgmL didapatkan pada jam ke-48 waktu kultivasi. Sedangkan aktivitas spesifik tertinggi 1260.521± 27.5711 Umg. dihasilkan pada jam ke-18 waktu kultivasi. Kata kunci : Bacillus megaterium, CaCl 2 , CCD, Penisilin asilase, xilosa SUMMARY FENTRI PARAMITHA PUTRI. Optimization for Penicillin acylase PAc Production by Recombinant B. megaterium MS941 containing pac gene from B. thuringiensis BGSC BD1 using Response Surface Methodology Supervised by KHASWAR SYAMSU and ASTUTIATI NURHASANAH Penicillin G acylase Penicillin amidohydrolase EC 3.5.1.11 PAc catalyzes the conversion of benzylpenicillin, via hydrolysis of the amide bond in the benzylpenicillin side chain, releasing phenylacetic acid and 6-aminopenicillanic acid 6-APA. 6-APA is a key intermediate in the production of various semisynthetic penicillins. The size of btpac-bd1 gene from PCR amplification was 2397 bp. Respon surface methodology RSM with two variables added to the production medium, i.e. xylose as inducer and CaCl 2 as divalent cations, were used to obtain the optimum and specific activity of PAc produced by Bacillus megaterium btpacBD1. For this purpose, five different xylose concentrations ranging from 0.13 to 0.87 and five different CaCl 2 concentration ranging from 0.64 mM to 4.36 mM were analysed in combinations, in a total of 22 experiments. Batch cultivation was carried out with agitation at 28 ° C at 180 rpm for 48 hours in 500 mL buffeled erlenmeyer flasks containing 100 mL of cultivation medium. Each flask was then inoculated with 10 v⁄v inoculum with initial OD 578nm between 0.6 to 0.8 Rajendhran et al. 2002. To harvest, culture was centrifuged at 4 ° C and 6000 rpm for 15 min. The PAc activity in the clear supernatant was assayed according to the Balasingham et al. method 1972. Protein assay was performed according to the Bradford method 1976 using bovine serum albumin as protein standard. Specific activity of PAc was expressed as units per mg protein. The optimum medium composition was applied in the scaled up fermentation using a 10 Liter bioreactor with working volume 5 Liter. Central composite design used for the analysis of treatment combinations showed that when B. megaterium strain btpacBD1 was cultivated in shake flasks, xylose and CaCl 2 had significant effects on PAc volumetric activity and the quadratic model was in good agreement with the experimental results R 2 = 0.86 p-value 0.0001. The maximum specific activity was reached when xylose and CaCl 2 concentrations were 0.49 and 2.4 mM, respectively, and medium pH around 7. Under such conditions, the activity of PAc achieved was 1.318 ± 0.406 UmL with protein concentration 0.0101 ± 0.01 mgmL and spesific activity 130.669 ± 50.241 Umg protein. The validation experiment in shake flasks demonstrated that with such medium composition the volumetric activity achieved was 1.294 ± 0.171 UmL with protein concentration 0.0102 ± 0.0003 mgmL and spesific activity of PAc 125.91 ± 13.309 Umg. The optimum medium composition was applied in 10 L bioreactor. The optimum volumetric activity 2.0687 ± 0.0820 UmL and protein concentration 0.0078 ± 0.0008 mgmL were achieved 48 h after the start of the cultivation. However, the optimum PAc specific acivity 1260.52 ± 27.5711 Umg protein was achieved 18 h after the start of the cultivation. Keywords: Bacillus megaterium, CaCl 2 , CCD, Penicillin acylase, xylose © Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi OPTIMASI PRODUKSI PENISILIN ASILASE PAc MENGGUNAKAN

B. megaterium MS941 REKOMBINAN YANG MENGANDUNG GEN

pac DARI B. thuringiensis BGSC BD1 DENGAN METODE RESPON PERMUKAAN SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014 FENTRI PARAMITHA PUTRI Penguji pada Ujian Tesis: Dr Ir Mulyorini Rahayuningsih, MSi