commit to user
36
Kriteria eksklusi
Kriteria eksklusi untuk PJT : 1.
Ibu hamil dengan penyakit kronis antara lain Diabetes Militus, kelainan ginjal, kelainan jantung hipertensi kronis, infeksi kronis, yang
merokok,dengan anemia, dengan riwayat pecandu alkohol morfin. 2.
Kehamilan kembar 3.
Kematian janin dalam rahim 4.
Ibu hamil dengan ketuban pecah dini,infeksi intrauterine dan infeksi lain 5.
Janin dengan kelainan kongenital 6.
Adanya kelainan plasenta hemangioma plasenta dan plasenta previa .
D. BESAR SAMPEL
Penentuan besar sampel didasarkan pada rumus:
n = Besar masing-masing kelompok sampel. Z 1-
α = statistik Z Zα= nilai studi normal yang besarnya tergantung α
Bila α = 0,05 Zα = 1,96
Bila α = 0,01 Zα = 2,57
α
2
= varian populasi yang tidak diketahui nilainya dapat diperkirakan dari studi sebelumnya.
µ1-µ2= beda
mean
yang diperkirakan. Lemeshow et all, dikutip dari Murti ,2010.
n = 2 α
2
[ Z1- α + Z 1-β]
2
µ1-µ2
2
commit to user
37
Karena tidak ada studi tentang Ekspresi HLA-G antara PJT dan
kehamilan normal sebelumnya sehingga tidak diketahui nilai
mean
maka digunakan
Rule of thumb
, dimana setiap penelitian yang datanya akan dianalisis secara statistik dengan analisis bivariat membutuhkan sampel
minimal 30 subjek penelitian Murti ,2010. Sehingga pada penelitian ini besar sampel
15 sampel untuk kelompok PJT dan 15 sampel untuk kelompok kehamilan normal.
E. VARIABEL PENELITIAN
Variabel bebas : Ekspresi HLA-G pada PJT dan kehamilan
normal. Variabel tergantung : PJT dan kehamilan normal .
F. DEFINISI OPERASIONAL VARIABEL
· PJT adalah janin yang mempunyai berat badan kurang atau sama dengan
10 persentil dari kurva berat badan normal. ·
Kehamilan normal adalah kehamilan dimana selama
antenatal care
semenjak hamil sampai melahirkan tidak ada komplikasi bagi ibu dan janinbayinya kehamilan dengan janin tunggal, berat badan lahir 2500-
4000 gram dan dengan persalinan normal . ·
Ekspresi HLA-G ditunjukkan dengan warna merah kecoklatan pada trofoblas pada pemeriksaan imunohistokimia.
commit to user
38
G. INSTRUMEN DAN PENGAMBILAN SAMPEL
Pembuatan Slide jaringan 1.Alat :
- Tissue cassette
- Beaker glass
- Mikrotom
- Poly-L-Lysine slides
- Deckglass
- Humidity chamber vertikal
- Humidity chamber horisontal
- Mikro pipet 10 µl
- Mikro pipet 100 µl
- Mikro pipet 1000 µl
- PCR tube
- Shaker
2.Bahan -
Formalin buffer -
Alkohol absolut, 95, 80, 70, 50.
- Xylol
- Parafin
- Aquadest
- Buffer sitrat pH 6
- PBS pH 7,2 - 7,4
- Metanol H
2
O
2
0,3 -
Bloking serum -
Antibodi primer -
Antibodi sekunder : biotin -
Streptavidin -
Substrat enzim peroksidase : DAB
- Hematoxylin
- Canada balsam
- Kapastissu
Pembuatan Slide jaringan
Jaringan Trofoblas dari plasenta difiksasi terlebih dahulu dengan menggunakan larutan formalin buffer minimal selama 2 jam. Masukan jaringan
kedalam cassette tissue dan rendam dalam alkohol 50 , 70 , 80 95 ,
commit to user
39
kemudian dilakukan clearing menggunakan xylol 3 kali masing masing 60 menit. Kemudian dilakukan proses embedding yaitu direndam dalam paraffin cair
dengan titik lebur 58 C pada suhu 45 C dalam incubator selama 24 jam, kemudian dibuat blok paraffin. Keesokan harinya ditempelkan pada holder dan dilakukan
pemotongan setebal 4-5 mikron dengan rotary microtome. Diletakkan pada slides poly-L-lysine selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 malam . Dilakukan
mounting pada gelas objek dengan gelatin 5. Gelas objek hasil parafin blok direndam dalam xylol 4 kali masing-masing selama 5 menit. Setelah itu dilakukan
rehidrasi menggunakan alkohol berseri absolut , 95 , 70 kemudian dibilas
dengan dengan aquadest H2O selama 5 menit. Pemeriksaan Imunohistokimia HLA-G
Slide dicuci dengan PBS pH 7,4 dua kali selama 5 menit. Tetesi dengan endogenous peroksidase methanol H2O2 0,3 selama 15 menit kemudian bilas
dengan air mengalir selama 5 menit dan cuci kembali dengan aquadest selama 5 menit. Cuci kembali dengan menggunakan PBS selama 2x5 menit dan tetesi
dengan bloking serum.Tiriskan, kemudian tetesi dengan monoclonal antibody HLA-G yang telah disiapkan Inkubasi pada suhu 4 C selama 18 jam. Cuci dengan
PBS kembali selama 2 x 5 menit. Tetesi dengan antibody sekunder berlabel biotin selama 10 menit. Tetesi dengan streptavidin selama 10 menit, cuci dengan
PBS selama 2 x 5 menit kemudian pemberian substrat enzim peroksidase : Dietyl Amino Benzyn selama 15 menit. Cuci dengan air selama 15 menit dan tetesi
dengan hematoxylin selama 40 detik dan cuci dengan air mengalir selama 10 menit. Mounting, menggunakan entelan dan tutup dengan cover glass. Amati
commit to user
40
pada mikroskop cahaya . Ekspresi HLA-G ditunjukkan dengan warna merah kecoklatan pada trofoblas.
Pengamatan dilakukan sebanyak 9 lapangan pandang. Nilai yang ditampilkan adalah nilai rerata ekspresi HLA-G per lapang pandang tersebut.
H. PEMBACAAN
