Kromotografi merupakan prosedur pemisahan zat terlarut dalam sistem yang terdiri dari dua fase. Dalam kromatografi, menggunakan dua fase tetap yaitu
: fase diam stasionary phase dan fase gerak mobile phase, dimana pemisahan senyawa tergantung pada gerakan dari dua fase ini.
Menurut Farmakope Indonesi Ed. IV, lempeng yang dilapisi dapat dianggap sebagai kolom kromotografi terbuka dan pemisahan yang tercapai
dapat didasarkan pada absorbsi, partisi, atau kombinasi dari keduanya, tergantung dari jenis zat penyangga, cara pembuatan dan jenis pelarut yang
digunakan.
2.3.2.2. Uji kuantitatif
Uji kuantitatif dapat dilakukan dengan cara kromatografi cair kinerja tinggi KCKT
• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga
dengan HPLC High Performance Liquid Chromatografi dikembangkan pada akhir tahun 1960-an. KCKT merupakan metode yang dapat digunakan
baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein- protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif
obat, produk –produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel- sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu
campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintestis Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
KCKT pada saat ini merupakan metode kromatografi cair paling akhir. Dalam beberapa tahun terakhir ini teknologi KCKT dan
pemakaiannya sangat berkembang, walaupun membutuhkan biaya yang relatif tidak sedikit tapi saat ini merupakan suatu teknik yang banyak
digunakan pada perusahaan obat. Diantaranya adalah PT. Kimia Farma Persero Tbk. Plant Medan.
Hampir semua produk obat baru yang dikembangkan akhir-akhir ini menggunakan KCKT sebagai metode pilihan untuk analisis stabilitas
sediaanya. KCKT dapat memisahkan dan menentukan jumlah zat berkhasiat dan hasil peruraiannya. Banyak metode analisis lama yang dipakai sebagai
metode pemeriksaan resmi berangsur-angsur digantikan oleh metode KCKT yang lebih spesifik , peka dan teliti Lachman, 1994.
Alat utama KCKT terdiri dari: 1.
Tandon pelarut Bahan tandon pelarut harus lembam terhadap fase gerak berair dan tidak
berair. Sehingga baja antikarat dan gelas menjadi pilihan. Baja antikarat jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika tandon
harus bertekanan, hindari penggunaan gelas. Daya tampung tandon harus lebih dari 500 ml digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir 1-2
mlmenit. 2.
Pipa Pipa merupakan penyambung dari seluruh bagian sistem. Garis tengah
dalam pipa sebelum penyuntik tidak terpengaruh. Hanya saja harus lembam, tahan tekanan dan mampu dilewati pelarut dengan volume yang memadai.
Universitas Sumatera Utara
3. Pompa
Pompa harus lembam terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas, baja anti karat, teflon, dan batu nilam. Aliran pelarut dalam
pompa harus tanpa denyut atau diredam untuk menghilangkan denyut, karena denyut air pelarut dapat menyebabkan hasil yang rancu bagi
beberapa detektor. Kecepatan alir pompa harus tetap, baik untuk keperluan jangka pendek maupun jangka panjang.
4. Penyuntik Sistem Penyuntik Cuplikan
Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai ketelitian maksimum analisis kuantitatif. Yang terpenting sistem harus dapat
mengatasi tekanan balik yang tinggi tanpa kehilangan cuplikan. Pada saat pengisian cuplikan, cuplikan dialirkan melewati lingkar cuplikan dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuangan. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati lingkar cuplikan ke kolom.
5. Kolom
Kolom merupakan jantung kromotograf, keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat.
Dianjurkan untuk memasang penyaring 2µ m di jalur antara penyuntik dan kolom, untuk menahan partikel yang dibawa fase gerak dan cuplikan. Hal
ini dapat memperpanjang umur kolom Munson, 1991. Kolom dapat diibagi menjadi 2 kelompok, yaitu :
Universitas Sumatera Utara
a. Kolom analitik : garis tengah dalam 2-6 mm. untuk kemasan mikropartikel
biasanya panjang kolom 10-30 cm. b.
Kolom preparatif : garis tengah 6 mm atau lebih panjang 25-100 cm Johnson, 1991.
Kolom kromotografi untuk pengaliran oleh gaya tarik bumi gravitasi atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi kran
jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Salah satu konsep penting KCKT ialah mengusahakan volum pelarut antara
penjerap dan detektor atau fraksinator sekecil mungkin untuk mencegah pencampuran kembali fraksi-fraksi setelah terpisah Gritter, 1991.
6. Detektor
Detektor harus memberi tanggapan pada cuplikan, tanggapan yang dapat diramal, peka, hasil yang efesien dan tidak terpengaruh oleh perubahan suhu
atau komposisi fase gerak. Detektor yang dipakai pada KCKT biasanya adalah UV 254 nm. Bila tanggapan detektor lebih lambat dari elusi sampel
timbulah pelebaran pita yang memperburuk pemisahan. Pemilihan detektor KCKT tergantung pada sifat sampel, fase gerak dan kepekaan yang tinggi
dicapai. 7.
Penguat Sinyal Pada umumnya sinyal yang berasal dari detektor diperkuat terlebih dahulu
sebelum disampaikan pada alat perekam potensiometrik. Dapat pula sinyal dikirimkan kepada suatu integrator digital elektronik untuk mengukur luas
puncak kromatogram secara otomatik. 8.
Perekam
Universitas Sumatera Utara
Perekam merupakan salah satu dari bagian peralatan yang berfungsi untuk merekam atau menunjukkan hasil pemeriksaan suatu senyawa berupa pelak
puncak. Dari daftar tersebut secara kualitatif kita dapat menentukan atau mengetahui senyawa apa saja yang diperiksa, luas dan tinggi puncak
berbanding lurus dengan konsentrasi. Dari data ini dapat pula dipakai untuk memperoleh secara kuantitatif. Sebagai perekam biasanya dipakai bersama-
sama dengan integrator Munson, 1991. Dalam pemisahan suatu senyawa secara KCKT biasanya digunakan suatu
pelarut landasan yaitu pelarut yang sifat kepolarannya biasanya diubah- ubah, sesuai dengan kebutuhan. Bila sampel telah dimasukkan dengan suatu
penyuntik KCKT, maka akan dibawa melalui kolom bersama suatu fase gerak akibat adanya tekanan dari suatu pompa. Data yang dihasilkan akan
ditunjukkan berupa puncak peak oleh suatu perekam.
2.3.3 Proses kromatografi Cair Kinerja Tinggi
