BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, pemeriksaan karakteristik, skrining
fitokimia, pembuatan ekstrak, dan uji toksisitas ekstrak daun sirsak terhadap larva Artemia salina Leach.
3.1 Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 18 watt
Hannochs, cawan berdasar rata, botol bersumbat, seperangkat alat penetapan kadar air, tanur, mikroskop Olympus, oven listrik Stork, elektromantel
Boeco, neraca analitik Vibra AJ, dan penangas air.
3.2 Bahan-bahan yang digunakan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun sirsak Annonae muricatae folium , telur Artemia salina Leach ISO, garam laut, ragi
tape, air suling. Bahan-bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analisa yaitu n-heksan destilasi, etilasetat destilasi, etanol
destilasi, asam asetat anhidrida, asam sulfat pekat, kloroform, toluen, timbal II asetat, amil alkohol, metanol, natrium hidroksida, asam klorida pekat, serbuk
magnesium, kloralhidrat, isopropanol, α-naftol, amonia pekat, besi III klorida, iodium, raksa II klorida, kalium iodida, bismut III nitrat, asam nitrat pekat.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan
3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif. Daun sirsak diambil dari dari desa Nagarejo kecamatan Galang kabupaten Deli Serdang
propinsi Sumatera Utara. Sampel yang digunakan adalah daun ke 4 sampai 5 dari pucuk.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat lembaga Ilmu Pengetahuan, Bogor.
3.3.3 Pembuatan Simplisia
Daun sirsak yang telah dikumpulkan, disortasi basah yaitu memisahkan daun sirsak dari bagian lain tumbuhan daun sirsak yang terikut, kotoran-kotoran
atau bahan asing lainnya, kemudian daun sirsak yang telah terkumpul dicuci untuk menghilangkan debu yang melekat. Pencucian dilakukan dengan air kran yang
mengalir, ditiriskan, dikeringkan dengan cara diangin-anginkan diudara terbuka terlindung dari sinar matahari langsung lalu ditimbang. Kemudian dimasukkan
ke dalam lemari pengering dengan suhu 40-50
o
C. Proses pengeringan dilakukan sampai daun sirsak mudah diremukkan. Simplisia yang telah kering disortasi
kering yaitu memisahkan benda-benda asing seperti pengotoran-pengotoran lain yang terjadi selama pengeringan. Setelah disortasi, ditimbang kembali. Simplisia
selanjutnya diserbuk dengan menggunakan blender. Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam kantung plastik kemudian disimpan dalam wadah tertutup, pada suhu
kamar, dan terlindung dari cahaya.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.5 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.5.1 Larutan Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.2 Larutan Pereaksi Natrum Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.3 Larutan pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.4 Larutan pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain dilarutkan 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling. Kemudian
keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.5 Larutan Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam
50ml air suling. Kemudian kedua larutan dicampurkan sama banyak dan
Universitas Sumatera Utara
didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.6 Larutan Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.
3.5.7 Larutan Pereaksi Liebermann- Burchard
Sebanyak 19 bagian asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat Franswoth, 1966.
3.5.8 Larutan Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh volume 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.9 Air Kloroform
Sebanyak 2,5 ml kloroform dikocok dengan 900 ml air suling, cukupkan dengan air suling hingga 1000 ml Ditjen POM, 1995.
3.5.10 Larutan Kloralhidrat
Sebanyak 50 gram kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1979.
3.5.11 Larutan Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 gram timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.
3.5.12 Pereaksi Asam Nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga volume 100 ml Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.6 Karakterisasi Simplisia
Karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna, bau dan rasa daun sirsak.
3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan
kloralhidrat dan ditutupi dengan cover glass kaca penutup kemudian dilihat dibawah mikroskop dan juga dilakukan pemeriksaan mikroskopik pada bagian
penampang melintang daun sirsak sebagai pedoman untuk melihat fragmen yang terdapat dalam daun sirsak.
3.6.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen Cara kerja :
1. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Kemudian toluen didinginkan selama 30
menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
Universitas Sumatera Utara
2. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15
menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetesan perdetik, sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan
hingga 4 tetes perdetik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung
penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.
3.6.4 Penetapan Kadar Sari Yang larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform dalam labu bersumbat sambil berkali-kali
dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan penguap berdasar rata
yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar
sari larut dalam air dihitung dengan persen terhadap simplisia Ditjen POM, 1989.
3.6.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok selama 6
jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol 96, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai
Universitas Sumatera Utara
kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap simplisia Ditjen POM, 1989.
3.6.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah dihaluskan dan ditimbang seksama dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500 - 600
°C sampai putih, ini menunjukkan bahwa karbon tidak ada lagi kemudian didinginkan di desikator dan ditimbang sampai diperoleh bobot
tetap. Kadar abu dihitung terhadap simplisia WHO, 1998.
3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan, kemudian diidinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam
asam dihitung terhadap simplisia. WHO, 1998.
3.7 Skrining fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa gologan alkaloida, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, tanin dan
steroidatriterpenoida Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
3.7.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit.
Dinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut :
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Bouchardat c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorf Alkaloid dikatakan positif apabila terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit
dua dari tiga percobaan di atas. 3.7.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan saring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat
ditambahkan serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok kuat dan dibiarkan memisah. Bila terdapat flavonoida ditunjukkan
dengan timbulnya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
3.7.3 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok selama 10 detik. Jika
terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin.
3.7.4 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
Universitas Sumatera Utara
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
3.7.5 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 96 dengan air 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam, didinginkan
dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal asetat 0,4 M, dikocok, diamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran
isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Sebanyak 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi
selanjutnya, diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui
dinding tabung, terbentuknya cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikon.
3.7.6 Pemeriksaan Antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, lalu didinginkan, ditambahkan 10 ml benzena, dikocok,
didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, diamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon.
3.7.7 Pemeriksaan Steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya
ditambahkan 2 tetes Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau
Universitas Sumatera Utara
merah berubah menjadi ungu atau biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida.
3.8 Pembuatan Ekstrak
Cara kerja : Sebanyak 200 g daun sirsak yang telah diserbukkan dimasukkan ke dalam
bejana tertutup, lalu dibasahi dengan cairan penyari selama 3 jam. Kemudian masa dimasukkan ke dalam perkolator, lalu cairan penyari n-heksan dituang
secukupnya sampai terdapat selapis larutan penyari diatas serbuk simplisia, mulut perkolator ditutup dengan aluminium foil dan plastik dan dibiarkan selama 24
jam. Setelah 24 jam keran perkolator dibuka dan cairan perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per detik dan ditampung dalam botol. Perkolasi
dihentikan setelah tetesan terakhir perkolat tidak berwarna lagi dan sebanyak 500 mg cairan perkolat diuapkan di atas penangas air tidak meninggalkan sisa.
Perkolat dipekatkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40
C, kemudian dikeringkan dengan menggunakan alat freeze dryer lalu ampas dikeluarkan dari alat perkolator dan dikeringkan
dengan cara diangin-anginkan selama 1 jam. Ampas yang telah dikeringkan, disari kembali dengan cairan penyari etilasetat. Ampas dari perkolasi etilasetat
dikeringkan lalu disari kembali dengan cairan penyari etanol 96. Setiap perkolasi dilakukan dengan cara yang sama seperti perkolasi menggunakan n-
heksan. Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 35.
Universitas Sumatera Utara
3.9 Uji Sitotoksisitas
Kategori