BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat – alat
1. Gelas ukur
50 ml pyrex
2. Gelas Beaker
250 ml pyrex
3. Gelas Erlenmeyer
250 ml pyrex
4. Corong pisah
500 ml Durant
5. Kolom kromatografi
2040 Pyrex
6. Tabung reaksi
7. Plat tetes
8. Neraca Analitis
Mettler PM 480 9.
Alat pengering Memmers
10. Rotari evaporator
Buchi B-480 11.
Labu alas 500 ml
Pyrex 12.
Alat pengukut titik lebur Fisher-Jhons
13. Statif dan klem
14. Lampu UV
254 nm 15.
Spatula 16.
Batang pengaduk 17.
Pipet tetes 18.
Botol vial
Universitas Sumatera Utara
19. Bejana Kromatografi Lapis Tipis
20. Spektrofotometer FT-IR
Jasco 21.
Spektrofotometer UV-Visible 22.
Kertas Saring 23.
Plat KLT
3.2 Bahan-Bahan
1. Kulit buah alpukat Persea gratissima Gaertn
2. Metanol
p.a 3.
n-heksana teknis
4. Etil asetat
teknis 5.
Akuades 6.
Silika gel 60 F
254
7. Pereaksi Feri Klorida 1
8. Pereaksi Natrium Hidroksida 10
9. NaOH 10 10. Kloroform
teknis
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Universitas Sumatera Utara
Sampel yang diteliti adalah kulit buah alpukat yang diperoleh dari daerah brastagi, kabupaten tanah karo, Sumatera Utara . kulit buah alpukat dikeringkan di udara terbuka , lalu
dihaluskan sampai diperoleh serbuk kulit buah alpukat sebanyak 500 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Tumbuhan Manggis
Serbuk kulit batang tumbuhan manggis diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1.Uji busa
2.Skrining fitokimia 3.Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1. Uji Busa
Ekstrak metanol kulit buah alpukat sebanyak 30 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi . Kemudian ditambah 10 ml akuades dan dipanaskan pada penangas air . Lalu dikocok–kocok
dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit . Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam kulit batang tumbuhan manggis tidak terdapat senyawa glikosida .
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Universitas Sumatera Utara
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit buah alpukat, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk kulit buah alpukat diekstraksi maserasi dengan metanol,
lalu disaring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H
2
SO
4 p
, NaOH 10 , FeCl
3
5 dan Mg – HCl. Dan terjadilah perubahan warna pada tiap penambahan pereaksi yang
menunjukkan adanya senyawa flavonoida .
3.3.2.3.Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
. Fasa gerak yang digunakan adalah kloroform 100 dan campuran kloroform : metanol dengan perbandingan 90 : 10vv ; 80 : 20vv; 70:30vv;
60:40vv;50:50vv. Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak kloroform ke dalam bejana kromatografi ,kemudian dijenuhkan .Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana
yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga
Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksan : etil asetat 90:10vv ; 80:20vv ;70 :30vv ;60:40vv ;50:50vv. Dari hasil analisis KLT
menunjukkan bahwa di
dalam kulit buah alpukat terkandung senyawa flavonoida . Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak kloroform : metanol 70:30vv.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak Kulit Buah Alpukat
Serbuk kulit buah alpukat ditimbang sebanyak 500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua sampel terendam oleh pelarut dan dibiarkan
selama 72 jam dan sesekali diaduk. maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna coklat. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol
yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan
alat rotarievaporator pada suhu 60 C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian
diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan lapisan metanol.
3.3.4.Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol kulit buah alpukat yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak
adalah campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 70 : 30 vv . Prosedur isolasi senyawa flavonoida dengan kromatografi kolom :
Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom
kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 4 g ekstrak etil asetat kulit buah alpukat ke dalam kolom
kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak kloroform : metanol 70 : 30 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang
keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas . Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 15 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan
Universitas Sumatera Utara
harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoida dan diuapkan sampai pelarutnya habis sehingga terbentuk kristal.
3.3.5. Pemurnian
Amorf yang diperoleh dari fraksi yang terbanyak yaitu pada fraksi 51-120 dilakukan pemurnian amorf untuk memastikan kemurniannya.
Prosedur; Amorf pada fraksi 51-120 dilarutkan dengan metanol, kemudian ditotolkan pada plat KLT preparatif, kemudian dimasukkan kedalam chamber yang berisi 200 ml eluent. Setelah noda
naik kemudian diangkat dan dilihat warnanya dibawah sinar lampu UV, kemudian ditandai dengan pensil sesuai dengan perbedaan warna tersebut.setelah itu dikerok menurut warna
masing-masing , kemudian dilarutkan kembali dan diperoleh senyawa yang murni.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak kloroform : metanol 70:30 vv. Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis :
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi , lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada plat KLT .Dimasukkan plat KLT tersebut ke
dalam bejana kromatografi yang telah jenuh . Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda , plat KLT dikeluarkan dari bejana , dikeringkan ,dan
difikasasi dengan menggunakan pereaksi Feri Klorida dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida . Perlakuan yang sama dilakukan ,dan
Universitas Sumatera Utara
difikasasi dengan Natrium Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet
Lampiran 3.
3.3.9. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
3.3.9.1. Analisis Kristal Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di PTKI Medan Lampiran 4
3.3.9.2. Analisis Kristal Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis dengan Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium kimia beacukai Belawan..
Lampiran 5.
Universitas Sumatera Utara
3.4. Bagan Skrining Fitokimia
←dimaserasi dengan metanol
10 g serbuk kulit buah alpukat
Universitas Sumatera Utara
← disaring
← ditambah pereaksi ← ditambah pereaksi ← ditambah pereaksi ← ditambah pereaksi FeCl
3
1 NaOH 10 Mg-HCl H
2
SO
4 p
← diamati ← diamati ← diamati ← diamati
hasil hasil
hasil hasil
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak methanol dari kulit buah alpukat dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang
dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoid yakni; H
2
SO
4 p
, NaOH 10 , FeCl
3
5 dan Mg – HCl menunjukkan bahwa di dalam kulit buah alpukat yang mengandung senyawa
flavonoida. Dari hasil kromatografi lapis tipis dengan menggunakan adsorben silika gel 60 G, dapat
diketahui bahwa pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari kulit batang tumbuhan manggis adalah kloroform : metanol pada perbandingan 70:30vv.
Dari hasil isolasi kulit buah alpukat diperoleh senyawa berwarna merah kecoklatan berbentuk amorf sebanyak 357 mg.
Dari hasil analisis Spektrofotometer ultra violet –visible UV – Visible dengan pelarut methanol memberikan panjang gelombang maksimum λ maks 347 nm.
Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi menunjukkan pita serapan sebagai berikut :
Universitas Sumatera Utara