Hasil prediksi signal peptida lipase SP

DAFTAR SINGKATAN 6 APA : Asam 6-amino penilsilanat CCD : Central Composite Design LPS : Lipopolisakarida Larutan CI : Larutan Chloroform Isoamyl alcohol Larutan PCI : Larutan Phenol Chloroform Isoamyl alcohol Larutan PDAB: Larutan p-dimethylamino-benzaldehyde LB : Luria Bertani LB cair-tet : Luria Bertani cair yang ditambah 1 tetrasiklin 12.5 mgmL LB padat-tet : Luria Bertani padat yang ditambah 1 tetrasiklin 12.5 mgmL MCS : Multiple Cloning Site OD : Optical Density PAc : Penicillin Acylase Penisillin Asilase PCR : Polymerase Chain Reaction Pen-G : Penisilin G pMMbtpac-bd1 : Plasmid pMM1525 rekombinan yang disisipkan gen btpac-bd1 RSM : Response Surface Methodology Tc : Tetracyclin Xyl A : Promotor Xilose A Xyl R : Xylose Dependent Repressor 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Antibiotika yang paling banyak digunakan sekitar 19 dari pasar antibiotik dunia adalah penisilin G Pen-G Parmar et al. 2000. Pen-G bekerja dengan menghambat kerja enzim transpeptidase sehingga pembentukan peptidoglikan dinding sel bakteri tidak terjadi pada fase produksi Madigan et al. 2003. Saat ini penggunaan penisilin telah mengarah pada resistensi patogen karena digunakan dalam jumlah besar dan secara terus-menerus. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa bakteri patogen dapat memproduksi enzim β-laktamase yang mampu menghidrolisis cincin β-laktam menjadi penisilin yang tidak aktif penicilloic acid Navarro et al. 2004. Selain itu, pen-G merupakan antibiotik yang sensitif terhadap β-laktamase dan tidak stabil terhadap asam sehingga menimbulkan alergi pada beberapa penggunanya Madigan et al. 2005. Oleh karena itu, dikembangkan antibiotik-antibiotik turunan pen-G melalui modifikasi struktur penisilin dengan membentuk produk penisilin semisintetik yang memiliki sifat- sifat yang lebih baik dari pada penisilin alami agar efektifitas antibiotik ini dapat diperoleh kembali Wilson 1982; Hammond 1978. Dalam industri, enzim yang dapat menghidrolisis Pen-G adalah penicillin G acylase PGA atau penisilin asilase PAc yang bekerja dengan memutus ikatan amida pada rantai samping sehingga menghasilkan inti molekul penisilin atau asam 6-amino penilsilanat 6-APA Wilson 1982; Greenwood 1995. Zat 6- APA merupakan bahan baku utama untuk produksi penisilin semisintetik seperti metilsilin, ampisilin dan amoksisilin serta inhibitor β-laktamase asam klavulanat Wilson 1982. Ampisilin dan amoksisilin adalah antibiotik yang dapat bekerja pada membran sel bakteri gram positif maupun negatif. Zat 6-APA dapat diproduksi melalui proses fermentasi, hidrolisis penisilin secara kimiawi, dan enzimatik. Proses hidrolisis pen-G menjadi 6-APA menggunakan enzim PAc dijadikan pilihan karena mudah dilakukan dan paling menguntungkan Crueger dan Crueger 1984; Shewale dan Sivaraman 1989; Carrington 1971. Langkah awal yang dilakukan untuk menghidrolisis pen-G menjadi 6-APA diperlukan enzim PAc. Peningkatan produksi PAc banyak dilakukan melalui optimasi rekayasa genetika dan optimasi bioproses berdasarkan komposisi media atau kondisi kultivasi. Penggunaan teknik rekayasa genetika telah berhasil mengembangkan strain yang menghasilkan PAc dalam jumlah besar, yaitu dengan teknologi DNA rekombinan dengan cara kloning gen pac ke dalam plasmid. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan untuk mengubah urutan-urutan tertentu yang berkaitan dengan pengendalian ekspresi gen secara tepat dan terarah. Bakteri gram negatif penghasil enzim PAc adalah Escherichia coli Cole 1969, Kluyvera citrophila Barbero et al. 1986, Providencia rettgeri Proteus rettgeri Klei et al. 1995 dan Alcaligenes faecalis Verhaert et al. 1997. Sedangkan bakteri gram positif berasal dari golongan Arthrobacter viscosus Ohashi et al. 1989 dan Bacillus megaterium Chiang dan Bennet 1967. Selain B. megaterium, bakteri gram positif lain yang berpotensi dan dapat dieksplorasi untuk memproduksi enzim PAc adalah B. thuringiensis serovar Huazhongensis BGSC galur 4 CC1, 4 BD1, 4 AJ1 dan 4 AW1. Berdasarkan data sekuens genom yang tersedia di GenBank keempat galur B. thuringiensis tersebut memiliki gen 2 penyandi enzim PAc. Hasil analisa mikrobiologi menggunakan Serratia mercescens menunjukkan keempat galur B. thuringiensis tersebut menghasilkan enzim PAc yang mampu menguraikan Pen-G Nurhayati 2009. Namun bakteri yang memproduksi enzim PAc secara komersial adalah E.coli dan B. megaterium Vandamme dan Voets 1974. B. megaterium dengan aktivitas protease ekstraseluler yang relatif rendah telah dikembangkan sebagai sel inang untuk produksi protein rekombinan Wittchen dan Meinhart 1995. Berbeda dengan ekspresi protein rekombinan pada E. coli yang biasanya terjadi secara intraseluler, ekspresi pada B. megaterium dapat dilakukan secara ekstraseluler, menggunakan vektor ekspresi yang tepat misalnya yang dilakukan oleh Malten et al. 2006. Berbeda dengan ekspresi intraseluler di E. coli, proses panen dilakukan dengan sentrifugasi dingin karena sekresi protein langsung ke media kultivasi sehingga tahap lisis sel dengan sonikasi seperti pada E.coli tidak perlu dilakukan Hammond 1978. Kekurangan E. coli lain adalah keberadaan lipopolisakarida LPS sebagai salah satu komponen membran luar pada bakteri gram negatif yang bersifat racun bagi manusia endotoksin. Kloning gen pac diamplifikasi dari DNA genom B. thuringiensis BGSC BD1. Produk amplifikasi Polymerase Chain Reaction PCR yaitu gen btpac-bd1 disisipkan ke DNA plasmid pMM1525 dengan menghilangkan sinyal peptida di dalam plasmid. Hal ini dilakukan karena berdasarkan urutan DNA gen btpac-bd1, diduga enzim PAc yang dihasilkan telah memiliki sinyal peptida sendiri yang mengarahkan untuk sekresi protein rekombinan keluar sel. Hasil konstruksi plasmid rekombinan diberi nama pMMbtpac-bd1 Nurhayati 2009. Menurut Yang et al. 2006, B. megaterium YYBm1 menghasilkan PAc tertinggi dengan penambahan xilosa 0.5 dan 2.5 mM CaCl 2 . Pemanfaatan xilosa dapat mendorong promotor xylA untuk meningkatkan produksi enzim rekombinan yang lebih tinggi Yang et al. 2006. Ion Ca 2+ merupakan kation bivalen yang merupakan modulator positif yang menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim, yang mempermudah interaksi dengan substrat sehingga meningkatkan aktivitas katalitik enzim Susanti 2003. Kasche et al. 2005 menambahkan bahwa Ca 2+ adalah kofaktor untuk transportasi membran. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian Yang et al. 2006 salah satunya adalah metode penelitian. Berbeda dengan penelitian Yang et al. 2006 yang melakukan penelitian dengan metode diskrit dengan melakukan percobaan berulang-ulang, penelitian ini menggunakan teknik optimasi menggunakan metode permukaan respon Response Surface Methodology atau RSM melalui software Design-Expert yang menggunakan bantuan model statistika dan matematika untuk mengetahui respon dari kombinasi yang dilakukan. Oleh karena itu, permasalahan utama dalam penelitian ini adalah belum diperolehnya konsentrasi xilosa dan CaCl 2 serta waktu kultivasi optimal pada produksi PAc. Tujuan dari optimasi adalah untuk meminimumkan usaha yang diperlukan atau biaya operasional dan memaksimumkan hasil yang diinginkan. berbeda dengan metode diskrit dengan melakukan percobaan berulang-ulang, penggunaan RSM melalui software Design-Expert dapat meningkatkan keakuratan dan meminimalisasi terjadinya kesalahan. Dalam optimasi ini, permasalahan akan diselesaikan untuk untuk meningkatkan keakuratan, meminimalisasi kesalahan dan mendapatkan hasil sesuai dengan batasan yang diberikan Box dan Draper 2007. 3 Perumusan Masalah Berdasarkan uraian pada latar belakang, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut : 1. Apakah kultur stok bakteri B. megaterium btpacBD1 masih mengandung gen bt-pacbd1 2. Bagaimana pengaruh besarnya kombinasi konsentrasi xilosa dan CaCl 2 terhadap kultivasi produksi enzim PAc rekombinan 3. Bagaimana pengaruh komposisi media terpilih saat dilakukan kultivasi pada skala bioreaktor 4. Kapan waktu kutivasi terbaik untuk proses panen enzim PAc Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mendeteksi keberadaan gen btpac-bd1 2. Mendapatkan komposisi media kultivasi optimal untuk produksi enzim PAc rekombinan berdasarkan konsentrasi xilosa dan CaCl 2 dengan metode Central Composite Design CCD 3. Memproduksi enzim PAc rekombinan pada skala bioreaktor 4. Mendapatkan waktu panen enzim PAc terbaik Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah untuk menghasilkan enzim PAc rekombinan yang dapat menghidrolisis antibiotik Pen-G sehingga menghasilkan zat 6-APA yang dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan penisilin semisintetik yang memiliki sifat dan kualitas yang lebih baik dari penisilin alami. Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup penelitian seleksi dan optimasi media kultivasi untuk produksi enzim PAc oleh B. megaterium btpacBD1 rekombinan adalah sebagai berikut: 1. Penyiapan inokulum meliputi peremajaan sel pada media Luria Bertani padat yang ditambahkan tetrasiklin 12.5 mgmL sebanyak 1 LB padat- tet dan persiapan prekultur pada media LB cair-tet sebagai media seleksi. 2. Pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 dilakukan dengan seleksi B. megaterium btpacBD1 dengan marka genetik, ekstraksi plasmid pMMbtpac-bd1 dan Polymerase Chain Reaction PCR 3. Kultivasi produksi PAc menggunakan metode CCD dilakukan di inkubator kocok di dalam baffled erlenmeyer 500 mL dengan volume kerja 100 mL LB cair-tet pH 7 pada suhu 2 8o C dan agitasi 180 rpm selama 48 jam. 4. Kultivasi produksi PAc dengan bioreaktor berkapasitas 10 liter dengan volume kerja 5 Liter media hasil optimasi CCD pH 7 pada suhu 28 o C dan agitasi 150 rpm dengan aerasi 1 vvm selama 60 dan 48 jam. 5. Analisa parameter produksi yang meliputi Optical Density OD, aktivitas enzim PAc UmL, kadar protein mgmL dan aktivitas spesifik enzim PAc Umg dilakukan setiap 6 jam. 4 2 TINJAUAN PUSTAKA Penisilin G Penisilin G Pen-G dikenal sebagai benzilpenisilin yang merupakan substrat dari enzim PAc untuk pengujian aktivitas enzim. Pen-G berbentuk garam kalium atau natrium yang berupa bubuk putih sampai sedikit kuning, tidak berbau, agak higroskopis relatif stabil di udara. Penisilin dapat menjadi non aktif apabila terkena pengaruh panas, sistein, NaOH, penicilinase enzim yang terdapat dalam banyak bakteri yang dapat merusak penisilin dan asam hidroklorat. Zat lain yang dapat merusak Penisilin antara lain adalah logam-logam berat seperti Cu, Ag, Fe, dan Zn Sarah 2002. Pen-G merupakan suatu antibiotika yang tidak dapat diberikan melalui mulut karena sifatnya yang tidak stabil dengan asam hidroklorat di lambung, bekerja pada lingkup kerja yang sempit hanya efektif pada bakteri gram positif. Bakteri patogen yang resisten terhadap pen-G adalah Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pneumococcus, B. antrachis, B. substilis, B. diptheria, Listeria monocytogenes, Clostridia, Gonococcus dan Meningococcus Wattimena et al. 1991 dan juga dapat menimbulkan alergi gatal-gatal serta reaksi efek samping yang menyebabkan penyakit diare dan superinfeksi dari kandidiasis. Selain itu pen-G juga sangat sensitif terhadap e nzim β-laktamase yang dapat memutus ikatan pada cincin β-laktam. Sifat dari antibiotika ini akan hilang jika cincin terputus karena β-laktamase, karena proses penghambatan enzim transpeptidase pada pembentukan lapisan peptidoglikan dinding sel bakteri tidak dapat terjadi. Selain itu, munculnya resistensi bakteri terhadap antibiotika dipengaruhi oleh adanya gen resistensi yang terdapat dalam plasmid, transposon, atau dalam kromosom bakteri Morin dan Gorman 1995; Madigan et al. 2003. Penisilin Asilase PAc, EC 3.5.1.11 Penisilin asilase PAc dikenal sebagai penisilin amidase, penisilin transferase dan penisilin amidohidrolase dengan nomor golongan enzim EC 3.5.1.11 Berdasarkan jenis substrat yang dihidrolisis, enzim ini terbagi menjadi: 1 penisilin G asilase yaitu dengan substrat benzilpenisilin; 2 penisilin V asilase yaitu dengan substrat fenoksimetilpenisilin; 3 Ampisilin asilase yaitu dengan substrat D- α aminobenzilpenisilin ampisilin. Enzim ini dapat dihasilkan oleh E. coli secara intraselular. Pada gram positif enzim ini dihasilkan oleh B. megaterium dan Micrococcus roseus. Pada B. megaterium, PAc ini dihasilkan secara ekstraselular Chiang dan Bennet 1967; Huber et al. 1972; Vandamme 1973; Meevotisom et al. 1983. 5 Gambar 1. Reaksi hidrolisis penisilin G dengan enzim PAc Rajendhran et al. 2004 Xilosa Xilosa disebut gula kayu karena merupakan senyawa gula yang pertama kali diisolasi dari kayu. Rumus kimia xilosa adalah C 5 H 10 O 5 dengan berat molekul 150,13 gmol dan titik leleh 144 – 145 ° C. Xilosa merupakan salah satu penyusun utama dari hemiselulosa, yang terkandung sekitar 30 dalam tanaman. D-xilosa dapat diperoleh melalui hidrolisis hemiselulosa xilan baik secara enzimatis maupun asam. Xilosa diklasifikasikan sebagai monosakarida tipe aldopentosa yang memiliki 5 atom karbon dan satu gugus aldehid. Kalsium klorida CaCl 2 Kalsium klorida merupakan tipe ion halida yang terdiri dari kalsium Ca dan klorin Cl. Garam ini berwarna putih, tidak berbau, tidak berwarna dan tidak mudah terbakar. Kalsium klorida dapat berfungsi sebagai sumber ion kalsium dalam larutan yang mudah larut dalam air tidak seperti senyawa kalsium lain. Zat ini dapat berguna untuk menggantikan ion dari larutan. Hasil penelitiam Yang et al. 2006 menunjukkan bahwa penambahan CaCl 2 sebesar 2.5 mM akan meningkatkan biomassa dari B. megaterium YYBm1 dan biomassa akan menurun jika ditambahkan CaCl 2 sebesar 5 mM. Ion Ca 2+ merupakan kation bivalen yang merupakan modulator positif yang menyebabkan perubahan konformasi sisi katalitik enzim, yang mempermudah interaksi dengan substrat sehingga meningkatkan aktivitas katalitik enzim Susanti 2003. Hal ini berdasarkan penelitian Duggleby et al. 1995 yang menunjukkan bahwa Ca 2+ mempengaruhi formasi dari enzim PAc aktif. Hal ini diperkuat oleh Kasche et al. 2005: Ignatova et al. 2005 yang menyatakan bahwa Ca 2+ adalah kofaktor untuk translokasi membran yang berperan dalam pelipatan dan pematangan enzim di periplasma. Bacillus megaterium dalam Sistem Ekspresi Protein Rekombinan Bakteri gram positif B. megaterium mempunyai kelebihan untuk produksi protein rekombinan karena tidak memproduksi protease alkalin ekstraseluler yang memungkinkan sebuah sistem kloning yang sangat baik dan ekspresi dari protein asing tanpa adanya degradasi dan dinding sel yang bebas dari endotoksin Meinhardt et al. 1989; Rygus dan Hillen 1991. 6 Kloning gen pac dari DNA B. thuringiensis BGSC BD1 btpacBD1 dilakukan dengan menyisipkannya ke dalam B. megaterium MS941 menggunakan DNA plasmid pMM1525 untuk membentuk konstruk plasmid DNA rekombinan pMMbtpac-bd1 Nurhayati 2009. Tahap dasar proses kloning adalah memasukkan fragmen DNA asing dengan ukuran yang spesifik ke dalam vektor dan dimasukkan ke dalam sel inang. Vektor ekspresi memiliki elemen genetik yang dapat mengkontrol proses transkripsi, translasi dan sekresi protein rekombinan yang akan diekspresikan dalam sel inang. Vektor memiliki sekuen pengatur transkripsi dan translasi gen asing untuk dapat mengekspresikan protein rekombinan Glick dan Pasternak 2003; Sambrook dan Russell 2001. Plasmid pMM1525 adalah suatu shuttle vector E.coli dan Bacillus yang dirancang untuk mengekspresikan gen asing, sehingga dapat dikenali oleh sel inang B. megaterium. Vektor ini dilengkapi dengan sinyal peptida yang memungkinkan disekresikannya enzim rekombinan keluar sel ekstraseluler. Selain itu, adanya sekuens 6x His-tag membuat protein rekombinan dapat dideteksi dan dipurifikasi dari hasil ekspresi gen. Plasmid pMM1525 juga mengandung gen xylose-dependent repressor xylR yang merupakan gen pengkode protein represor yang akan menghambat transkripsi gen pac jika tidak terdapat xilosa Dengan adanya gen xylR, protein represor yang dihasilkan akan semakin banyak, sehingga pengontrolan ekspresi gen juga akan semakin kuat. Setelah ditambahkan suatu induser yang berupa xilosa, maka xylose repressor pada plasmid akan dibebaskan dengan menginaktivasi protein represor dengan cara berikatan dengan protein represor tersebut. Protein represor yang tidak aktif tidak dapat berikatan dengan operator sehingga RNA polimerisase sel inang B. megaterium akan mentranskripsi sekuen gen yang berada di bawah sekuen promotor xylA yang memungkinkan terjadinya transkripsi gen pac jika diinduksi oleh xilosa. Hasil transkripsi tersebut kemudian ditranslasi menjadi protein rekombinan yang diinginkan MoBiTec 2007. Gambar 2. Plasmid pMM1525 MoBiTeC 2007 Plasmid pMM1525 berupa DNA ekstrakromosomal bakteri yang berupa lingkaran heliks ganda, untuk membentuk konstruk plasmid DNA rekombinan 7 yang dirancang sebagai vektor ekspresi yang baik untuk sel prokariot. Plasmid pMM1525 Gambar 4 mempunyai : 1 Promotor xlyA P xlyA untuk dikenali oleh RNA polimerase Bacillus megaterium; 2 Sekuen operator xyl untuk meningkatkan pengikatan terhadap protein represor; 3 Gen xylR untuk mengkode protein repressor; 4 Multiple cloning site MCS yang dapat didigesti oleh berbagai enzim-enzim restriksi antara lain BsrGI dan Xmal sehingga beberapa pilihan enzim tersedia untuk menginsersikan gen pada posisi ini; 5 Ribosome binding site RBS untuk meningkatkan laju translasi; 6 pBRColE1 untuk titik replikasi; 7 Gen Tet R Bac untuk penyandi gen resistensi tetrasiklin Bacillus; 8 Gen Tet R’ , Tet R ” untuk gen penyandi resistensi terhadap antibiotik tetrasiklin 9; Gen Amp R untuk gen penyandi resistensi ampisilin; 10 Sekuen purifikasi tag 6xHis, Strep or strep6xHis-double untuk deteksi dan purifikasi protein rekombinan yang dihasilkan MoBiTec 2007. Produksi Enzim PAc Mikroorganisme penghasil PAc dapat beradaptasi dengan variasi komposisi media dan parameter kultivasi yang cocok. Untuk mengoptimasi produksi PAc, kondisi kultivasi dengan mengubah parameter yang saling terkait telah dilakukan Liu et al. 2000; Maresova et al. 2001 dan berbagai komponen yang dibutuhkan seperti nutrien, sumber karbon dan sumber nitrogen juga telah dilakukan di jenis bakteri yang berbeda Pinotti et al. 2000; Rajendhran et al. 2002, 2003; Yang et al. 2006; Leonita 2013; Putri 2013. Upaya peningkatan produktivitas PAc dari Bacillus megaterium ATCC 14945 masih terus dilakukan salah satunya melalui rekayasa genetika Panbangred et al. 2000; Yang et al. 2006; Cecchini et al. 2007; Nurhayati 2009. Hasil penelitian Rao dan Garcia 1997 menunjukkan bahwa produksi PAc oleh K. citrophila dan diinduksi oleh PAA terbukti mengalami represi katabolit oleh sumber karbon yang menggunakan glukosa. Menurut Szentirmai 1964, produksi PAc meningkat jika senyawa penginduksi PAA ditambahkan ke dalam media pertumbuhan, tetapi produksi akan terhambat jika bakteri ditumbuhkan dalam media yang mengandung nutrisi yang dapat langsung diproses untuk metabolisme seperti glukosa, fruktosa dan gliserol. Menurut Valle et al. 1991, B. megaterium mungkin menghasilkan PAc ekstraseluler untuk mendegradasi PAA yang dapat digunakan sebagai sumber karbon. Namun represi katabolit tidak terjadi pada produksi enzim PAc oleh B. megaterium btpacBD1. Berdasarkan hasil penelitian Leonita 2013 yang menggunakan modifikasi media produksi Rajendhran et al. 2002 yaitu tanpa penggunaan senyawa PAA sebagai induser melaporkan bahwa aktivitas spesifik optimal oleh B. megaterium btpacBD1 adalah sebesar 1018.83 Umg selama 36 jam kultivasi dengan penambahan xilosa 4 pada media kompleks. Hasil penelitian Rajendhran et al. 2003 menunjukkan bahwa aktivitas spesifik optimal oleh strain Bacillus sp. adalah 10.1 Umg selama 16 jam kultivasi fase stasioner. Mardiah et al. 2010 melaporkan bahwa enzim PAc dapat diproduksi dari bakteri B. megaterium NRLL B-1368 pada media cair yang ditambah induser asam fenil asetat PAA setelah 12 jam kultivasi sebanyak 1.5 gL media. Aktifitas enzim PAc sebesar 9.978 UmL dan aktifitas spesifik 1.2316 Umg protein selama 48 jam. 8 Tabel 1. Penelitian produksi PAc Metode Penelitian Bakteri Non Bakteri Tipe liar Rekombinan Tipe liar Diskrit Acevedo dan Cooney 1973 Panbangred et al. 2000 Mardiah et al. 2010 Rao dan Garcia 1997 Liu et al. 2000 Moeis et al. 2000 Maresova et al. 2001 Pinotti et al. 2000 Yang et al. 2006 Agustien et al. 2008 Cecchini et al. 2007 Supartono et al. 2003 Leonita 2013 Ignatova et al. 2005 Putri 2013 Supartono et al. 2008 Savidge 1986 El Enshasy et al. 2009 Mardiah et al. 2010 RSM Rajendhran et al. 2002 Putri 2014 Rajendhran et al. 2003 Rancangan Optimasi Media Metode optimasi untuk rancangan percobaan statistik yang paling umum digunakan adalah Response Surface Methodology RSM. Dengan RSM suatu model empiris dibangun berdasarkan data yang diperoleh dari percobaan yang telah dirancang sebelumnya. Central composite design diperkenalkan oleh Box dan Wilson pada tahun 1951 yang merupakan suatu rancangan yang terdiri dari rancangan faktorial tingkat dua dengan dua level tertinggi dan terendah ditambah dengan beberapa titik yang memungkinkan untuk meramalkan adanya efek interaksi antar faktor yang dicoba. Kelompok titik tambahan yang pertama disebut starting point yang merupakan matriks bujur sangkar yang diagonal utamanya bernilai ± 2k4, dimana k adalah jumlah faktor yang dioptimasi. Sedangkan kelompok titik tambahan kedua disebut center point yang merupakan kombinasi dari semua titik tengah faktor yang akan dioptimasi. Central composite design banyak digunakan peneliti untuk merancang percobaan optimasi setelah faktor-faktor yang mempunyai pengaruh terhadap hasil akhir yang diinginkan diketahui melalui percobaan berdasarkan rancangan faktorial yang lain Box dan Draper 2007. 3 METODE Ruang lingkup penelitian yang dilakukan meliputi tahap pembuktian keberadaan gen btpac-bd1, persiapan inokulum, optimasi xilosa dan CaCl 2 dengan CCD dan uji coba skala bioreaktor Gambar 3. 9 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan selama 12 bulan mulai bulan Maret 2013 sampai dengan Maret 2014 di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika LAPTIAB, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi BPPT, Puspitek, Serpong, Tangerang Selatan. Bahan Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri rekombinan Bacillus megaterium btpacBD1 yang berasal dari kultur koleksi Laboratorium Teknologi Bioindustri LTB-BPPT. Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah SET buffer, lisozim. NaOH-SDS segar, kalium asetat 5M dingin, larutan PCI phenol: chloroform: iso amyl alcohol, larutan CI chloroform: iso amyl alcohol, larutan isopropanol, etanol 70, DNAse, gel agarosa 1 dan larutan EtBr. Mix PCR yang terdiri dari primer xyl 3 10 M, primer xyl 4 10 M, 10x KAPA Buffer B with Mg 2+ , dNTP, KAPA Tag polymerase, hasil ekstraksi sel dan ddH 2

O. Komposisi media yang terdiri dari MOPS pH 7.0, Tricin pH 7.0,

MgCl 2 .6H 2 O, K 2 SO 4 , FeSO 4 .7 H 2 O, CaCl 2 , MnCl 2 .4H 2 O, NaCl, KCl, NH 4 Cl, K 2 HPO 4 , glukosa, trace element solution, dan vitamin solution. NH4 6Mo 7 O 24 .4H 2 O, H 3 BO 3 , CoCl 2 , CuSO 4 , MnCl 2 , ZnSO 4 , biotin, niacin amida, p- amino benzoat, Ca-panthotenate, pyridoxal HCl, folacid, riboflavin, asam DL- 6,8-thioctic, tiamin diklorida, MgSO 4 .7H 2 O, CaCl 2 .H 2 O, NaCl, yeast ekstrak, Komposisi media terbaik Mikroba rekombinan terkonfirmasi Pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 dengan seleksi dengan marka genetik, ekstraksi plasmid dan PCR Optimasi xilosa dan CaCl 2 dengan metode CCD menggunakan parameter optimasi: aktivitas, kadar protein dan aktivitas spesifik Validasi komposisi media pada skala bioreaktor 10 L Persiapan prekultur dan inokulum Penentuan waktu panen enzim pada skala bioreaktor selama 60 jam Gambar 3. Diagram alir umum penelitian 10 tripton, xilosa, agar, dan tetrasiklin dalam etanol 100, gliserol, garam fisiologis, etanol 95, aquades, larutan asam asetat 20, NaOH 50mM, metanol, penisilin G 0.5 M, pDAB 4 Para Dimetil Amino Benzaldehid, larutan buffer Na – fosfat 0.05 M pH 7 dan larutan Bradford 5x. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Refrigerated Centrifuge [Hitachi CR226], Rotor RIOA2, Cold Microsentrifuge Sorvall, Fresco, [Hettich Zentrifugen-micro 200R], deep freezer -80 ° C, Inlab pH meters USA, Autoclave, Laminar airflow, Inkubator kocok [GFL dan New Brunswick Scientific], Bioreaktor [Biostat], Spectrophotometer, Mastercycler personal, Electrophoresis, Milipore dan alat gelas lain. Prosedur Analisis Data Pembuktian Keberadaan Gen btpac-bd1 Pembuktian keberadaan gen btpac-bd1 bertujuan untuk mengkonfirmasi mikroba yang digunakan pada penelitian merupakan mikroba rekombinan. Tahap yang dilakukan adalah dengan seleksi Bacillus megaterium btpacBD1 rekombinan dengan marka genetik, ekstraksi plasmid pMMbtpac-bd1 dan Polymerase Chain Reaction PCR koloni tunggal B. megaterium btpacBD1. Seleksi Mikroba Rekombinan dengan Marka Genetik Seleksi mikroba rekombinan dilakukan untuk mendapatkan koloni tunggal dari kultur seleksi isolat B. megaterium btpacBD1 rekombinan. Selain itu, koloni tunggal juga dapat digunakan untuk membuat kultur stok dalam gliserol 75 dan inokulum. Isolat diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasi ke dalam 25 mL media LB padat yang ditambahkan 1 tetrasiklin 12.5 mgmL LB-tet padat sebagai media seleksi menggunakan metode cawan kuadran secara aseptis di laminar air flow. Cawan petri ditutup dan diinkubasi pada 37°C selama 24 jam hingga terbentuk koloni tunggal. Komposisi media per liter terdiri dari 5 g NaCl, 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak dan 15 g agar yang dilarutkan dalam air mili-Q pH 7 Yang et al. 2006. Prosedur Deteksi Plasmid Rekombinan pMM btpac-bd1 dengan Ekstraksi Plasmid Voskuil dan Cambliss 1993 dan PCR Tujuan ekstraksi dan PCR adalah untuk mendeteksi keberadaan plasmid rekombinan pMMbtpac-bd1. Proses ekstraksi dilakukan dengan menginokulasi 1 koloni tunggal pada 40 mL LB cair yang ditambahkan 1 tetrasiklin 12.5 mgmL LB-tet cair dengan komposisi media yang hampir sama dengan LB padat, namun tanpa penambahan agar dan diinkubasi pada inkubator kocok dengan agitasi 70 rpm pada suhu 37°C selama 20 – 24 jam hingga Optical Density atau kerapatan sel bakteri OD pada panjang gelombang 578 nm mencapai 0.6 – 0.8. Selanjutnya, kultur disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan endapan disuspensi dengan 100 µL SET buffer yang mengandung 10 11 mg lisozim. Lalu 200 µL campuran diambil dan diinkubasi pada 37°C selama 10 menit. Setelah diinkubasi, campuran ditambahkan 350 µL NaOH-SDS segar dan diresuspensi hingga larutan menjadi jernih. Setelah jernih, campuran ditambahkan 350 µL larutan kalium asetat 5M dingin dan divortex selama 10 detik. Kemudian campuran disentrifugasi pada 13000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya, 200 µL supernatan diambil dan diekstraksi dengan 200 µL larutan PCI phenol:chloroform:isoamylalcohol dengan perbandingan 25:24:1. Campuran divorteks selama 1 menit dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Lalu akan terbentuk 3 fase, 70 µL fase bening diambil dan diekstraksi dengan larutan CI chloroform:isoamylalcohol dengan perbandingan 24:1. Campuran divorteks dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Lalu akan terbentuk 2 fase, 40 µL fase bening diambil dan dipresipitasi dengan 40 µL larutan isopropanol. Kemudian campuran disentrifugasi pada 13000 rpm selama 20 menit. Supernatan dibuang dan endapan yang merupakan DNA plasmid dicuci dengan ethanol 70. Campuran disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan endapan dikeringkan dengan vacuum evaporator selama 10 menit. Setelah endapan kering, DNA plasmid dilarutkan pada 50 µL air mili-Q yang mengandung 20 mgmL DNAse. DNA plasmid hasil ekstraksi lalu di dielektroforesis pada gel agarosa 1 selama 25 menit. Lalu gel direndam pada larutan EtBr selama 10 menit. Gel dibilas dengan aquades dan hasil visualisasi dilihat. Jika terdapat pita tunggal, DNA plasmid hasil ekstraksi akan diuji selanjutnya dengan uji polymerase chain reaction PCR. Hasil ekstraksi plasmid rekombinan selanjutnya di uji PCR menggunakan primer xyl 3 5’-TTA TCC ACC GAA CTA AGT TGC TG-3’ dan primer xyl 4 5’-TGG AGT GGT GAA TCC GTT AG-3’10 M untuk mengamplifikasi gen pac. Komposisi campuran PCR dengan total volume 50 mL mengandung 0.5 µL primer xyl 3 10 M, 0.5 µL primer xyl 4, 5.0 µL 10x KAPA Buffer B with Mg 2+ , 0.5 µL dNTP, 0.2 µL KAPA Tag polymerase, 2,0 µL hasil ekstraksi sel dan 41.3 µL ddH 2 O. Tahapan proses amplifikasi menggunakan mesin Thermal Cycler adalah sebagai berikut: suhu 95°C selama 5 menit Pre-denaturasi, suhu 94°C selama 1 menit denaturasi, suhu 61°C selama 30 detik Annealing penempelan, suhu 72°C selama 2 menit Extension pemanjangan dan suhu 72°C selama 10 menit Final Extension. Proses akan diulang sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 selama 25 menit. Lalu gel direndam pada larutan EtBr selama 10 menit. Gel dibilas dengan aquades dan hasil visualisasi dilihat. Penyiapan Inokulum Penyiapan inokulum dilakukan untuk mengadaptasi sel bakteri agar siap untuk dikultivasi pada media produksi. Seed culture dibuat dengan menginokulasi satu koloni tunggal hasil peremajaan isolat ke 15 mL media LB-tet cair yang diinkubasi pada inkubator kocok dengan agitasi 180 rpm, suhu 37°C sampai OD mencapai 0.6 – 0.8. Lalu 90 mL media LB-tet cair baru diinokulasi dengan 10 mL seed culture. Tahap pengambilan dan pengukuran OD sel dihentikan setelah OD mencapai 0.6 – 0.8. Selanjutnya 10 mL inokulum diambil untuk proses produksi. 12 Penentuan Batas Atas dan Batas Bawah Konsentrasi Xilosa Optimasi konsentrasi xilosa dilakukan karena ekspresi gen pac pada B. megaterium btpacBD1 rekombinan diatur oleh promotor xyl untuk dapat menghasilkan enzim PAc. Penggunaan konsentrasi xilosa yang terlalu tinggi dikhawatirkan dapat membuat membran sel bakteri pecah sehingga perlu ditentukan konsentrasi xilosa yang tepat untuk menghasilkan enzim PAc yang optimal tanpa merusak sel B. megaterium selama proses kultivasi. Batas atas dan batas bawah konsentrasi xilosa X 1 yang digunakan adalah 0.3 dan 0.7. Hasil penelitian Yang et al. 2006 menjelaskan bahwa penambahan xilosa terbaik adalah sebesar 0.5. Komposisi media produksi per liter terdiri dari 12.36 g MOPS pH 7, 1.65 g Trisin pH 7, 0.11g MgCl 2 .6H 2 O, 0.05 g K 2 SO 4 , 0.01 g FeSO 4 .7H 2 O, 0.02 g MnCl 2 .4H 2 O, 2.92 g NaCl, 0.75 g KCl, 0.01 g NH 4 Cl, 0.27 g K 2 HPO 4 dan 4 g glukosa yang dilarutkan dalam air mili-Q pH 7 dan disterilisasi di autoklaf pada suhu 121°C 1 atm selama 15 menit. Setelah steril lalu ditambahkan 0.1 mL trace element solution 10X, 0.1 mL vitamin solution 10X dan 10 mL untuk 6 grup as. amino solution 10X. Tetrasiklin 12.5 mgmL sebanyak 1 ditambahkan sebagai media seleksi. Komposisi trace element solution 10X per 100 mL terdiri dari 3.708 mg NH 4 6Mo7O 24 .4H 2 O, 24.73 mg H 3 BO 3, 7.137 mg CoCl 2 , 2.497 mg CuSO 4, 15.832 mg MnCl 2 dan 2.875 mg ZnSO 4 yang dilarutkan dalam air mili-Q pH 7 dan disterilisasi di autoklaf pada suhu 121°C 1 atm selama 15 menit. Komposisi vitamin solution 10X per 100 mL terdiri dari 6 mg biotin, 20 mg niacin amida, 20 mg p-amino benzoat, 10 mg Ca-panthotenat, 100 mg pyridoxalHCl 20 mg folacid, 50 mg riboflavin, 50 mg as.DL-6,8-thioctic dan 10 mg thiamin diklorida yang dilarutkan dalam air mili-Q pH 7 dan disterilisasi syringe. Enam kelompok asam amino solution per liter terdiri dari 2.5 mg Gly dan 1.25 mg Ser I, 2 mg Val, 1 mg Ile dan 0.5 mg Leu II, 2.5 mg Ala III, 0.4 mg Glu, 0.75 mg Gln, 2.5 mg Arg dan 1.25 mg Pro IV, 1 mg His V, serta 0.25 mg Asn, 0.25 mg Cys, 2.5 mg Lys, 1.25 mg Met, 1.25 mg Thr, 0.75 mg Asn VI yang dilarutkan dalam air mili-Q pH 7 dan disterilisasi pada suhu 121°C 1 atm selama 15 menit. Penentuan Batas Atas dan Batas Bawah Kadar CaCl 2 Batas atas dan batas bawah konsentrasi CaCl 2 X 2 yang digunakan adalah 3.5 mM dan 1.5 mM. Hasil penelitian Yang et al. 2006 menjelaskan bahwa penambahan 2.5 mM CaCl 2 meningkatkan biomassa B. megaterium YYBm1 dengan aktivitas spesifik, 489.9 Ug CDW. Sedangkan penambahan 5 mM dapat mengganggu pertumbuhan biomassa dan aktivitas spesifik yaitu 287.3 Ug CDW. Rancangan untuk Optimasi Media Setelah didapatkan batas atas dan batas bawah untuk konsentrasi xilosa X 1 dan CaCl 2 X 2 Tabel 3. Nilai interval dimasukkan ke pengolahan data software Design Expert 9 Stat Ease Inc, USA dan diperoleh kombinasi lima tingkat konsentrasi xilosa dengan rentang 0.13 s.d 0.87 dengan lima tingkat konsentrasi CaCl 2 dengan rentang 0.64 mM s.d 4.36 mM sebanyak 22 percobaan telah diujicobakan Tabel 2.