19
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental parametrik. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar
menggunakan pencadang kertas. Parameter yang diukur adalah besarnya zona hambat di sekitar pencadang kertas. Tahapan-tahapan penelitian meliputi
pengumpulan dan pengolahan sampel, skrining fitokimia, pemeriksaan karakterisasi simplisia, pembuatan ekstrak etanol rimpang laja gowah dengan cara
perkolasi kemudian difraksinasi berturut-turut dengan pelarut n-heksana dan etil asetat. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap bakteri Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USU Medan
pada bulan Oktober 2014-Februari 2015.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, alat tanur, aluminium foil, autoklaf Fisons, blender Philips, cakram kertas, cawan
petri, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kaca objek, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF I200 L, lampu bunsen, lemari pendingin Toshiba,
lemari pengering, oven Memmert, pinset, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporator Haake D, seperangkat alat perkolator, spektrofotometervisible
Dynamica Halo Vis-10 dan timbangan analitik Mettler Toledo.
20
3.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang laja gowah Alpinia malaccensis Burm.f. Roscoe, air suling, mueller hinton agar,
nutrient broth dan bahan-bahan yang berkualitas proanalisa E. Merck: etanol, dimetilsulfoksida DMSO, n-heksana, etil asetat, raksa II klorida, natrium
hidroksida, iodium, bismuth III nitrat, kalium iodida, besi III klorida, α-naftol,
asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, asam asetat anhidrat, isopropanol, kloroform, metanol,natrium klorida, benzena, serbuk
magnesium, toluena dan amil alkohol. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923dan Escherichia coli ATCC 25922.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media 3.3.1 Pembuatan larutan pereaksi
3.3.1.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Pada wadah lain, 50 g kalium iodida dilarutkan dalam 100 ml air suling,
kemudian 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.2 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g Natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.3.1.3 Pereaksi Bouchardat
21 Sebanyak 4 g Kalium Iodida ditimbang kemudian dilarutkan dalam air
suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g iodium sedikit demi sedikit. Setelah semuanya larut, dicukupkan dengan air suling
hingga volume 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.4 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8,0 g bismuth II nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat dan dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling, lalu dicampurkan kedua
larutan dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.5 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air
suling hingga 100 ml, lalu disaring Ditjen POM, 1979. 3.3.1.6 Pereaksi asam klorida 2 N
Asam klorida pekat sebanyak 16,6 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.3.1.7 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.8 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 10 tetes asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 tetes asam sulfat pekat. Larutan selalu dibuat baru Depkes RI, 1989.
3.3.1.9 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes
RI, 1989.
22
3.3.1.10 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air Depkes RI, 1995.
3.3.2 Pembuatan media 3.3.2.1 Media mueller hinton agar
Komposisi : Meat infusion 6,0 gL
Casein Hydrolysate 17,5 gL
Starch 1,5 gL
Agar No. 1 10 gL
Cara pembuatan: Sebanyak 35,0 g mueller hinton agarMHA disuspensikan ke dalam air
suling sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.3.2.2 Media nutrient broth
Komposisi : Lab-Lemco Powder 1 gL
Yeast Extract 2 gL
Peptone 5 gL
Sodium Chloride 5 gL
Cara pembuatan: Sebanyak 13 g media nutrient broth NB dilarutkan dengan air suling
1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna, kemudian media dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertutup dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu
121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.3.2.3 Pembuatan agar miring
23 Sebanyak 3 ml media MHA cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu
diletakkan pada sudut kemiringan 30-45
o
dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay, 1994.
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media pertumbuhan disterilkan di
autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 160 – 170
o
C selama 1 – 2 jam. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan nyala bunsen Lay, 1994.
3.5 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan tumbuhan yang sama dengan daerah lain. Bahan tumbuhan yang
digunakan adalah rimpang laja gowah Alpinia malaccensis Burm.f. Roscoe, diambil dari Namo Rambe, Kelurahan Tangkahan, Kabupaten Deli Serdang,
Provinsi Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI Bogor.
3.5.3 Pembuatan simplisia
Rimpang laja gowah Alpinia malaccensis Burm.f. Roscoe dicuci bersih dari pengotoran dengan air sampai bersih dan ditiriskan. Kemudian diiris 1 – 2
cm, dikeringkan di lemari pengering dengan 40
o
C. Rimpang laja gowah dianggap
24 kering apabila sudah rapuh dapat dipatahkan. Simplisia rimpang laja gowah
yang telah kering diserbuk menggunakan blender, kemudian disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat. Gambar simplisia dapat dilihat pada Lampiran
3, halaman 47 – 48. 3.6 Karakterisasi Simplisia
3.6.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia rimpang laja gowah Alpinia malaccensis Burm.f. Roscoe dengan mengamati bentuk,
bau, rasa dan warna.
3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia rimpang laja gowah Alpinia malaccensis Burm.f. Roscoe. Serbuk simplisia ditaburkan
di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Selain itu,
pemeriksaan mikroskopik juga dilakukan dengan menggunakan aquades hasil dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 49.
3.6.3 Penetapan kadar air
a. Penjenuhan toluen Toluen sebanyak 200 ml dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu
ditambahkan 2 ml air suling, kemudian alat dipasang dan dilakukan destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit,
kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,1 ml. b. Penetapan kadar air simplisia
25 Labu berisi toluen tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah
ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan toluen diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air
terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen.
Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan
ketelitian 0,1 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen
WHO, 1998.
3.6.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam aquadest sampai 1000 ml dengan
menggunakan botol bersumbat sambil sekali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 – 24 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat
pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan
yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dengan menggunakan botol bersumbat sambil sekali-kali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 – 24 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang
26 berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven
pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.6.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2,5 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, lalu dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Kurs porselin bersama isinya dipijarkan perlahan hingga arang habis, lalu dinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap.
Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan,
disaring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas, kemudian residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot yang tetap, lalu dinginkan dan
ditimbang beratnya. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
3.7 Skrining Fitokimia
Skrining Fitokimia dari serbuk simplisia, ekstrak etanol, n-heksana dan etil asetat meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, flavonoida, saponin,
tanin, glikosida, glikosida antrakinon dan steroidatriterpenoida. 3.7.1 Pemeriksaan alkaloida
27 Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml
asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanasakan di atas penangas air selama 2 menit, lalu didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai
berikut: a.
Filtrat sebayak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat,
akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga.
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruham paling sedikit dua dari tiga percobaan Depkes RI, 1995.
3.7.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 20 ml air panas, lalu dididihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml
filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, kemudian dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika
terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Depkes RI, 1995.
3.7.3 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika
terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya
saponin Depkes RI, 1995.
28
3.7.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna hijau, biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin
Harborne, 1987.
3.7.5 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, lalu direfluks selama 1 jam,
kemudian didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0.4 M, lalu dikocok dan didiamkan 5 menit,
kemudian disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan
dengan temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dipakai untuk percobaan berikut:
a. Larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan di atas
penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding
tabung sehingga terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan yang menunjukkan adanya glikosida.
b. Larutan percobaan diuapkan di atas penangas air, kemudian dilarutkan sisa
dalam 5 ml asam asetat anhidrat, lalu ditambahkan 10 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna biru atau hijau menunjukkan adanya glikosida Depkes
RI, 1995.
29
3.7.6 Pemeriksaan glikosida antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah 5 ml asam sulfat 2 N, kemudian dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, lalu dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Lapisan benzena dikocok dengan 2 ml NaOH 2 N, kemudian didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan
lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon Depkes RI, 1989.
3.7.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring, kemudian filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya
ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann – Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah
menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.
3.8 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi menggunakan cairan penyari etanol.
Cara kerja : Sebanyak 350 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana bertutup,
kemudian direndam dengan cairan penyari etanol selama 3 jam. Massa dimasukkan ke dalam perkolator, cairan penyari etanol dituang secukupnya
sampai terdapat selapis cairan penyari di atas serbuk simplisia, kemudian mulut perkolator ditutup dengan aluminium foil dan plastik dan dibiarkan selama 24
jam. Kran perkolator dibuka setelah 24 jam, cairan perkolat dibiarkan menetes
30 dengan kecepatan 1 tetes per detik dan ditampung ke dalam botol berwarna
bening. Perkolasi dihentikan apabila 500 mg cairan perkolat terakhir diuapkan diatas penangas air tidak meninggalkan sisa. Perkolat dipekatkan dengan bantuan
alat penguap rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 40
o
C sampai diperoleh ekstrak kental kemudian dikeringkan dengan freeze dryer. Bagan pembuatan
ekstrak etanol secara perkolasi dapat dilihat di Lampiran 6, halaman 51.
3.9 Pembuatan Fraksi n-Heksana dan Etil Asetat
Kategori