Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Rancangan Percobaan Analisis Data

III. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini telah dilaksanakan selama bulan Oktober – Desember 2009. Untuk pemeliharaan dan analisis Cu pada air dan hati ikan uji dilakukan di Laboratorium Lingkungan Akuakultur, sedangkan untuk analisis darah dan histopatologi dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium, selang, pH- meter, termometer, mikroskop, DO-meter, blower, stoples, dan timbangan elektrik. Bahan-bahan yang diperlukan adalah ikan nila gift ukuran 10-12 gram, agen tembaga CuSO 4 .5H 2 O, NaOH, CH 3 COOH, air ketapang, kapur pertanian dan pakan ikan.

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian ini terdiri dari 2 bagian, yaitu bagian pertama berupa penelitian pendahuluan dengan 2 tahapan yaitu uji toksisitas Cu dan uji nilai pH; dan bagian kedua berupa penelitian inti yaitu uji pengaruh toksisitas Cu pada berbagai pH, analisis darah, pengukuran tingkat konsumsi oksigen dan uji histopatologi. 3.3.1 Penelitian Pendahuluan 3.3.1.1 Uji Toksisitas Cu Uji toksisitas Cu bertujuan untuk menentukan konsentrasi CuSO 4 .5H 2 O sebagai bahan uji yang akan digunakan untuk mencemari media pemeliharaan dengan Cu sebagai bahan aktif sebanyak 0,1 mgL; 0,3 mgL; 0,5 mgL, 0,7 mgL dan 0,9 mgL. Nilai konsentrasi yang dipakai berdasarkan nilai LC 50 Cu pada ikan air tawar. Apabila pada uji ini tidak diperoleh hasil yang diharapkan pada batas ambang bawah dan batas ambang atas dari konsentrasi Cu yang digunakan, maka nilai konsentrasi Cu yang dipakai akan diturunkan atau ditingkatkan. Langkah yang dilakukan adalah membagi sebanyak 150 ekor hewan uji menjadi 5 perlakuan dengan 3 ulangan masing-masing terdiri dari 10 ekor. Perlakuan diberi Cu dengan konsentrasi yang telah ditetapkan berdasarkan LC 50 ikan-ikan air tawar yang biasanya berkisar antara 0,02 – 1,0 mgliter Moore 1991. Konsentrasi Cu yang akan digunakan adalah 0,1 mgL, 0,3 mgL, 0,5 mgL, 0,7 mgL dan 0,9 mgL, yang diuji selama 96 jam. Kemudian akan digunakan satu konsentrasi Cu yang telah memberikan pengaruh terhadap ikan uji. Indikator pengaruh yang digunakan adalah respon aktif ikan terhadap pakan yang diberikan, kelangsungan hidup dan tidak terjadi perubahan warna kulit ikan dari warna yang cerah menjadi lebih gelap hitam.

3.3.1.2 Uji Nilai pH

Uji nilai pH bertujuan untuk mengetahui konsentrasi asam asetat yang digunakan untuk menurunkan pH menjadi 5 dan 6 serta konsentrasi NaOH untuk menaikkan pH menjadi 7 dan 8. Tahapan ini juga digunakan untuk mengetahui pengaruh perubahan pH terhadap ketahanan tubuh ikan uji. Tahap uji ini menggunakan ikan sebanyak 120 ekor dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan, ikan ditempatkan sebanyak 10 ekor per akuarium yang masing-masing memiliki nilai pH 5±0,5; 6±0,5; 7±0,5; dan 8±0,5 selama 96 jam. Untuk mengatur nilai pH agar sesuai dengan yang diinginkan digunakan CH 3 COOH dan NaOH, namun terlebih dahulu air yang akan digunakan dilakukan penstabilan kesadahannya sehingga lebih mudah dalam pengaturan nilai pH. Peningkatan alkalinitas air dilakukan dengan menggunakan rebusan air ketapang sebanyak 10 mlL air, yang ditambahkan ke dalam media pemeliharaan. Untuk meningkatkan kesadahan dilakukan dengan merendam kapur dalam air yang akan digunakan sebagai media pemeliharaan. Air yang telah diberi perlakuan air keran + air ketapang + asam asetat, dan air keran + air kapur + NaOH didiamkan selama 2 hari sebelum dimasukkan ikan. Ikan yang akan diberi perlakuan terlebih dahulu diadaptasikan pada pH 6 selama 2 hari sebelum dimasukkan pada wadah perlakuan yang memiliki nilai pH 5, sedangkan perlakuan pH 8 terlebih dahulu diadaptasikan pada pH 7. Apabila selama waktu perlakuan berlangsung terjadi fluktuasi pH maka akan ditambahkan NaOH untuk meningkatkan pH dan CH 3 COOH untuk menurunkan pH. Nilai pH air normal adalah 6,7 sehingga untuk menurunkan nilai pH digunakan CH 3 COOH 1 dan untuk meningkatkan nilai pH digunakan NaOH 1. CH 3 COOH 1 sebanyak ±1ml dapat menurunkan nilai pH sebesar ±0,1, sedangkan NaOH 1 sebanyak ±2 ml dapat meningkatkan pH sebesar ±0,1. 3.3.2 Penelitian Inti 3.3.2.1 Uji Pengaruh Uji pengaruh dilakukan tanpa pergantian air. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui toksisitas tembaga pada berbagai pH terhadap tingkat konsumsi oksigen dan respon hematologi ikan nila gift. Pada penelitian ini digunakan empat nilai pH dengan konsentrasi tembaga dari hasil uji toksisitas yang menyebabkan letalitas terendah dan laju pertumbuhan harian tertinggi pada ikan nila gift. Pemberian tembaga pada perlakuan hanya dilakukan sekali yaitu pada awal penelitian. Pada awal dan akhir penelitian juga akan dilakukan analisis air media pemeliharaan dengan metode AAS untuk mengukur kandungan Cu yang terdapat pada air media pemeliharaan dan hati ikan uji. Pengukuran pH air dilakukan setiap hari, untuk menjaga agar nilai pH yang digunakan tetap sesuai dengan perlakuan. Variabel yang diukur meliputi : tingkat konsumsi oksigen, dan respon hematologi jumlah sel darah merah, jumlah sel darah putih, kadar hemoglobin, dan kadar hematokrit serta diferensiasi leukosit, kerusakan jaringan, dan kelangsungan hidup. Pada uji pengaruh ini, digunakan ikan sebanyak 240 ekor dengan masing- masing perlakuan sebanyak 10 ekor dengan volume air 25 L pada 4 perlakuan, 4 kontrol dan 3 kali ulangan sehingga terbentuk 24 unit percobaan.

3.3.2.2 Tingkat Konsumsi Oksigen

Tingkat konsumsi oksigen diukur pada akhir penelitian dengan menghitung rasio oksigen terlarut pada awal dan akhir pengamatan. Botol respirasi diisi air sampai penuh, selanjutnya diaerasi dengan kuat bubling sehingga kandungan oksigennya bertambah. Setelah diaerasi air media dibiarkan selama setengah jam, kemudian dilakukan pengukuran oksigen terlarut sebagai DO awal. Ikan ditimbang kemudian dimasukkan kedalam botol respirasi dan ditutup selama 1 jam untuk dihitung DO akhir, maka akan didapatkan tingkat konsumsi oksigen dengan menggunakan rumus Liao dan Huang 1975. TKO = {DOawal – DoakhirW x t} x V Keterangan : TKO = tingkat konsumsi oksigen mg O 2 DOawal = oksigen terlarut pada awal pengamatan mgL gr tubuh jam DOakhir = oksigen terlarut pada akhir pengamatan mgL W = berat ikan uji gr t = periode pengamatan jam V = volume air dalam respirometer L

3.3.2.3 Prosedur Pengukuran Kualitas Air

Pengukuran kualitas air terdiri dari CO 2 , DO, NH 3 , H 2 S, pH dan suhu air. Pengukuran pH dan suhu dilakukan setiap hari, dan pengaturan pH untuk mencapai nilai pH perlakuan dilakukan setiap 8 jam. Pengukuran CO 2 dan DO dilakukan pada awal penelitian sebelum ikan dimasukkan, setelah ikan dimasukkan, dan pada akhir penelitian saat diperoleh kematian 50 pada salah satu perlakuan. Konsentrasi H 2 S dan NH 3 dalam media pemeliharaan diukur pada akhir penelitian.

3.3.2.4 Tahap Analisis Darah

1 Penghitungan jumlah sel darah merah SDM Prosedur pengamatan dan penghitungan jumlah SDM pada penelitian ini berdasarkan Blaxhall dan Daisley 1973. Darah diambil dari ikan dengan menggunakan injeksi yang berisi cairan antikoagulan untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan kedalam ependorf, kemudian darah dihisap menggunakan pipet pencampur sampai dengan skala 0,5 dan ditambahkan larutan Hayems yang dihisap dengan pipet yang sama hingga mencapai skala 101. Setelah itu, pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang dan tetesan berikutnya diteteskan kedalam hemositometer haemocytometer dan ditutup dengan kaca penutup. Penghitungan dilakukan pada 5 kotak kecil yaitu pada sudut kiri atas, sudut kanan atas, sudut kiri bawah, sudut kanan bawah dan pada bagian tengah. Jumlah sel darah merah yang terhitung dikonversikan dengan rumus : Jumlah sel darah merah = ∑ sel darah merah terhitung x 10 4 selmm 3 . 2 Penghitungan jumlah sel darah putih SDP Prosedur pengamatan dan penghitungan jumlah SDP dilakukan berdasarkan Blaxhall dan Daisley 1973. Metode pengambilan darahnya sama dengan metode pengambilan darah merah. Darah dihisap dengan pipet pencampur sampai dengan skala 11. Jumlah sel darah putih yang terhitung dikonversikan dengan rumus : Jumlah sel darah putih = ∑ sel darah putih terhitung x 50 selmm 3 3 Pengukuran kadar hematokrit Prosedur pengamatan dan penghitungan kadar hematokrit dilakukan menurut Anderson dan Swicki 1993. Menggunakan Microhematocrit method, darah dimasukkan kedalam tabung mikrohematokrit sampai 45 bagian. Kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan crestaseal. Darah disentrifuge selama 5 menit. Setelah itu akan terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan plasma yang jernih di bagian atas, kemudian lapisan putih abu-abu buffy coat yang merupakan trombosit dan leukosit dan lapisan eritrosit yang berwarna merah. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume eritrosit dari darah dengan menggunakan alat ukur panjang mistar dan dinyatakan dalam persentase Ht. 4 Kadar Hemoglobin Hb Pengukuran kadar haemoglobin pada prinsipnya adalah mengkonversikan haemoglobin dalam darah ke dalam bentuk asam hematin oleh asam klorida. Mula-mula darah diisap menggunakan pipet sahli hingga skala 20 mm 3 . Kemudian dipindahkan ke dalam tabung Hb yang berisi HCl 0,1 N sampai skala 10 garis kuning. Didiamkan selama 3–5 menit agar Hb bereaksi dengan HCl membentuk asam hematin, kemudian diaduk dan ditambahkan aquadestila sedikit demi sedikit hingga warnanya sama dengan standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaan larutan yang dikocok dengan skala lajur g yang menunjukkan banyaknya Hb dalam gram setiap 100 ml darah dan dinyatakan dalam persentase Hb. 5 Diferensiasi Leukosit Satu tetes darah diteteskan di atas gelas objek yang bersih. Dengan menggunakan gelas objek yang lain darah disinggungkan sehingga antara kedua objek gelas tersebut membentuk sudut ± 30°. Setelah itu darah didorong ke arah depan dengan tidak mengubah sudut kedua objek gelas tersebut. Sediaan darah yang tipis setelah dikeringanginkan difiksasi selama ± 5 menit. Sediaan yang telah difiksasi kemudian diwarnai dengan zat warna Giemsa selama ± 30 menit. Sediaan diangkat dan kelebihan zat warna dibilas dengan air kran. Kemudian dikeringanginkan dan siap untuk diamati.

3.3.2.5 Uji Histopatologi

Pengamatan biota ikan yang terkena dampak limbah, dilakukan pengamatan dengan menggunakan metode mikroteknik, yaitu dengan cara membuat preparat histologis. Preparat histologis yang dibuat adalah insang, kulit dan ginjal ikan. Prosedur dalam pembuatan preparat histologis adalah: ikan dibedah dan diambil bagian insang, kulit dan ginjalnya, kemudian diawetkan dengan formalin 4 selama 24 jam dan difiksasi dengan alkohol 70 selama 24 jam. Setelah itu dimasukkan ke dalam alkohol 80, 90, 95 , absolut i dan ii, larutan alkohol : xylol 1:1, xylol I dan II masing-masing selama 1 jam. Infiltrasi parafin dalam oven 60ºC, xylol:parafin 1:1, Parafin I dan II masing-masing selama 1 jam. Kemudian sampel ditanam dalam cetakan dan dibiarkan mengeras membentuk blok yang kemudian ditempel pada blok kayu holder, lalu sampel dipotong dengan microtome dengan ketebalan 6-10 mikron. Potongan ditempel pada gelas objek yang sebelumnya telah diolesi dengan glycerin albumin. Sampel dikeringkan pada inkubator 40ºC selama 24 jam lalu diwarnai dengan HE. Proses pewarnaan dengan menggunakan hemotoxylin dan eosin dengan langkah sebagai berikut : deparafinasi dengan xylol I dan II masing-masing 2 menit, lalu dimasukkan ke dalam alkohol absolut, 96 dan 90 masing-masing selama 2 menit. Kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 80 dan 70 masing- masing selama 20 detik. Dicuci dengan air mengalir lebih kurang 2 menit dan dimasukkan ke dalam haemotoxylin selama 4 menit lalu dicuci lagi dengan air mengalir sampai jernih. Dimasukkan ke dalam eosin selama 1,5 menit dan dicuci kembali dengan air mengalir sampai jernih. Direndam dengan alkohol 70 , 89, 90, absolute, xylol i dan ii masing-masing 2 menit. Setelah sampel siap, ditutup dengan cover glass yang sudah ditetesi dengan entelan neu dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40 º C selama 24 jam, kemudian diamati di bawah mikroskop.

3.4 Rancangan Percobaan

Perlakuan yang diterapkan adalah perbedaan nilai pH terhadap toksisitas tembaga pada media percobaan untuk mengetahui tingkat konsumsi oksigen TKO dan respon hematologi ikan nila gift. Percobaan dirancang mengikuti Rancangan Acak Lengkap, dengan model percobaan sebagai berikut Steel and Torrie 1982 : Yij = μ + τi + έij Yij = Ulangan ke-j dari perlakuan ke-i μ = Nilai tengah τi = Pengaruh perlakuan ke-i έij = galat Sebanyak 240 individu ikan nila gift berukuran 10-12 gram dibagi dalam 4 perlakuan, 4 kontrol, dan masing-masing terdiri dari 3 ulangan sehingga terbentuk 24 unit percobaan, yaitu : K 1 K = kontrol 1 dengan kisaran nilai pH 5±0,5 tanpa Cu 2 K = kontrol 2 dengan kisaran nilai pH 6±0,5 tanpa Cu 3 K = kontrol 3 dengan kisaran nilai pH 7±0,5 tanpa Cu 4 P = kontrol 4 dengan kisaran nilai pH 8±0,5 tanpa Cu 1 P = perlakuan 1 dengan kisaran nilai pH 5±0,5 + Cu 0,3 mgL 2 P = perlakuan 2 dengan kisaran nilai pH 6±0,5 + Cu 0,3 mgL 3 P = perlakuan 3 dengan kisaran nilai pH 7±0,5 + Cu 0,3 mgL 4 = perlakuan 4 dengan kisaran nilai pH 8±0,5 + Cu 0,3 mgL

3.5 Analisis Data

Parameter utama dalam penelitian ini adalah konsumsi oksigen dan respon hematologi, sedangkan parameter pendukungnya adalah kelangsungan hidup, histopatologi jaringan dan kualitas air berupa pH, suhu, CO 2 , DO, H 2 Untuk mengetahui pengaruh Cu pada berbagai pH terhadap konsumsi oksigen, kadar hematokrit, kadar hemoglobin, jumlah eritrosit, jumlah leukosit, dan diferensiasi leukosit pada ikan nila gift, maka data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis ragam anova. Apabila terdapat pengaruh yang nyata maka dilanjutkan dengan uji BNT Steel dan Torrie 1982 dengan tingkat kepercayaan 95. Uji beda dilakukan dengan menggunakan program Microsoft Exel 2007 dan SPSS 15.0. Parameter pendukung dianalisis dengan statistik deskriptif menggunakan tabel, grafik, dan gambar. S dan TAN.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Uji Pendahuluan 4.1.1 Toksisitas Cu Dari uji yang dilakukan pada lima konsentrasi Cu yang berbeda yaitu 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; dan 0,9 mgL, diperoleh bahwa pada konsentrasi Cu 0,3 mgL menghasilkan tingkat kelulusan hidup tertinggi Tabel 1 dengan pengaruh terkecil pada ikan yaitu nafsu makan ikan tetap baik, yang ditandai dengan jumlah pakan yang tersisa hanya sedikit dan respon yang baik ketika pakan diberikan, serta tingkat stres rendah yang dapat dilihat dari perubahan warna kulit ikan nila. Dalam kondisi stres ikan nila akan menunjukkan perubahan warna kulit dari warna yang cerah menjadi lebih gelap. Konsentrasi Cu 0,3 mgL ini digunakan pada penelitian selanjutnya uji pengaruh. Tabel 1 Kelangsungan hidup ikan nila pada uji toksisitas Cu dengan konsentrasi yang berbeda Konsentrasi mgL Jumlah ikan ekor Kelangsungan hidup jam 0 24 48 72 96 0,1 10 100 100 100 100 100 0,3 10 100 100 100 100 90 0,5 10 100 100 100 90 80 0,7 10 100 100 100 90 70 0,9 10 100 100 90 80 50

4.1.2 Nilai pH

Nilai pH cenderung kembali ke nilai pH air normal dalam jangka waktu ± 8 jam. Untuk menurunkan pH 0,1 dibutuhkan CH 3 COOH sebanyak 1 mL, sedangkan untuk menaikkan pH 0,1 membutuhkan NaOH sebanyak 2 mL. Dari uji nilai pH yang dilakukan selama 96 jam, diperoleh tingkat kelangsungan hidup pada keempat nilai pH 5,6,7 dan 8 adalah 100, hal ini berarti bahwa keempat nilai pH ini aman bagi hidup ikan, sehingga keempat nilai pH ini digunakan dalam penelitian lanjutan.