Desain Penelitian : Definisi Operasional Analisis Data

BAB 3 METODE PENELITIAN

Penelitian ini dirancang untuk melihat efek ekstrak sea cucumber terhadap Enterococcus faecialis. Pada penelitian ini ditetapkan 1 satu kelompok kontrol dan 1satu kelompok perlakuan dengan masing-masing konsentrasi dari Sea Cucumber Stichopus variegatus. Bakteri yang digunakan, berasal dari sediaan yang didapat dari laboratorium Biologi Oral FKG Universitas Indonesia UI.

3.1 Desain Penelitian :

Eksperimental Laboratorium Komparatif: Post Test Group Only Desain 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2.1 Tempat Penelitian : 1.Laboratorium Pusat Penelitian FMIPA USU 2.Laboratorium Biologi Oral FKG Universitas Indonesia UI

3.2.2 Waktu Penelitian : 6 bulan

3.3 Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.3.1 Sampel penelitian : Suspensi Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah diisolasi dan dibiakkan dengan media Mueller Hinton Agar.

3.3.2 Besar Sampel :

Penelitian eksperimen dengan rancangan acak kelompok, berdasarkan jumlah minimal yang ditetapkan rumus Federer 1995 cit Yuniarti, 2008, secara sederhana dirumuskan: t-1 n-1 ≥ 15 . . 4-1 n-1 ≥ 15n ≥ 6,3 …. Keterangan : t = banyaknya kelompok perlakuan n = jumlah replikasi. Besar sampel yang dipakai pada setiap kelompok perlakuan pada penelitian ini digenapkan menjadi 7 spesimen per kelompok. Penelitian ini membagi kelompok perlakuan menjadi dua kelompok: ⇒ Kelompok I : Sea Cucumber Stichopus variegatus dengan berbagai konsentrasi dengan Enterococcus faecialis sebagai kelompok Uji. ⇒ Kelompok II : Enterococcus faecialis dengan pemberian bahan coba calsium hidroksida sebagai kelompok kontrol positif. 3.4 Variabel Penelitian 3.4.1 Variabel bebas Sea Cucumber Stichopus variegatus dalam berbagai konsentrasi

3.4.2 Variabel Tergantung

Pertumbuhan bakteri Enterococcus faeacalis pada media MHA → MTT Assay.

3.4.3 Variabel terkendali

 Media pertumbuhan Mueller Hinton Agar  Suhu inkubasi 37  Waktu pembiakan Enterococcus faecalis 24 jam C  Sterilisasi alat, bahan coba dan media  Teknik pengisolasian dan pengkulturan  Jumlah bahan coba yang diteteskan ke media  Waktu pengamatan 4 jam, 6 jam, 8 jam dan 24 jam  Keterampilan operator

3.4.4 Variabel tidak terkendali

 Cara penyimpanan bahan coba sebelum perlakuan penelitian  Waktu dan suhu saat pengiriman dari bahan coba  Kandungan bahan lain yang terdapat dalam Sea Cucumber Stichopus variegatus

3.5 Definisi Operasional

Definisi operasional, cara ukur, hasil ukur, dan alat ukur dari masing-masing variabel penelitian dapat dijelaskan pada Tabel 3.1. Tabel 3.1. DEFINISI OPERASIONAL, CARA, HASIL, DAN ALAT UKUR DARI VARIABEL BEBAS DAN TERGANTUNG DARI PENELITIAN No. Variabel Definisi Operasional Cara Ukur Skala Pengukuran Alat Ukur 1. Variabel bebas Sea Cucumber dalam berbagai konsentrasi Konsentrasi yang didapat yang efektif yang dapat digunakan sebagaibahan alternatif Menggunakan pengenceran pada bahan coba dengan mengunkan rumus V1.C1=V2.C2 Rasio Mikropipet Waktu pertumbuhan bakteri Waktu yang terlihat proses petumbuhan bakteri berdasarkan 4 fase Ordinal Waktu 2. Variabel tergantung Enterococcus Faecialis Kemampuan bahan coba dalam membunuh bakteri dan dapat digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar Nominal MTT Assay

3.6 Alat dan Bahan Penelitian

Material  Sea Cucumber Stichopus variegatus dengan berbagai konsentrasi  Suspensi Enterococcus faecalis  Media Mueller Hinton Agar Difco, USA

3.6.1 Alat

- Candle jar Sanyo, Japan - Electronic balance Ohyo JP2 6000, Japan - Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan - Vorteks Iwaki TM-100, Japan - Autoclave Tomy, Japan - Mikropipet dan tips Gilson, France - Tabung gas CO2 Japan - Tabung reaksi dan rak - Petri dish - Lampu spiritus, ose, kapas - Kabin cabinet

3.6.2 Bahan

 Enterococcus faecalis dari sediaan  Ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus  Aquadest 3.7 Prosedur Penelitian 3.7.1 Pembuatan ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus Sea Cucumber Stichopus variegatus sebanyak 2kg dibersihkan dan dikeringkan selama ± 3 hari. Tujuannya adalah agar kadar air pada Stichopus variegatus dapat hilang dan membantu mendapatkan ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus yang terbaik. Setelah 3 hari Sea Cucumber Stichopus variegatus yang kering direndam di dalam metanol selama ± 3 hari pada suhu 37 C. Setelah 3 hari didapat endapan larutan tersebut. Endapan larutan tersebut kemudian di rotari selama ± 1 hari. Setelah dilakukan rotari 1 hari maka akan didapati ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus dalam bentuk pasta. Gambar 3.1. Sea Cucumber Gambar 3.2. Ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus Stichopus variegatus Gambar 3.3. Ekstrak Sea Cucumber Gambar 3.4. Alat stal rotari Stichopus variegatus pasta

3.7.2 Pembuatan media bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Mueller Hinton Agar, sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlPetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM suhu 121°C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.

3.7.3 Pembiakan spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO2. Enterococcus faecalis yang digunakan adalah spesimen stem-cell Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakkan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standard 0,6 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10 6 CFUml. BHI Brain Heart Infusion Broth steril diambil di dalam kulkas dan dikeluarkan dan dibiarkan di dalam ruangan. Hidupkan bunsen lalu panaskan ose agar ose dapat steril, panaskan ose sampai membara agar ose steril. Setelah itu Enterococcus faecalis diambil dari BHI Brain Heart Infusion Broth dan pada saat dibuka harus didekat dengan bunsen agar bakteri Enterococcus faecalis tidak terkontaminasi. Setelah itu diinkubator dalam suhu 37 o C selama 24 jam . Lalu diukur pada microplate reader dengan panjang gelombang 450 nm didapat hasil Enterococcus faecalis yang dikultur: 0,532 dan 0,548. Gambar 3.5 Nilai OD normal Enterococcus faecalis dengan panjang gelombang 450 nm Pada gambar 3.5 didapat nilai normal Enterococcus faecalis dengan panjang gelombang yaitu dalam menentukan standard kekeruhan dari bakteri Enterococcus faecalis yang ingin didapat. Pada nilai normal Enterococccus faecalis pada 1 x 10 6 Gambar 3.6. BHI Brain Gambar 3.7. BHI Brain Heart Infusion Agar, CFU ml adalah 0,550. Heart Infusion Broth bunsen, tabung reaksi, kultur Enterococcus faecalis ATCC 29212 Gambar 3.8 Enterococcus faecalis 3.9. Enterococcus faecalis yang yang dikultur: 0,532 dikultur: 0,548

3.7.4 Mensterilkan Bahan Coba Sea Cucumber Stichopus variegatus

Sediakan bahan coba yang akan disterilkan. Ditimbang sebanyak 1,04 gram Sea Cucumber Stichopus variegatus yang akan diautoclave 121 C selama 2,5 jam. Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah bahan coba Sea Cucumber Stichopus variegatus tersebut tidak terkontaminasi dengan yang lain. Gambar 3.10. Pengambilan bahan coba Gambar 3.11. 1,04 gr Bahan coba Gambar 3.12. Autoclave

3.7.5 Pembuatan BHI Brain Heart Infusion Agar dan BHI Brain Heart

Infusion Broth 3.7.5.1 BHI Brain Heart Infusion Agar Sebanyak 13 gram bubuk BHI Brain Heart Infusion Agar ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik. Kemudian dimasukkan kedalam botol elemeyer dan diambil sebanyak 250ml aquadest. Diaduk sampai merata lalu ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Autoclave pada suhu 121 o C selama 2,5 jam. Gambar 3.13. 13 gram BHI Brain Heart Gambar 3.14. BHI Brain Heart Infusion Agar Infusion Agar Gambar 3.15. 13 gram BHI Agar dan 250 ml aquadest

3.7.5.2 BHI Brain Heart Infusion Broth

Sebanyak 3,7 gram bubuk BHI Brain Heart Infusion Broth di timbang dengan menggunakan timbangan analitik. Kemudian dimasukkan ke dalam tabung elemeyer dan dicampur dengan 100ml aquadest. Diaduk sampai merata dan ditutup dengan kapas dan aluminium foil, kemudian disterilkan didalam autoclave pada suhu 121 o C selama 2,5 jam. Gambar 3.16. 3,7 gram BHI Brain Gambar 3.17. BHI Brain Heart Infusion Broth Heart Infusion Broth Gambar 3.18. 3,7 gram BHI Gambar 3.19. BHI Brain Heart Brain Brain Heart Infusion Infusion Agar dan BHI Brain Heart dan 100 ml aquadest Infusion Broth

3.7.6 Pembuatan konsentrasi bahan coba Sea Cucumber Stichopus

variegatus dan CaOH2 Pembuatan konsentrasi Sea Cucumber Stichopus variegatus 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4, 0,5 dan CaOH2 0,5. Dengan rumus V 1 .C 1 = V 2 .C 2. dimana V 1 adalah jumlah pelarut ml, C 1 adalah konsentrasi dari pelarut , V 2 adalah jumlah bahan coba ml, C 2 adalah konsentrasi yang dicari dari bahan coba . Gambar 3.20. Sea Cucumber Gambar 3.21. Sea Cucumber Stichopus variegatus Stichopus variegatus+ CaOH2 Bahan coba Sea Cucumber Stichopus variegatus dilakukan pengenceran dengan menambahkan BHI Brain Heart Infusion Broth dan dicampur dengan menggunakan alat pemanas dan diaduk dengan menggunakan pengaduk. Gambar 3.22 Pemanasan dengan Stir Gambar 3.23 Pengaduk Plate + BHI Brain Heart Infusion Broth Pada konsentrasi 0,1 membutuhkan 0,001 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,999 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Pada konsentrasi 0,2 membutuhkan 0,002 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,998 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Pada konsentrasi 0,25 membutuhkan 0,0025 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,9975 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Pada konsentrasi 0,3 membutuhkan 0,003 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,997 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Pada konsentrasi 0,4 membutuhkan 0,004 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,996 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Pada konsentrasi 0,5 membutuhkan 0,005 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,995 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Pada CaOH2 diambil konsentrasi 0,5 membutuhkan 0,005 ml Sea Cucumber Stichopus variegatus + 0,995 ml BHI Brain Heart Infusion Broth. Semua bahan diambil dengan menggunakan pipet steril. Gambar 3.24. Pipet Gambar 3.25.Tips Biru dan kuning steril Dan masing-masing konsentrasi dimasukkan kedalam tabung kecil dan didekatkan dengan bunsen tujuannya agar tidak terjadi kontaminasi. Lalu di campur dengan menggunakan vorteks tujuan agar tercampur dengan homogen antara Sea Cucumber Stichopus variegatus dengan BHI Brain Heart Infusion Broth. Dan setiap tabung diberi label dengan tujuan agar tidak terjadi kesalahan dalam pengambilan sampel. Kemudian disimpan di dalam kulkas dengan suhu 37 C. Gambar 3.26. Vorteks Gambar 3.27. Konsentasi Sea Cucumber Stichopus variegatus +CaOH2 Gambar 3.28. Pencampuran dengan menggunakan vorteks

3.7.7 Perlakuan I Nilai

Ambil kultur Enterococcus faecalis yang telah dikultur selama 24 jam. Dilakukan perhitungan OD Enterococcus faecalis dengan cara : Absorbansi OD Enterococcus faecalis 1. Ambil 200µL bakteri Enterococcus faecalis dan 200µL BHI Brain Heart Infusion Broth dimasukkan kedalam 96 well plate. 2. Dimasukkan ke microplate reader untuk mengukur OD dengan panjang gelombang 450 nm dengan standard Enterococcus faecalis 10 6 3. Lalu dicari nilai rata-rata OD agar dimasukkan kedalam MTT Assay untuk mendapatkan biofilm. 0,550. 4. Lalu diambil 200µL dimasukkan ke 96 well plate untuk diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan biofilm. 5. Diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam 37 C Gambar 3.29. 96 Well plate Gambar 3.30. 200µL bakteri Enterococcus faecalis dan 200µL BHI Broth dimasukkan kedalam 96 well plate. Gambar 3.31. Inkubator

3.7.8 Perlakuan II

Pengambilan 96 well plate yang telah diinkubasi selama 24 jam. Lalu dibuang supernatannya dengan cara pengambilan 200µL kemudian dicuci dengan menggunakan PBS Steril sebanyak 200µL dan diletakkan bahan coba dengan berbagai konsentrasi dan CaOH 2 1. Observasi dalam 4 Jam sebanyak 200µL Pada pukul 09.55 dimasukkan kedalam inkubator selama 4 jam lalu dikeluarkan pada pukul 13.55 dan dilakukan MTT Assay. Medium kultur bakteri dari setiap well ditambahkan sebanyak 50µL larutan MTT 5mgml dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 3 jam. Setelah 3 jam pukul 16.55 well dikeluarkan dari inkubator dan ditambahkan 150µL acidified isopropanol lalu diletakkan diatas orbital shaker 50 rpm selama 1 jam. Setelah 1 jam pukul 17.55 dilakukan perhitungan nilai obsorbansi OD pada kelompok perlakukan yang dipresentasikan terhadap OD kelompok CaOH2 untuk menentukan viabilitas bakteri dengan panjang gelombang 650 nm. 2. Observasi pada 6 Jam Pada pukul 09.55 dimasukkan kedalam inkubator selama 4 jam lalu dikeluarkan pada pukul 15.55 dan dilakukan MTT Assay. Medium kultur bakteri dari setiap well ditambahkan sebanyak 50µL larutan MTT 5mgml dan diinkubasi pada suhu 37 3. Observasi pada 8 Jam C selama 3 jam. Setelah 3 jam pukul 18.55 well dikeluarkan dari inkubator dan ditambahkan 150µL acidified isopropanol lalu diletakkan diatas orbital shaker 50 rpm selama 1 jam. Setelah 1 jam pukul 19.55 dilakukan perhitungan nilai obsorbansi OD pada kelompok perlakukan yang dipresentasikan terhadap OD kelompok CaOH2 untuk menentukan viabilitas bakteri dengan panjang gelombang 650 nm. Pada pukul 09.20 dimasukkan kedalam inkubator selama 4 jam lalu dikeluarkan pada pukul 17.20 dan dilakukan MTT Assay. Medium kultur bakteri dari setiap well ditambahkan sebanyak 50µL larutan MTT 5mgml dan diinkubasi pada suhu 37 4. Observasi pada 24 Jam C selama 3 jam. Setelah 3 jam pukul 20.20 well dikeluarkan dari inkubator dan ditambahkan 150µL acidified isopropanol lalu diletakkan diatas orbital shaker 50 rpm selama 1 jam. Setelah 1 jam pukul 21.20 dilakukan perhitungan nilai obsorbansi OD pada kelompok perlakukan yang dipresentasikan terhadap OD kelompok CaOH2 untuk menentukan viabilitas bakteri dengan panjang gelombang 650 nm. Pada pukul 09.00 dimasukkan kedalam inkubator selama 4 jam lalu dikeluarkan pada pukul 10.00 esokan harinya dan dilakukan MTT Assay. Medium kultur bakteri dari setiap well ditambahkan sebanyak 50µL larutan MTT 5mgml dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 3 jam. Setelah 3 jam pukul 13.00 well dikeluarkan dari inkubator dan ditambahkan 150µL acidified isopropanol lalu diletakkan diatas orbital shaker 50 rpm selama 1 jam. Setelah 1 jam pukul 14.00 dilakukan perhitungan nilai obsorbansi OD pada kelompok perlakukan yang dipresentasikan terhadap OD kelompok CaOH 2 untuk menentukan viabilitas bakteri dengan panjang gelombang 650 nm. Gambar 3.32. Supernatan dan telah dicuci dengan PBS Steril sebanyak 200µL Gambar 3.33. Supernatan kultur Enterococus faecalis dalam 96 well plate dibagi dalam waktu 4 jam,6 jam,8 jam dan 24 jam Gambar 3.34. Orbital shaker gambar 3.34 dipakai tujuannya untuk mengaduk bahan MTT yang kita masukkan ke dalam bahan coba akar tercampur secara merata. Pada penelitian ini memakai kecepatan 50 rpm dengan lama waktu 1 jam. Orbital Shaker

3.8 Analisis Data

Pada data hasil penelitian tersebut dilakukan penelitian data dengan MTT Assay dengan panjang gelombang 650 nm pada waktu 4 jam, 6 jam ,8 jam dan 24 jam. Dan didapat data-data statistik yang kemudian akan dilakukan pengujian dengan menggunakan uji Anova p0,005, karena jumlah sampel yang sedikit maka dilakukan pengujian Kolmogorov-Smirnov.

BAB 4 HASIL PENELITIAN

Pada penelitian ini sampel adalah bakteri Enterococcus faecalis, ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus yang dibagi atas kelompok perlakuan dan kontrol CaOH 2 Rata-rata dan simpangan baku jumlah bakteri yang tereliminasi dengan pemberian ekstrak Sea Cucumber Stichopus variegatus dalam waktu 4 jam ditampilkan pada Tabel 4.1. Rata-rata jumlah bakteri yang tereliminasi terbanyak pada konsentrasi 0,3 dan jumlah bakteri yang tereliminasi paling sedikit pada konsentrasi 0,1. dengan pemeriksaan 4 jam, 6 jam, 8 jam dan 24 jam serta mengukur konsentrasi yang efektif dalam membunuh bakteri Enterococcus faecalis. Hasil pengamatan antibakterial kemudian diukur dengan menggunakan metode 3-4,5- dimethythiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazoliun bromide MTT assay dan dibaca dengan microplate reader panjang gelombang 650 nm.