Sebelum memasuki tahap ekstraksi bertingkat, sampel Petrosia nigricans ini diambil 250 gram dan dipotong kecil-kecil untuk dimaserasi selama 24 jam
menggunakan larutan metanol 500 ml dengan tujuan agar komponen bioaktif pada spons Petrosia nigricans terlarut dalam pelarut. Kemudian hasil maserasi
disaring menggunakan kertas saring hingga diperoleh filtrat dan residu. Filtrat hasil maserasi dievaporasi hingga didapatkan pelarut dan ekstrak yang terpisah
ekstrak metanol. Residunya dimaserasi selama 24 jam dengan etil asetat dan setelah itu hasil maserasinya disaring hingga didapatkan filtrat dan residunya.
Filtrat yang dihasilkan dievaporasi sehingga didapatkan ekstrak etil asetat, sedangkan residunya dimaserasi dengan heksana selama 24 jam. Hasil maserasi
ini disaring dan filtrat yang dihasilkan kemudian dievaporasi sehingga didapatkan ekstrak heksana. Hasil ekstrak yang diperoleh dalam bentuk pasta cair.
3.3.3. Uji Aktivitas Antioksidan DPPH
Uji ini dilakukan terhadap 3 ekstrak spons yaitu ekstrak heksana, etil asetat, dan metanol. Satu ml DPPH ditambah metanol p.a hingga menjadi 4 ml
blanko. Pada ekstrak kasar spons dibuat menjadi konsentrasi ekstrak 100, 150, 200, 250, 300, 400 ppm. Masing
– masing dimasukkan ke dalam botol coklat lalu ditambahkan larutan DPPH 10 ppm sebesar 1 ml sehingga volume total dalam
botol coklat, yaitu 4 ml. Masing – masing botol tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit secara bergantian dengan selang waktu 3 menit selanjutnya serapan diukur dengan spektofotometri UV
– VIS Hitachi U – 2800 pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai control positif dan untuk pembanding digunakan
BHT dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50, 100 ppm. Hambatan dalam persen dihitung dengan rumus :
Keterangan : I = Inhibisi ab = Absorbansi blanko
as = Aabsorbansi sampel
Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing – masing pada
sumbu x dan y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = b Lnx + a digunakan untuk mencari Inhibition Concentration 50 IC
50
dengan memasukkan angka 50 sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC
50
. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali ulangan.
Ekstrak sampel dengan aktivitas antioksidan yang tinggi, dilarutkan pada pelarut awal yaitu metanol teknis, untuk menghilangkan pengotornya. Bagian
– bagian yang terlarut dievaporasi, sedangkan bagian
– bagian yang mengendap dianggap sebagai komponen pengotor dan tidak digunakan. Ekstrak kemudian
diuji aktifitas antioksidannya dengan menurunkan konsentrasinya untuk memperoleh kurva hubungan antara konsentrasi ekstrak dengan persentase
inhibisi yang baik dan mempunyai nilai R
2
yang lebih besar dari 90.
3.3.4. Uji Fitokimia
Identifikasi senyawa kimia yang berperan sebagai antioksidan dalam spons dilakukan terhadap senyawa
– senyawa : a.
Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N
kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendroff, Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer membentuk
endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan cokelat dan dengan pereaksi Dragendroff membentuk endapan merah sampai jingga.
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl
2
dengan 0,5 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi
100ml dengan labu takar. Pereaksi tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian 2,5
gram iodin dan 2 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat.
Pereaksi Dragendroff dibuat dengan cara 0,8 bimut subnitrat ditambahkan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat
dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glacial
dan 100 ml air. Pereaksi berwarna jingga. b.
Steroid triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi.
Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung
steroid atau triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c. Flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume yang sama
dan 4 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada
lapisan amil alkohol. d.
Saponin uji busa Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil
selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan sampel mengandung saponin.
e. Fenol Hidrokuinon pereaksi FeCl
3
Sebanyak 1 gram sampel spons diekstrak dengan 20 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2
tetes larutan FeCl
3
5. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau atau hijau biru.
f. Uji Molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif sampel
mengandung karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
g. Uji Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan kedalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan didihkan selama 5 menit. Hasil uji
positif sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.
h. Uji Biuret
Larutan sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung
senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu. i.
Uji Ninhidrin Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin
0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino yaitu terbentuknya larutan berwarna
biru.
19
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
