VALIDASI METODE ANALISIS AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PADA FRAKSI AIR DARI Dunaliella sp. DENGAN TEKNIK LINEAR SWEEP VOLTAMMETRY

METHOD VALIDATION FOR ANTIOXIDANT ANALYSIS IN WATER FRACTION OFDunaliellasp. BY LINEAR SWEEP VOLTAMMETRY

TECHNIQUE By Indah Aprianti

A study of analytical methods validation of antioxidant analysis from Dunaliella sp. was conducted by linear sweep voltammetry technique, to obtain information about the performance of the method. Electrodes used in this research were: glassy carbon working electrode, a reference electrode of silver/silver chloride (Ag/AgCl), and platinum auxiliary electrode. Potential range (E) of oxygen reduction is 0 mV to -1000 mV, with a scan rate 100 mV/s and 10 µA current range. Supporting electrolyte used in this experiment of 0,1 M NaCl. Validation test parameters of this method include: linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD), and measuring range. The result showed that the validation of the methods have a correlation coefficient (R) 0.982, % RSD of Dunaliella sp. extract and Dunaliella sp. filtrate were 4.52% and 3.16%, the % recovery was 103.51 %, limit of detection was 0.079 mM, and measuring range of sample testing between 0.079 - 0.700 mM. Antioxidant activity coefficient of ascorbic has a value of 0.305.

Keywords: Method validation, Linear sweep voltammetry, Antioxidant,

ABSTRAK

VALIDASI METODE ANALISIS AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PADA FRAKSI AIR DARIDunaliellasp. DENGAN TEKNIKLINEAR SWEEP

VOLTAMMETRY

Oleh Indah Aprianti

Telah dilakukan validasi metode analisis aktivitas antioksidan pada fraksi air dari

Dunaliella sp. dengan teknik linear sweep voltammetry. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh metode dan informasi unjuk kerja metode analisis dengan teknik

linear sweep voltammetry. Elektroda yang digunakan adalah elektroda kerja (glassy carbon), elektroda acuan (Ag/AgCl) dan elektroda bantu (Platina). Jendela potensial dari reduksi oksigen adalah 0 mV sampai dengan -1000 mV, dengan laju selusur 100 mV/detik dan range arus 10 µA. Elektrolit pendukung yang digunakan adalah NaCl 0,1 M. Parameter uji validasi metode ini meliputi: linieritas, presisi, akurasi, batas deteksi, dan rentang pengukuran. Hasil penelitian menunjukkan bahwa validasi metode analisis memiliki nilai koefisien korelasi (R) 0,982; % RSD untuk ekstrak

Dunaliella sp. dan filtrat Dunaliella sp. masing-masing adalah 4,52% dan 3,16%; hasil % perolehan kembali adalah 103,51%; batas deteksi untuk metode ini adalah 0,079 mM dan rentang pengukuran sampel berkisar 0,079 - 0,700 mM. Koefisien aktivitas antioksidan dari asam askorbat mempunyai nilai sebesar 0,305.

Oleh

INDAH APRIANTI

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS

Pada Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2015

VALIDASI METODE ANALISIS AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PADA FRAKSI AIR DARIDunaliellasp. DENGAN TEKNIKLINEAR SWEEP

VOLTAMMETRY (Skripsi)

Oleh

INDAH APRIANTI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2015

Gambar Halaman

1. (a) Laju selusur tunggal dan (b) Voltammogramlinear sweep... 9

2. Perubahan konstanta laju... 10

3. Formula struktur kimia dari asam askorbat... 19

4. Mekanisme oksidasi asam askorbat ... 20

5. Proses skematik pertumbuhan mikroalga... 27

6. Dunaliellasp ... 28

7. Voltammogram reduksi oksigen pada larutan blangko dan larutan asam askorbat 0,7 mM ... 42

8. Voltammogram oksidasi asam askorbat pada larutan blangko dan larutan asam askorbat 0,7 mM ... 43

9. Voltammogram pengukuran reduksi oksigen dengan variasi konsentrasi asam askorbat... 45

10. Kurva kalibrasi konsentrasi asam askorbat vs arus reduksi oksigen.... 46

11. Voltammogram pengukuran oksidasi asam askorbat yang divariasikan konsentrasinya... 47

12. Kurva kalibrasi konsentrasi asam askorbat vs arus oksidasi asam askorbat ... 48

13. Voltammogram pengukuran ekstrakDunaliellasp ... 50

14. Voltammogram pengukuran filtrat Dunaliellasp ... 51

15. Voltammogram pengukuran ekstrakDunaliellasp. tanpa dan dengan penambahan asam askorbat 0,52 mM... 53

16. Kurva perubahan relatif densitas arus reduksi oksigen terhadap konsentrasi antioksidan ... 56

Halaman

DAFTAR TABEL... xviii

DAFTAR GAMBAR ... xix

1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ... 1

B. Tujuan Penelitian ... 4

C. Manfaat Penelitian ... 4

D. Hipotesis Penelitian... 4

II. TINJAUAN PUSTAKA A. Analisis Elektrokimia Dengan Metode Voltammetri ... 5

B. Linear Sweep Voltammetry(LSV) ... 8

C. Validasi Metode ... 11

1. Ketepatan(accuracy)... 12

2. Kecermatan(precision) ... 14

3. Linearitas ... 15

4. Batas Deteksi ... 15

D. Antioksidan... 16

E. Radikal Bebas ... 17

F. Asam Askorbat ... 18

G. Mikroalga ... 20

1. Faktor-faktor Pertumbuhan Mikroalga ... 21

a. Unsur Hara... 21

b. Cahaya ... 22

xvi

d. pH ... 23

e. Salinitas ... 23

f. Aerasi... 24

2. Pola Pertumbuhan Mikroalga ... 25

a. Fase Lag... 25

b. Fase Logaritmik atau Eksponensial ... 25

c. Fase Penurunan Laju Pertumbuhan ... 26

d. Fase Stasioner ... 26

e. Fase Kematian ... 26

H. Dunaliellasp. ... 27

I. PemanenanDunaliellasp. dengan Metode Sentrifugasi ... 29

J. Freeze- Dry ... 29

K. EkstraksiDunaliellasp. dengan Ultrasonikasi... 30

III. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ... 32

B. Alat dan Bahan ... 32

C. Prosedur Penelitian ... 33

1. KultivasiDunaliellasp. ... 33

2. Pengukuran Kepadatan Sel denganHaemocytomer... 34

3. PemanenanDunaliellasp. ... 35

4. Freeze-Dry... 35

5. Ekstraksi Biomassa KeringDunaliellasp ... 35

6. Pembuatan Larutan Blangko ... 36

7. Pembuatan Larutan Standar Asam Askorbat Murni... 36

a. Pembuatan Stok Larutan Standar ... 36

b. Pembuatan Larutan Kerja Standar ... 36

8. Pengukuran Aktivitas Antioksidan ... 37

9. Validasi Metode... 39

a. Linieritas ... 39

b. Presisi... 39

d. Limit Deteksi ... 40

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Preparasi Sampel ... 41

B. Voltammogram Reduksi Oksigen ... 42

C. Voltammogram Oksidasi Asam Askorbat ... 43

D. Validasi Metode ... 44

1. Linieritas ... 44

2. Presisi ... 49

3. Akurasi... 52

4. Batas Deteksi ... 54

5. Rentang ... 55

E. Penentuan Koefisien (K) Aktivitas Antioksidan ... 55

V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan ... 58

B. Saran ... 58

DAFTAR PUSTAKA ... 59

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Persentaserecovery ... 13

2. Klasifikasi ilmiahDunaliellasp. ... 28

3. Komposisi media Conwy ... 33

4. Kandungan logam renik pada media Conwy ... 34

5. Data pengenceran larutan kerja standar asam askorbat ... 37

6. Kondisi pengukuran reduksi oksigen ... 38

7. Kondisi pengukuran oksidasi asam askorbat ... 38

8. Nilai ipcdan Epcpengukuran reduksi oksigen ... 46

9. Nilai ipadan EpaPengukuran oksidasi asam askorbat ... 48

10. Derajat presisi hasil pengukuran ekstrakDunaliellasp...……....…….. 50

11. Derajat Presisi hasil pengukuran filtratDunaliellasp ... 52

12. Pengukuran sampel ekstrak dunaliella yang ditambahkan standar asam askorbat 0,52 mM ... 53

13. Batas deteksi... 54

14. Perubahan relatif densitas arus reduksi oksigen terhadap konsentrasi asam askorbat ... 56

MOTTO

Barang siapa sungguh-sungguh, sesungguhnya kesungguhannya itu

adalah untuk dirinya sendiri (Q.S. 29:6)

Jika ingin mengubah derajat dunia harus dengan USAHA

Jika ingin mengubah derajat kita di akhirat tingkatkan IMAN

Jadilah yang lembut itu hati, yang tipis itu BUDI,

Yang tebal itu IMAN, yang tajam itu AKAL,

Yang baik itu SIFAT dan yang manis itu SENYUMAN

"Banyak kegagalan dalam hidup ini dikarenakan orang-orang tidak

menyadari betapa dekatnya mereka dengan keberhasilan saat mereka

menyerah "

(THOMAS ALFA EDISON)

Barang siapa yang rela dengan ketetapan Allah , maka

ketetapan itu berlaku padanya dan ia mendapatkan pahala.

Dan barang siapa yang tidak rela dengan ketetapan Allah ,

maka ketetapan itu juga berlaku padanya, sedangkan ia

terputus amalnya

(Ali bin Abi Thalib/Mukhtashar Minhajul Qashidin, al Maqdisi)

Jadikan sabar dan shalat sebagai penolong (Q.S. 2:45)

Ilmu pengetahuan tanpa agama adalah cacat, dan

agama tanpa ilmu pengetahuan adalah buta

Kupersembahkan karya sederhana ini kepada :

ALLAH S.W.T

Kedua orang tuaku,

Bapak dan Ibu yang selalu memberikan rasa cinta

dan kasih sayangnya serta yang selalu mendukungku

Adikku tersayang

Muhammad Dimas Saputra

Seluruh sahabat terbaikku

dan Almamater tercinta

Kupersembahkan karya sederhana ini kepada :

ALLAH S.W.T

Kedua orang tuaku,

Bapak dan Ibu yang selalu memberikan rasa cinta

dan kasih sayangnya serta yang selalu mendukungku

Adikku tersayang

Muhammad Dimas Saputra

Seluruh sahabat terbaikku

dan Almamater tercinta

Kupersembahkan karya sederhana ini kepada :

ALLAH S.W.T

Kedua orang tuaku,

Bapak dan Ibu yang selalu memberikan rasa cinta

dan kasih sayangnya serta yang selalu mendukungku

Adikku tersayang

Muhammad Dimas Saputra

Seluruh sahabat terbaikku

Penulis dilahirkan di Bandar Lampung, pada tanggal 15 April 1992 yang merupakan buah hati dari pasangan Bapak Muhammad Soleh dan Ibu Supiyah. Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar di SD Negeri 1 Sukabumi Indah pada tahun 2004, dan Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 5 Bandar Lampung pada tahun 2007. Penulis kemudian menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Kejuruan di Sekolah Menengah Teknologi Industri Bandar Lampung pada tahun 2010. Pada tahun yang sama, penulis bertekad untuk melanjutkan pendidikan ke jenjang yang lebih tinggi. Atas doa restu orang tua serta izin Allah SWT dengan usaha yang keras Alhamdulillah penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN).

Selama menjadi mahasiawa, penulis pernah mendapatkan beasiswa Program Hibah Kompetensi Institusi (PHKI) selama 2 tahun pada tahun ajaran 2010/2011 dan 2011/2012 beasiswa BBM selama 1 tahun pada tahun ajaran 2012/2013. Penulis dalam penyelesaian studi, telah mengikuti Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Pasir Sakti, Lampung Timur selama 30 hari pada bulan Juli-Agustus tahun 2013. Selama menjadi mahasiswa, penulis memiliki pengalaman sebagai asisten praktikum

viii

Kimia Dasar untuk Jurusan Kehutanan Fakultas Pertanian pada tahun 2014 dan asisten praktikum Kimia Dasar untuk Jurusan Geofisika Fakultas Teknik pada tahun 2014. Penulis juga aktif di Organisasi dimulai sejak menjadi Kader Muda Himaki. Pada tahun 2014 penulis melakukan Penelitian di UPT. Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi.

Selain itu, penulis pernah mengikuti beberapa organisasi mahasiswa. Berikut beberapa organisasi dan amanah yang dipercayakan kepada penulis :

1. Unit Kegiatan Pers Mahasiswa Natural FMIPA sebagai anggota pada tahun 2010-2011.

2. Kader Muda HIMAKI (KAMI) FMIPA pada tahun 2010-2011.

3. Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) FMIPA sebagai anggota Biro Usaha Mandiri (BUM) pada tahun 2011-2012.

4. Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) sebagai sekretaris Biro Usaha Mandiri (BUM) pada tahun 2012-2013

SANWACANA

Assalamualaikum Wr. Wb.

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat serta salam senantiasa penulis haturkan kepada Nabi Muhammad SAW semoga senantiasa menjadi suri tauladan bagi penulis.

Skripsi dengan judul “Validasi Metode Analisis Aktivitas Antioksidan Pada Fraksi Air DariDunaliellasp. Dengan TeknikLinear Sweep Voltammetry” adalah salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Universitas Lampung.

Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari jasa baik segenap pihak baik moral maupun spiritual, baik berupa bimbingan, motivasi dan doa yang senantiasa berguna bagi penulis hingga saat ini dan di masa yang akan datang.

Ucapan terima kasih penulis haturkan kepada:

1. Ibu Dian Septiani Pratama, M.Si. selaku dosen pembimbing 1 yang telah senantiasa bersedia meluangkan waktu untuk memberikan saran, bimbingan, nasihat, serta kritik kepada penulis dalam menyelesaikan dan pembuatan skripsi ini.

2. Bapak Dr. Hardoko Insan Qudus, M.S. selaku Pembimbing II atas kesediaan waktu, memberikan petunjuk, saran, serta nasehat dalam menyelesaikan skripsi ini.

3. Ibu Rinawati, Ph.D. selaku pembahas kedua yang telah memberikan masukan, baik saran maupun kritik kepada penulis untuk kesempurnaan tulisan dan penelitian penulis.

4. Ibu Dian Septiani Pratama M.Si. selaku Pembimbing Akademik dalam menyelesaikan masa studi penulis di Jurusan Kimia.

5. Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. selaku ketua jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

6. Bapak Prof. Suharso, Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

7. Seluruh dosen dan karyawan Jurusan Kimia yang telah memberikan ilmu dan pembelajaran selama masa studi penulis.

8. Kedua orang tua, Bapakku Muhammad Soleh untuk usaha, kerja keras serta tetesan keringatnya yang senantiasa berkorban tanpa kenal lelah. Sosok yang begitu membanggakan dan selalu berusaha memberi yang terbaik untukku. Ibuku Supiyah atas do’a, kasih sayang, cinta kasih, dan ketulusannya yang selalu tercurah, yang senantiasa selalu mendengar dan menuruti apa keinginanku.

9. Adik kandungku Muhammad Dimas Saputra tersayang yang senantiasa menemani dan memberikan doa serta dorongan semangat kepada penulis. 10.Partner-ku, Ely Setiawati, S.Si. atas kerjasama, bantuan, dukungan,

xiii

11. Sahabat-sahabat terbaikku, Fauziyyah Mu’min Shiddiq, S.Si, Putri Heriyani Utami, S.Si, Widya Afriliani, S.Si, Lailatul Hasanah, S.Si atas persaudaraan, kebersamaan, kehangatan dalam suka maupun duka yang telah dilewati bersama penulis.

12. Dimas Pajar Kasih, S.E. atas dukungan dan motivasinya untuk tetap tenang dan optimis menghadapi semuanya.

13. Teman-teman seperjuanganku Fajria Faiza, S.Si, Sifa Kusuma Wardani, S.Si, Nur Robiah, S.Si, atas bantuan, dukungan, kepedulian dan kebersamaannya.

14. Kakak sekaligus teman terbaikku Desi Puspita Sari, A.md. Keb. atas bantuannya sehingga skripsi ini dapat terselesaikan.

15. Purna Pirdaus, S.Si, Diah Astika Winahyu, M.Si dan Yulistia Anggraini, S.Si atas bantuan, saran, motivasi, arahan kesabaran dan ilmu yang diberikan selama penulis melakukan penelitian dan menyelesaikan pembuatan skripsi ini.

16. Teman-teman Chemut (Kimia 2010), Martha Selvina Gultom, Rini

Handayani, Sevina Silvi, Silvana Maya P, Chyntia Gustianda .P, Putri Sari Dewi, Juni Zulhijah, Lolita Napatilova A.K, Desi Meriyanti, Rahmat

Kurniawan, Hapin Afriyani, Hanif Amrulloh Z.A, Muhammad Prasetio Ersa, Kristi Arina, Ariyanti, Adetia Fatmawati, Leni Astuti, Funda Elisyia, Faradilla Syani, Rani Anggraini, Surtini Karlina .S, M. Nurul Fajri, Agung Supriyanto, Yussi Fitria, Ucep Syaifullah, dan Maria Anggraini, terima kasih untuk persaudaraan, cerita, dan kenangan yang dibina selama menempuh pendidikan di kampus.

17. Keluarga besar Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi

Universitas Lampung atas pengalaman dan pembelajaran yang telah penulis dapatkan selama ini.

18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas dukungannya.

Semoga Allah SWT membalas atas kebaikan yang telah diberikan kepada penulis. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, akan tetapi penulis berharap semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amin.

Wassalamualaikum Wr. Wb.

Bandar Lampung, Oktober 2015 Penulis,

1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Berbagai penyakit degeneratif berkembang pesat seiring dengan perkembangan zaman dan umumnya disebabkan oleh radikal bebas. Penyakit yang sering dihubungkan dengan radikal bebas adalah penyakit jantung, kanker, katarak, dan menurunnya fungsi ginjal. Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari molekul atau sel lain. Radikal bebas dapat dihasilkan dari hasil metabolisme tubuh dan faktor eksternal seperti asap rokok, sinar ultraviolet, zat kimiawi dalam makanan, dan polutan lain. Untuk mencegah efek radikal bebas yang berlebih di dalam tubuh maka diperlukan asupan suplemen yang mempunyai efek sebagai antioksidan (Winarsi, 2007).

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menangkal radikal bebas dan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan. Senyawa ini mampu menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif, sehingga dapat menghambat kerusakan sel. Sumber antioksidan dapat berasal dari tanaman, bakteri, dan mikroalga (Winarsi, 2007).

MikroalgaDunaliellasp. merupakan salah satu hasil laut yang memiliki potensi antioksidan yang tinggi. Hasil penelitian ditemukan bahwaDunaliella salina

mengandung senyawa fenol yang mudah teroksidasi dan memiliki fungsi sebagai antioksidan. Mikroalga merupakan mikroorganisme dengan tingkat organisasi selnya termasuk dalam tumbuhan tingkat rendah, yang dikelompokkan ke dalam filum Thallophyta, karena tidak memiliki akar, batang, dan daun sejati (Lestari dkk., 2009).

Metode voltammetri dapat digunakan untuk setiap spesi yang memiliki potensial oksidasi atau reduksi seperti antioksidan yang dengan mudah dapat mengalami oksidasi. Metode voltammetri didasarkan pada pengukuran arus yang timbul dari oksidasi atau reduksi pada permukaan elektroda setelah penerapan variabel potensial (Smyth, 1992) . Metode ini mencakuplinear sweep voltammetry(LSV),

cyclic voltammetry(CV),differential pulse voltammetry(DPV),square-wave voltammetry(SWV),anodic or cathodic stripping voltammetry(ASV dan CSV),

adsorptive stripping voltammetry(AdSV), danelectrochemical immunoassay

(Wang, 1989).

Dalam bidang elektrokimia, telah diterapkan pendekatan yang lebih efektif dan efisien untuk penentuan aktivitas antioksidan dengan merekam arus reduksi oksigen menggunakan elektroda film merkuri atau elektrodaglassy carbon. Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan uji aktivitas antioksidan dalam asam askorbat, asam sitrat, glukosa, dan ektrak teh hijau menggunakan teknik

3

asam askorbat, asam sitrat , glukosa, dan ekstrak teh hijau masing-masing adalah 0,50; 0,18; 0,32; 0,45 (Korotkovaet al., 2002).

Namun, pada penelitian tersebut hanya dilakukan sebatas membandingkan aktivitas antioksidan dari beberapa sampel dan belum ada keterangan unjuk kerja metode analisisnya. Sehingga pada penelitian ini perlu dilakukan validasi dari metode yang digunakan .

Validasi metode merupakan sebuah proses yang penting dari program jaminan mutu hasil uji dimana sifat-sifat dari sebuah metode ditentukan dan dievaluasi secara obyektif. Hal ini sesuai dengan sistem manajemen mutu standar nasional Indonesia-17025 (SNI-17025) tahun 2005 mengharuskan laboratorium pengujian dalam menganalisis bahan menggunakan metode pengukuran yang valid (Huber, 2001).

Pada penelitian ini, ekstrak Dunaliellasp. dianalisis potensi antioksidannya dan dibandingkan dengan standar asam akorbat murni secara voltammetri. Arus reduksi oksigen yang dihasilkan akan semakin berkurang seiring dengan

bertambahnya konsentrasi antioksidan. Perbandingan antara arus reduksi oksigen dengan luas permukaan elektroda yang digunakan akan diperoleh nilai densitas arus reduksi oksigen. Dengan menggunakan hubungan antara densitas arus reduksi oksigen dengan konsentrasi antioksidan, maka nilai koefisien aktivitas antioksidan dapat ditentukan. Selain itu, akan dilakukan validasi metode analisis dengan beberapa parameter seperti: akurasi, presisi, linearitas, dan batas deteksi. Diharapkan pada penelitian ini akan diperoleh metode analisis yang valid, cepat, sederhana, dan biaya yang relatif murah.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini memiliki tujuan sebagai berikut:

1. Memperoleh metode dan informasi unjuk kerja metode analisis aktivitas antioksidan pada fraksi air dariDunaliellasp. dengan tekniklinear sweep voltammetry.

2. Menentukan koefisien (K) aktivitas antioksidan dari asam askorbat

C. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai metode analisis aktivitas antioksidan pada fraksi air dariDunaliellasp. menggunakan teknik

linear sweep voltammetryyang tervalidasi.

D. Hipotesis Penelitian

Hipotesis dari penelitian ini, yaitu:

1. Semakin tinggi konsentrasi antioksidan, nilai respon arus reduksi oksigen semakin kecil.

2. Antioksidan memiliki kemampuan meredam aktivitas radikal bebas superoksida

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Analisis Elektrokimia Dengan Metode Voltammetri

Voltammetri merupakan salah satu teknik dalam analisis elektrokimia.

Voltammetri adalah elektrolisis dalam ukuran skala mikro dengan menggunakan mikro elektroda kerja, disebut juga teknik arus voltase. Potensial dari mikro elektroda kerja divariasikan dan arus yang dihasilkan dicetak sebagai fungsi dari potensial. Hasil cetakan ini disebut voltammogram. Voltammetri berkembang pesat dibandingkan dengan metode analisis lain, hal ini dikarenakan kelebihan dalam sensitifitas, selektifitas, kesederhanaan, dan kemudahan dalam melakukan analisis (Haryadi, 1993).

Voltammetri mempelajari hubungan voltase arus-waktu selama elektrolisis dilakukan dalam suatu sel, dimana suatu elektroda mempunyai luas permukaan yang relatif besar dan elektroda yang lain (elektroda kerja) mempunyai luas permukaan yang sangat kecil sehingga seringkali dirujuk sebagai mikro

elektroda, lazimnya teknik ini mencakup pengkajian pengaruh perubahan voltase pada arus yang mengalir di dalam sel. Mikro elektroda ini biasanya dibuat dari bahan tak reaktif yang menghantar listrik seperti: emas, platinum atau karbon, dan dalam beberapa keadaan dapat digunakan suatu elektroda tetes merkuri (D.M.E), untuk kasus istimewa ini teknik itu dirujuk sebagai polarografi.

Voltammetri merupakan metoda elektrokimia yang mengamati perubahan arus dan potensial. Potensial divariasikan secara sistematis, sehingga zat kimia tersebut mengalami oksidasi dan reduksi di permukaan elektroda. Dalam voltammetri, salah satu elektroda pada sel elektrolitnya terpolarisasi. Proses pada sistem tersebut diikuti dengan kurva arus tegangan. Metode ini umum digunakan untuk menentukan komposisi dan analisis kuantitatif larutan (Liadler, 1996).

Dalam voltammetri digunakan tiga elektroda yang dicelupkan dalam larutan elektrolit. Yang pertama adalah elektroda kerja, elektroda ini memiliki berbagai bentuk dan ukuran tergantung penggunaannya. Biasanya berbentuk pelat kecil atau piringan kecil konduktor yang dipres dan diletakkan dalam batang (rod) material inert, misalnya teflon. Konduktor yang biasa digunakan adalah logam inert, seperti platina, emas,glassy carbonatau grafit, maupun logam yang dilapisi oleh raksa. Elektroda kerja berfungsi sebagai tempat terjadinya reaksi oksidasi atau reduksi, yang menunjukkan respon terhadap analit yang dianalisa. Elektroda kedua merupakan elektroda referensi (biasanya berupa kalomel jenuh atau Ag/AgCl), yang memiliki potensial tetap selama eksperimen berlangsung. Elektroda yang ketiga disebut elektroda pembantu. Elektroda ini berupa kawat platinum yang fungsinya untuk mengalirkan listrik yang berasal dari sumber sinyal melalui larutan menuju elektroda kerja (Skooget al., 1998).

Arus akan mengalir ketika potensial pada elektroda kerja cukup negatif untuk terjadinya reaksi reduksi, atau potensial cukup positif untuk terjadinya reaksi oksidasi. Pada potensial dimana arus mulai mengalir berhubungan dengan Eo

7

untuk tiap pasangan reaksi, hal ini disebut sinyal analitik kualitatif. Besarnya arus berhubungan dengan konsentrasi analit yang bereaksi pada elektroda, ini disebut sinyal analitik kuantitatif. Ada tiga mekanisme aliran arus yang muncul pada sistem, yaitu :

1. Konveksi, yaitu aliran arus yang disebabkan oleh pengadukan.

2. Migrasi, yaitu arus yang timbul akibat adanya tarik-menarik elektrostatik antara muatan elektroda dengan muatan ion-ion analit.

3. Difusi, yaitu aliran arus yang berhubungan dengan gradien konsentrasi. Analit akan mengalir secara spontan dari daerah konsentrasi tinggi menuju ke konsentrasi rendah.

Arus konveksi dapat diminimalkan dengan cara menghilangkan pengadukan dan pengukuran dilakukan pada temperatur yang tetap. Arus migrasi tidak dapat dihindari, karena ketika arus mengalir, muatan harus dibawa melalui larutan. Jika suatu garam inert dengan konsentrasi tinggi ditambahkan dalam larutan, misalnya KCl, maka muatan akan dibawa oleh ion garam ini, sehingga arus migrasi dapat diminimalkan. Garam inert yang ditambahkan disebut elektrolit pendukung, harus memiliki konsentrasi 50 sampai 100 kali lebih tinggi dari konsentrasi analit. Arus yang berhubungan dengan reaksi analit adalah arus difusi (Kennedy, 1990). Pada potensial tertentu larutan elektrolit pendukung mengalami proses oksidasi-reduksi. Dengan adanya proses ini akan

mempengaruhi voltammogram yang dihasilkan. Oleh karena itu, diperlukan daerah potensial tertentu untuk menghindari interferensi dari larutan elektrolit pendukung (Skooget al., 1998).

B. Linear Sweep Voltammetry(LSV)

Linear sweep voltammetryadalah istilah umum suatu teknik voltammetri dimana potensial yang diberikan pada elektroda kerja dengan variasi waktu linear. Metode ini juga mencakup polarografi, voltammetri siklik, dan voltammetri disk rotasi.Slopeyang dihasilkan dari metode ini memiliki unit potensial (volt) per satuan waktu, biasanya disebut laju selusur percobaan. Nilai dari laju selusur percobaan dapat divariasi dari tingkat rendah mV/detik (khusus untuk polarografi) sampai tingkat tinggi 1.000.000 V/detik (tercapai bila

digunakan ultra mikro elektroda sebagai elektroda kerja). Dengan jalur linear potensial, arus faraday ditemukan untuk menaikkan laju selusur yang lebih tinggi.

Dalam voltammetri pemindaian linear (linear sweep voltammetry, LSV),

pemindaian dilakukan dari batas potensial yang lebih rendah menuju yang lebih tinggi. KarakteristikLSVtergantung pada laju reaksi transfer elektron,

reaktivitas kimia dari spesi-spesi elektroaktif, dan laju pemindaian potensial (Wang, 2001).

Pada LSV, potensial dari elektroda indikator bervariasi secara linear sebagai fungsi dari waktu.Slopeyang dihasilkan dari metode ini memiliki unit potensial (volt) per satuan waktu, dan biasanya disebut scan rate percobaan.Tingkat pengukuran relatif lambat, yaitu < 5 mV/detik, yang memungkinkan waktu bagi analit untuk sampai ke elektroda sehingga elektroda selalu dalam kesetimbangan dengan larutan induk. LSV memberikan informasi kualitatif dan kuantitatif. Nilai E1/2dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesi yang tidak diketahui,

sedangkan ketinggia Voltammogramline

selusur tunggal.

(a) Gambar 1. (a) Laju s (Andrienko, 2008).

Gambar 1(a) menunj

voltammetrydengan pot merupakan voltamm potensial (Ep). Kara faktor, yaitu:

1. Reaktivitas kim 2. Laju selusur tega

Dalam pengukuran L Pemindaian dimulai yang mengalir. Sepa kanan (ke nilai yang puncaknya. Untuk m

ggian dari arus dapat digunakan untuk menentuka

near sweepterdapat dalam Gambar 1 yang terc

(b)

ju selusur tunggal dan (b) Voltammogramlinear sw

).

nunjukkan laju selusur tunggal yang terjadi pada gan potensial sebagai fungsi dari waktu dan gam

mogramlinear sweepdengan arus sebagai fun arakteristik voltammogramlinear sweeptergant

s kimia dari spesi elektroaktif egangan

n LSV, respon arus diplotkan sebagai fungsi te ulai dari sisi kiri arus / plot tegangan dimana bel

panjang jendela potensial, pemindaian lebih lanj ng lebih reduktif) dan arus mulai mengalir kem uk memberi alasan perilaku ini, perlu mempertim

9

ukan konsentrasi. ercatat pada laju

near sweep

dalinear sweep

ambar 1(b) ungsi dari antung pada 2

tegangan

belum adanya arus h lanjut ke arah

emudian mencapai timbangkan

pengaruh tegangan pa transfer elektron dini tegangan. Oleh kare elektroda identik de

Bentuk yang tepat da mempertimbangkan e pemindaian awal da mengalir. Arus meni sehingga posisi kese terjadi, karena di be fluks reaktan ke elekt Nernst. Dalam hal ini dalam tahap penguku voltammogramlinear sw

Gambar

Gambar 2 menunjukka puncak potensial da

n pada tetapan keseimbangan di permukaan ele on dinilai cepat dalam perbandingan dengan laju pe

rena itu, tetapan kesetimbangan pada sebuah pe k dengan prediksi termodinamika.

t dari voltammogram dapat dirasionalisasi denga an efek tegangan dan transportasi massa. Sebag dari V1, keseimbangan di permukaan mulai ber eningkat karena tegangan memindai jauh dari ni kesetimbangan bergeser lebih jauh ke arah kanan. beberapa titik lapisan difusi berada di atas elekt

lektroda tidak cukup cepat untuk memenuhi pe l ini kondisi arus mulai turun sama seperti yang ukuran potensial. Gambar 2 menunjukkan seran

near sweepyang direkam pada laju selusur yan

bar 2. Perubahan konstanta laju (Andrienko, 2008

nunjukkan laju selusur yang berbeda mempengaruhi dan total meningkatnya arus bersamaan dengan m

elektroda. Laju u pemindaian h permukaan

ngan

bagai tegangan berubah dan mulai

i nilai awalnya nan. Puncaknya ektroda sehingga persamaan ng dilakukan rangkaian ang berbeda. 2008). uhi perbedaan gan meningkatnya

11

laju selusur. Hal ini dapat dirasionalkan dengan mempertimbangkan ukuran lapisan difusi dan waktu yang dibutuhkan untuk merekam laju. Jelas bahwa voltammogramlinear sweepakan membutuhkan waktu lebih lama untuk merekam penurunan laju selusur. Oleh karena itu, ukuran lapisan difusi di atas permukaan elektroda akan berbeda tergantung pada laju selusur tegangan yang digunakan. Dalam pemindaian tegangan lambat, lapisan difusi akan bertambah jauh dari elektroda dibandingkan dengan pemindaian cepat. Akibatnya fluks pada permukaan elektroda jauh lebih kecil pada laju selusur lambat daripada laju selusur yang lebih cepat.

C. Validasi Metode

Validasi metode adalah suatu proses untuk mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis yang dilakukan untuk pengujian tertentu sesuai dengan tujuan yang diharapkan. Validasi metode diperlukan untuk menilai kualitas, tingkat kepercayaan(reliability), dan konsistensi hasil analisis (Huber, 2001).

Laboratorium harus memvalidasi metode tidak baku, metode yang didesain atau dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan, dan penegasan serta modifikasi dari metode baku untuk

mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan (Hadi, 2007). Pemilihan parameter validasi tergantung pada beberapa faktor seperti: aplikasi, sampel uji, tujuan metode, dan peraturan lokal atau

ketelitian, spesifisitas, limit deteksi, limit kuantisasi, linearitas, rentang,

robustness, danruggedness(ICH, 1996).

1. Ketepatan(accuracy)

Akurasi atau ketepatan adalah ukuran yang menunjukan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dapat juga menyatakan kedekatan dengan nilai yang dapat diterima, baik nilai sebenarnya maupun nilai pembanding. Nilai benar dalam akurasi dapat diperoleh dengan beberapa cara. Salah satu alternatifnya adalah membandingkan hasil metode dengan hasil dari metode referensi yang sudah ditetapkan. Pendekatan ini mengasumsikan bahwa ketidakpastian metode referensi diketahui. Akurasi dapat dinilai dengan

menganalisis sampel yang sudah diketahui konsentrasi (standar) dan membandingkan nilai terukur dengan nilai sebenarnya. Akurasi dapat

menentukan adanya bias yang terdapat pada sampel dengan melakukan uji bias Uji bias dapat diketahui dengan persamaan 1.

µ - xt

= ±

(1)

Keterangan :

µ : nilai benar dari referensi material xt : rata-rata terukur referensi material

t : nilai dari tabel t dengan tingkat kepercayaan yang diinginkan SD : simpangan baku

n : jumlah pengulangan

Jika µ - xt > ± , maka ada bias terbukti. Begitu sebaliknya maka tidak ada bias hasil pengukuran (Nurhadi, 2012).

13

Akurasi juga dapat diketahui dengan melakukan uji perolehan kembali (recovery). Hasil uji akurasi ini dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan pada sampel. Perhitungan perolehan kembali dapat ditetapkan dengan persamaan 2 (Eurachem, 2014).

R (%) =(x

′ _x)

X x 100 (2)

Keterangan:

x′ : konsentrasi rata-rata sampel yang ditambahkan standar x : konsentrasi rata-rata sampel tanpa penambahan standar

xspike

: konsentrasi standar yang ditambahkan ke dalam sampel

Rentang nilai penerimaan kecermatan suatu metode akan bervariasi sesuai kebutuhannya. Tabel 1 menjelaskan tentang data persentaserecoveryyang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi analit.

Tabel 1. Persentaserecoveryyang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi analit

(%) analit Unit Rata-ratarecovery(%)

100 100% 98-102

10 10% 95-102

1 1% 97-103

0,1 0,10% 95-105

0,01 100 ppm 90-107

0,001 10 ppm 80-110

0,0001 1 ppm 80-110

0,00001 100 ppb 80-110

0,000001 10 ppb 60-115

0,0000001 1 ppb 40-120

2. Kecermatan (precision)

Presisi prosedur analisis menggambarkan kedekatan kesepakatan (derajat penyebaran) antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari beberapa pengambilan sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang ditentukan. Presisi dapat dipertimbangkan pada tiga tingkatan, yaitu: pengulangan, presisi

intermediate, dan reproduksibilitas. Simpangan baku, simpangan baku relatif (koefisien variasi), dan interval kepercayaan harus dilaporkan untuk penentuan nilai presisi (EMEA, 1995).

Cara yang terbaik untuk mengevaluasi ketelitian dari data analisis adalah dengan menghitung simpangan baku. Simpangan baku mengukur penyebaran data-data percobaan dan memberikan indikasi yang bagus mengenai seberapa dekat data tersebut satu sama lain (Nielsen, 2003). Simpangan baku dapat dihitung dengan persamaan 3.

= ( )

1 (3)

Cara lain untuk mengukur ketelitian adalah dengan menghitung nilai simpangan baku relatif (RSD). Nilai RSD ini merupakan nilai simpangan baku yang

dinyatakan sebagai persentase dari rata-rata. RSD dapat dihitung dengan persamaan 4.

15

%RSD = SD

x x 100% (4)

Keterangan :

SD : simpangan baku

xi : nilai yang diperoleh setiap ulangan : nilai rata-rata

RSD : simpangan baku relatif

3. Linearitas

Linearitas metode analisis menunjukkan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji, baik yang langsung maupun dengan definisi transformasi matematis yang baik, proporsional dengan konsentrasi analat dalam sampel pada range tertentu. Linearitas dapat diuji secara informal dengan membuat plot residual yang dihasilkan oleh regresi linear pada respon konsentrasi dalam satu seri kalibrasi (Thompson, 2002). Dalam penentuan linearitas, sebaiknya

menggunakan minimum lima konsentrasi. Rentang penerimaan linearitas tergantung dari tujuan pengujian. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah sebesar≥ 0,99970 (ICH, 1996),≥0,97 (SNI),≥ 0,9980

(AOAC, 2002), atau≥ 0,99 (EMEA, 1995).

4. Batas Deteksi

Batas deteksi merupakan jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat dideteksi tetapi tidak harus kuantitatif sebagai nilai yang pasti (EMEA, 1995). Batas deteksi (LOD) dapat ditentukan dengan persamaan 5.

LOD = 3 x SD (5) Keterangan :

LOD : batas deteksi (limit of detection)

SD : simpangan baku hasil pengukuran (Eurachem, 2014).

D. Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang diperlukan tubuh untuk menangkap radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak. Antioksidan dalam tubuh bermanfaat untuk mencegah reaksi oksidasi yang ditimbulkan oleh radikal bebas baik berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya (Kikuzaki and Nakatani, 1993).

Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi 2, yaitu: 1. antioksidan enzimatis

2. antioksidan non enzimatis yang berupa mikronutrien.

Antioksidan enzimatis dapat dibentuk dalam tubuh, sepertisuper oksida dismutase(SOD),glutation peroksida, katalase, danglutation reduktase. Sedangkan antioksidan non enzimatis yang berupa mikronutrien masih dibagi dalam 2 kelompok lagi, yaitu:

1. Antioksidan larut lemak, seperti: tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirium

2. Antioksidan larut air, seperti: asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme.

17

Berdasarkan fungsinya, antioksidan dapat dibagi menjadi 4 tipe, yaitu: 1. Tipe pemutus rantai reaksi pembentuk radikal bebas, dengan

menyumbangkan atom H, misalnya vitamin E

2. Tipe pereduksi, dengan mentransfer atom H atau oksigen, atau bersifat

scavenger, misalnya asam askorbat

3. Tipe pengikat logam, mampu mengikat zat peroksidan, seperti Fe2+dan Cu2+, misalnya flavonoid

4. Antioksidan sekunder, mampu mendekomposisi hidroperoksida menjadi bentuk stabil, pada manusia dikenalsuper oksida dismutaseSOD, katalase, danglutation peroksidase(Hariyatmi, 2004).

E. Radikal Bebas

Secara teoritis radikal bebas adalah bahan kimia yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada lapisan luarnya, sehingga berusaha melengkapi dengan 2 cara, yaitu:

1. Menambah atau mengurangi elektron untuk mengisi maupun mengosongkan lapisan luarnya

2. Membagi elektron-elektronnya dengan cara bergabung bersama atom yang lain dalam rangka melegkapi lapisan luarnya.

Radikal bebas sangat reaktif dan mudah bereaksi dengan berbagai molekul lain, seperti protein, lemak, karbohidrat, dan DNA. Radikal bebas tidak dapat

mempertahankan bentuk asli dalam waktu lama dan segera berikatan dengan bahan sekitarnya, dengan cara menyerang molekul stabil yang terdekat dan mengambil elektron, zat yang terambil elektronnya akan menjadi radikal bebas

juga sehingga akan memulai suatu reaksi berantai, yang akhirnya dapat merusak sel. Radikal bebas dapat terbentuk secara in-vivo dan in-vitro dengan 3 cara, yaitu:

1. Pemecahan satu molekul normal secara homolitik menjadi dua, ini

memerlukan tenaga yang tinggi dari sinar ultraviolet, panas, dan radiasi ion 2. Kehilangan satu elektron dari molekul normal

3. Penambahan elektron pada molekul normal.

Radikal bebas terpenting adalah kelompok oksigen reaktif (reactive oxygen species/ROS), termasuk didalamnya adalah triplet (3O2), tunggal (singlet/1O), anion superoksida (O2●-), radikal hidroksil (OH●-), nitrit oksida (NO●-), peroksinitrit (ONOO), asam hipoklorus (HOCl), hidrogen peroksida (H2O2) radikal alkosil (LO●-), dan radikal peroksil (LO●-2). Radikal bebas yang

mengandung karbon (CCl3●-) yang berasal dari oksidasi radikal molekul organik dan radikal hidrogen hasil dari penyerangan atom H (H●-). Bentuk lain adalah radikal sulfur yang diproduksi pada oksidasi glutation menghasilkan radikal thiyl (RS●), radikal yang mengandung nitrogen, dan radikal fenyldiazin (Inoue, 2001; Albina and Reichner, 1998).

F. Asam askorbat

Asam askorbat adalah salah satu zat gizi yang berperan sebagai antioksidan dan efektif mengatasi radikal bebas yang dapat merusak sel atau jaringan, termasuk melindungi lensa dari kerusakan oksidatif yang ditimbulkan oleh radiasi (Taylor, 1993). Berdasarkan kelarutannya asam askorbat termasuk antioksidan hidrofilik

19

dimana tidak terakumulasi dalam tubuh tetapi diekskresikan dengan cepat. Asam askorbat (L-ascorbic acid) merupakan vitamin yang bersifat larut dalam air dan sangat efektif sebagai antioksidan penting dalam cairan ekstraseluler. Asam askorbat sangat efisien dalam menangkap beberapa senyawa seperti superoksida, hidrogen peroksida, radikal hidroksi dan radikal peroksil (Sies and Stahl, 1995). Asam askorbat mudah sekali terdegradasi oleh cahaya, temperatur, dan udara yang menyebabkan penurunan kadar asam askorbat. Struktur asam askorbat mirip dengan struktur monosakarida, tetapi mengandung gugus enediol seperti yang disajikan pada Gambar 3. Pada asam askorbat terdapat gugus enediol yang berfungsi dalam sistem pemindahan hidrogen yang menunjukkan peranan penting dari vitamin ini.

Gambar 3. Formula struktur kimia dari asam askorbat (Hadi, 2011)

Asam askorbat mudah dioksidasi menjadi bentuk L-dehidroaskorbat, keduanya secara fisiologis aktif dan ditemukan di dalam tubuh. Mekanisme oksidasi asam askorbat disajikan pada Gambar 4.

Gambar 4. Mekanisme oksidasi asam askorbat (Winarno, 1984).

Pada Gambar 4 merupakan mekanisme oksidasi asam askorbat. Asam askorbat dapat dioksidasi menjadi asam L-dehidroaskorbat terutama jika terpapar cahaya, pemanasan, dan suasana alkalis. Asam L-dehidroaskorbat secara kimia sangat labil dan mengalami perubahan lebih lanjut menjadi asam L-diketogulonat yang tidak memiliki keaktifan sebagai asam askorbat lagi (Thurnhamet al., 2000).

G. Mikroalga

Mikroalga merupakan organisme perairan atau lebih dikenal dengan fitoplankton (alga laut bersel tunggal). Organisme ini dapat melakukan

fotosintesis dan hidup dari nutrien anorganik serta menghasilkan zat-zat organik dari CO2oleh fotosintesis. Mikroalga mempunyai zat warna hijau daun

(pigmen) klorofil yang berperan pada proses fotosintesis dengan bantuan H2O, CO, dan sinar matahari untuk menghasilkan energi. Energi ini digunakan untuk biosintesis sel, pertumbuhan dan pertambahan sel, bergerak atau berpindah, dan reproduksi (Pranayogi, 2003). Mikroalga dapat tumbuh dimana saja, baik di

21

ekosistem perairan maupun di ekosistem darat. Faktor-faktor yang

mempengaruhi pertumbuhan mikroalga, diantaranya faktor abiotik (cahaya matahari, temperatur, nutrisi, O2, CO, pH, salinitas), faktor biotik (bakteri, jamur, virus, dan kompetisi dengan mikroalga lain), dan faktor teknik cara pemanenan. Mikroalga dapat tumbuh dengan sangat cepat pada kondisi iklim yang tepat. Umumnya, mikroalga menduplikasikan diri dalam jangka waktu 24 jam atau bahkan 3,5 jam selama fasa pertumbuhan eksponensial (Chisti, 2007).

1. Faktor-faktor Pertumbuhan Mikroalga a. Unsur Hara

Unsur hara yang dibutuhkan mikroalga terdiri atas unsur hara makro (N, P, K, S, Fe, Mg, Si, dan Ca) dan unsur hara mikro (Mn, Zn, Co, Bo, Mo, B, Cu, dan lain-lain). Setiap unsur hara mempunyai fungsi-fungsi khusus yang ditunjukkan pada pertumbuhan dan kepadatan yang dicapai. Unsur N, P, dan S penting untuk pembentukan protein. Nitrogen yang dibutuhkan untuk media kultur dapat diperoleh dari KNO3, NaNO3, NHCl, dan lain-lain. Fosfor juga

merupakan bahan dasar pembentuk asam nukleat, enzim, dan vitamin. Unsur fosfor dapat diperoleh dari KH2PO4, NaH2PO4, Ca3PO4dan unsur sulfur dapat diperoleh dari NH4SO4, CuSO4 (Tjahjo dkk., 2002). Unsur K berfungsi dalam metabolisme karbohidrat dan juga sebagai kofaktor untuk beberapa koenzim. Unsur kalium dapat diperoleh dari KCl, KNO3, KH2PO4. Unsur Fe berperan dalam pembentukan klorofil dan sebagai komponen esensial dalam proses oksidasi. Unsur ini dapat diperoleh dari FeCl4, FeSO4, FeCaH5O. Unsur Si dan

Ca merupakan bahan untuk pembentukan dinding sel atau cangkang. Vitamin B7 banyak digunakan untuk memacu pertumbuhan melalui rangsangan

fotosintetik (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Unsur hara mikro dibutuhkan untuk menjalankan berbagai fungsi dalam pertumbuhan mikroalga, misalnya Mn dan Zn diperlukan untuk fotosintesis, unsur Mo, Bo, Co diperlukan untuk

metabolisme nitrogen, serta unsur Mn, B, Cu untuk fungsi metabolik lainnya (Krisanti, 2003). Unsur hara mikro dibutuhkan dalam jumlah kecil tetapi harus ada dan untuk menstabilkan fungsi hara mikro biasanya ditambahkan senyawa sitrat atau EDTA (Kabinawa, 1994).

b. Cahaya

Mikroalga merupakan organisme autotrof yang mampu membentuk senyawa organik dari senyawa anorganik melalui proses fotosintesis. Keberadaan cahaya menentukan bentuk kurva pertumbuhan bagi mikroalga yang melakukan fotosintesis. Cahaya matahari dapat diganti dengan sinar lampu TL dan kisaran optimum intensitas cahaya bagi mikroalga antara 2000-8000 lux. Pada mikroalga hijau, pigmen yang menyerap cahaya adalah klorofil a,

disamping pigmen lain seperti karotenoid dan xantofil (Tjahjo dkk.,2002).

c. Suhu

Suhu secara langsung mempengaruhi efesiensi fotosintesis dan faktor yang menentukan dalam pertumbuhan. Pada kondisi laboratorium, perubahan suhu air dipengaruhi oleh temperatur ruangan dan intensitas cahaya. Suhu optimum

23

untuk kultur mikroalga di laboratorium antara 25-32 ºC (Fogg, 1975). Kenaikan temperatur akan meningkatkan kecepatan reaksi. Umumnya setiap kenaikan 10 ºC dapat mempercepat reaksi 2-3 kali lipat. Akan tetapi, temperatur tinggi yang melebihi temperatur maksimum akan menyebabkan proses metabolisme sel terganggu.

d. pH

Proses fotosintesis mengambil karbondioksida terlarut dari dalam air, yang berakibat penurunan kandungan CO terlarut di air. Penurunan ini akan meningkatkan pH berkaitan dengan kesetimbangan CO2terlarut, bikarbonat (HCO3-), dan ion karbonat (CO32-) dalam air. Oleh karena itu, laju fotosintesis akan terbatas oleh penurunan karbon dalam hal ini karbondioksida (Krisanti, 2003). Umumnya pH optimum bagi pertumbuhan mikroalga adalah 8-8,5.

e. Salinitas

Fluktuasi salinitas secara langsung menyebabkan perubahan tekanan osmosis di dalam sel mikroalga. Salinitas yang tinggi atau rendah dapat

menyebabkan tekanan osmosis di dalam sel juga menjadi lebih rendah atau lebih tinggi, sehingga aktivitas sel menjadi terganggu. Hal ini dapat mempengaruhi pH sitoplasma sel dan menurunkan kegiatan enzim di dalam sel. Salinitas optimum bagi pertumbuhan mikroalga antara 25-35 ‰ (Tjahjodkk., 2002).

f. Aerasi

Aerasi dibutuhkan untuk mencegah terjadinya sedimentasi pada sistem kultivasi mikroalga, selain itu juga untuk memastikan bahwa semua sel mikroalga

mendapat cahaya dan nutrisi yang sama, untuk menghindari stratifikasi suhu dan tercampurnya air dengan suhu berbeda, terutama pada kultivasi di luar

laboratorium, dan untuk meningkatan pertukaran cahaya antara medium kultivasi dan udara. Udara merupakan sumber karbon untuk fotosintesis dalam bentuk karbon dioksida (CO2). Untuk kultivasi yang sangat padat, CO2yang berasal dari udara (0,003% CO2) tidak mencukupi bagi pertumbuhan optimal mikroalga, sehingga perlu ditambahkan dengan CO2 murni (rata-rata 1% dari volume udara). Penambahan CO2selanjutnya menjadi pH buffer sebagai hasil dari kesetimbangan gas karbon dioksida (CO2) dan asam karbonat (HCO3). Gas CO2yang masuk ke perairan akan berubah bentuk menjadi asam karbonat (HCO3) bergantung dari derajat keasaman (pH) air. Derajat keasaman yang optimum dapat melarutkan CO2adalah pada kisaran 6,5-9,5. Jika pH di bawah kisaran tersebut, maka karbon dioksida tetap berbentuk CO2,artinya dapat cepat lepas ke atmosfer sehingga tidak terserap oleh mikroalga. Sebaliknya, apabila kondisi pH di atas kisaran tersebut, maka CO2menjadi bikarbonat yang tidak dapat diserap oleh mikroalga. Perlu diperhatikan, bahwa tidak semua alga dapat mentoleransi aerasi yang kuat, karena proses pengadukan yang terlalu kencang dapat mengakibatkan rusaknya sel mikroalga sehingga mikroalga menjadi mati.

25

2. Pola Pertumbuhan Mikroalga

Pertumbuhan mikroalga dalam kultur dapat ditandai dengan bertambah besarnya ukuran sel atau bertambah banyaknya jumlah sel. Pertumbuhan mikroalga dalam kultur sangat dipengaruhi oleh kondisi aerasi, cahaya, nutrisi, dan suhu. Pertumbuhan mikroalga dibagi dalam lima fase pertumbuhan, yaitu: fase lag, fase logaritmik atau eksponensial, fase penurunan laju pertumbuhan, fase stasioner, dan fase kematian (Fogg, 1975).

a. Fase Lag

Fase ini disebut juga sebagai fase adaptasi, karena sel mikroalga sedang beradaptasi terhadap media tumbuhnya. Fase ini ditandai dengan peningkatan populasi yang tidak nyata. Lamanya fase lag tergantung pada umur inokulum yang dimasukkan. Sel-sel yang diinokulasikan pada awal fase log akan

mengalami fase lag yang singkat. Inokulum yang berasal dari kultur yang sudah tua akan mengalami fase lag yang lama, karena membutuhkan waktu untuk menyusun enzim-enzim yang tidak aktif. Ukuran sel pada fase lag ini pada umumnya meningkat. Organisme mengalami metabolisme, tetapi belum terjadi pembelahan sel sehingga kepadatan sel belum meningkat.

b. Fase Logaritmik atau Eksponensial

Pada fase ini akan diawali dengan pembelahan sel dan ditandai dengan naiknya laju pertumbuhan hingga kepadatan populasi meningkat. Laju pertumbuhannya meningkat dengan pesat dan selnya aktif berkembang biak. Ciri metabolisme

pada fase ini adalah tingginya aktivitas fotosintesis yang berguna untuk pembentukan protein dan komponen-komponen penyusun plasma sel yang dibutuhkan dalam pertumbuhan.

c. Fase Penurunan Laju Pertumbuhan

Fase ini ditandai dengan penurunan laju pertumbuhan. Selain itu, terjadi penurunan pertambahan populasi per satuan waktu bila dibandingkan dengan fase eksponensial sehingga fase ini disebut juga fasedecline.

d. Fase Stasioner

Pada fase ini, pertumbuhan mikroalga mengalami penurunan dibandingkan fase logaritmik. Laju reproduksi sama dengan laju kematian. Dengan demikian penambahan dan pengurangan jumlah mikroalga relatif sama atau seimbang sehingga kepadatannya tetap. Jumlah sel cenderung tetap diakibatkan sel telah mencapai titik jenuh.

e. Fase Kematian

Pada fase ini, kepadatan populasi sel mikroalga terus berkurang, sedangkan proses pertumbuhan mikroalga, secara skematik disajikan pada spada Gambar 5.

27

Gambar 5. Proses skematik pertumbuhan mikroalga pada: 1. fase lag, 2. fase logaritmik, 3. fase penurunan laju pertumbuhan, 4. fase stasioner, 5. fase kematian (Fogg, 1975).

H. Dunaliellasp.

Secara morfologi,Dunaliellasp. merupakan mikroalga yang bersifat uniseluler, mempunyai sepasang flagella yang sama panjangnya, sebuah kloroplas berbentuk cangkir, dan tidak memiliki dinding sel (Borowitzka and Borowitzka, 1988). Dunaliellasering juga disebut sebagai flagellata uniseluler hijau (green unicellulair flagellate). Bentuk selnya juga tidak stabil dan

beragam, dapat berbentuk lonjong, bulat silindris, dan ellip seperti pada Gambar 6. Hal ini sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, pertumbuhan, dan

intensitas sinar matahari (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Dunaliella

memiliki kisaran toleransi pH mulai dari pH 1 (Dunaliella acidophila) sampai pH 11 (Dunaliella salina), sedangkan kisaran toleransi suhu, mulai dari -35 ºC sampai 40 ºC (Borowitzka and Borowitzka, 1988). SpesiesDunaliellasp. dapat tumbuh optimal pada pH 6-6,5 dan kisaran suhu antara 22-25 ºC dengan

G

Gambar 6 merupaka

carotene globules, c globules.Dunaliella

kemampuannya untuk m dalam kosmetik dan supl Chlorophyceae (alga yang umumnya berupa bertahan hidup, orga untuk melindungi te tinggi untuk membe klasifikasi ilmiahDunal

Tabel 2. Klasifikasi i Tingkatan Kingdom Phylum Kelas Ordo Family Genus

(Sumber: Isnansetyo da

Gambar 6.Dunaliellasp.(Seambiotic, 2008) kanDunaliellasp. serta bagian-bagian selnya y

s, chloroplasts, mitokondria, vacuole, nucleus,da

lladiketahui memiliki aktivitas antioksidan, ka untuk menghasilkan sejumlah besar karotenoid , di k dan suplemen makanan.Dunaliellatermasuk ke

lga hijau) yang mengandung klorofil a dan b se erupa ß-karoten (Borowitzka and Borowitzka, 1988 , organisme ini memiliki konsentrasiβ- karoten y

terhadap cahaya yang kuat dan konsentrasi gli berikan perlindungan terhadap tekanan osmotik

Dunalielladisajikan pada Tabel 2. si ilmiahDunaliellasp.

Klasifikasi Plantae Chlorophyta Chlorophyceae Volvocales Polyblepharidaceae Dunaliella

tyo dan Kurniastuty, 1995).

, 2008).

a yang terdiri dari

us,danlipid

karena d , digunakan suk kelompok

n b serta karotenoid , 1988). Untuk

yang tinggi gliserol yang otik. Adapun

29

I. Pemanenan MikroalgaDunaliellasp.dengan Metode Sentrifugasi Pemanenan bertujuan untuk menyediakan stok biomasa dari mikroalga untuk tahap ekstraksi. Salah satu metode yang biasa dilakukan untuk pemanenan mikroalga adalah sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan proses pemisahan yang menggunakan gaya sentrifugal sebagaidriving forceuntuk memisahkan padatan dan cairan. Proses pemisahan ini didasarkan pada ukuran partikel dan perbedaan densitas dari komponen yang akan dipisahkan. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi secara efektif dapat memisahkan mikroalga dari cairan medianya. Tes laboratorium pada 500-1000 gr hasil kultivasi mikroalga dalam

pondmenunjukkan 80 - 90% mikroalga dapat dipisahkan dalam waktu 2-5 menit. Walaupun proses sentrifugasi efektif digunakan secara teknis, proses ini juga memiliki kelemahan terutama pada investasi alat dan biaya operasional yang tinggi (Chenet al., 2011).

J. Freeze-Dry

Biomassa alga yang tersisa setelah pemanenan dapat dikeringkan untuk memperpanjang masa kadaluarsa biomassa. Metode pengeringan yang digunakan untuk mikroalga termasuksun drying, drum drying, spray drying,

danfreeze-drying. Penggunaan metodesun drying padasampelDunalielladapat mengakibatkanβ-karoten lebih cepat terdegradasi. Sebaliknya,drum drying, spray drying, dan freeze-dryingmemberikan hasil yang memuaskan dalam hal stabilitas karotenoid (Ben-Amotzet al., 1988).Freeze-dryingpaling cocok

digunakan untuk skala laboratorium dibandingkan denganspray drying, karena dapat menghasilkan pemulihan karotenoid yang lebih tinggi.

Prinsip metodefreeze-dryingadalah pengeringan suspensi sel dari fase cair dengan cara sublimasi melalui proses pembekuan terlebih dahulu. Proses freeze-dryingdibagi ke dalam tiga tahap, yaitu:

a. Tahap pertama, yaitu proses pembekuan.

b. Tahap kedua, yaitu proses pengeringan primer melalui proses sublimasi pada suhu rendah, sehingga menyebabkan sebagian besar air tertarik dari suspensi beku sel.

c. Tahap ketiga, yaitu proses pengeringan sekunder pada suhu yang lebih tinggi dengan tujuan mengeringkan sisa air (Matejtschuk, 2007).

K. EkstraksiDunaliellasp. dengan Ultrasonikasi

Metode ultrasonik adalah metode yang menggunakan gelombang ultrasonik yaitu gelombang akustik dengan frekuensi lebih besar dari 16-20 kHz (Suslick, 1988). Ultrasonik bersifatnon-destructivedannon-invasive, sehingga dapat dengan mudah diadaptasikan ke berbagai aplikasi (McClements, 1995). Manfaat metode ekstraksi ultrasonik adalah untuk mempercepat proses ekstraksi

(Kuldiloke, 2002). Hal ini dibuktikan dengan penelitian tentang ekstraksi pati jagung yang menyebutkan rendemen pati jagung yang didapat dari proses ultrasonik selama 2 menit adalah sekitar 55,2-67,8 % hampir sama dengan rendemen yang didapat dari pemanasan dengan air selama 1 jam yaitu 53,4% (Cameron and Wang, 2006). Dengan penggunaan ultrasonik proses ektraksi

31

senyawa organik pada tanaman dan biji-bijian dengan menggunakan pelarut organik dapat berlangsung lebih cepat. Dinding sel dari bahan dipecah dengan getaran ultrasonik sehingga kandungan yang ada di dalamnya dapat keluar dengan mudah (Mason,1990).

Cara kerja metode ultrasonik dalam mengekstraksi yaitu dengan memanfaatkan gelombang ultrasonik yang terbentuk dari pembangkitan ultrason secara lokal dari kavitasi mikro pada sekeliling bahan yang akan diekstraksi sehingga terjadi pemanasan pada bahan tersebut, sehingga melepaskan senyawa ekstrak (Liuet al.,2010). Terdapat efek ganda yang dihasilkan, yaitu pengacauan dinding sel sehingga membebaskan kandungan senyawa yang ada di dalamnya dan pemanasan lokal pada cairan serta meningkatkan difusi ekstrak (Keil, 2007).

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Desember 2014 sampai bulan Juni 2015 di UPT. Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas merk pyrex (labu ukur ukuran 25 mL 1 buah, labu ukur ukuran 5 mL 9 buah, labu ukur ukuran 10 mL 3 buah, pipet ukur ukuran 1mL 1 buah dan ukuran 2 mL 1 buah, pipet tetes, erlenmeyer ukuran 250 mL, 500 mL, 1 L, dan 2 L), neraca analitik (merk Wiggen Housser), aerator, lampu neon,Haemocytometer, autoklaf (merk Tomy SX-700), sentrifugasi (merk CAX-370), freeze dryer(merk Scanvic), alat pembuataquapure(TKA smart2pure), ultrasonifikasi (merk Mujigae), serta seperangkat alat potensiostat (eDAQ Pty Ltd) yang terdiri dari elektroda kerja

glassy carbon, elektroda referensi Ag/AgCl, elektroda bantu platina, dan sel elektrokimia berukuran 2,5 mL.

Bahan- bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah asam askorbat murni (merckKGaA, Darmstadt Germany), bibitDunaliellasp.,aquapure water, air

33

laut, alkohol 70%, etanol teknis, gas nitrogen, elektrolit pendukung NaCl 0,1 M, media Conwy, tisu, dan alumunium foil.

C. Prosedur Penelitian 1. KultivasiDunalielasp.

MikroalgaDunaliellasp. diperoleh dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Laut (BBPBL) Lampung. Dunaliellasp. dikultivasi dalam media kultur Conwy. Kultivasi dilakukan pada erlen meyer ukuran 250 mL, 500 mL, 1 L, dan 2 L dengan intensitas cahaya 3000 Lux, salinitas 10 Be, suhu 25-35°C, dan pH 8-8,5. Kepadatan awal sel dihitung menggunakanhaemocytometer.Komposisi media Conwy disajikan dalam Tabel 3

Tabel 3. Komposisi media Conwy

No Bahan Kimia Jumlah

1 NaNO3/ KNO3 10 gram

2 Na2EDTA 4,5 gram

3 FeCl3.6H2O 0,15 gram

4 MnCl2 0,036 gram

5 H2BO3 3,36 gram

6 NaH2PO4.2H2O 2,0 gram

7 Logam renik 0,1 mL

8 Vitamin 0,1 mL

9 Akuades hingga 100 mL

Dalam media Conwy terdapat komposisi logam renik yang disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4. Kandungan logam renik pada media Conwy

No. Bahan Kimia Berat Pelarut Volume

1 ZnCl2 2,1 gram Akuades Labu ukur 100 mL 2 CuSO4.5H2O 2,0 gram Akuades Labu ukur 100 mL 3 CoCl2.6H2O 2,0 gram Akuades Labu ukur 100 mL 4 (NH4)6.Mo7O24.4H2O 0,9 gram Akuades Labu ukur 100 mL

(Sumber: Pujiastuti dkk., 2010).

2. Pengukuran Kepadatan Sel dengan MetodeHaemocytometer

Kultur selDunaliellasp dalam tiap wadah diambil sebanyak 10 µL, diencerkan dengan 90 µL air laut, dan ditambahkan 20 µ L etanol teknis kemudian diteteskan kehaemocytometeruntuk dilakukan perhitungan kepadatan selnya (Lampiran 1). Kepadatan populasi sel yang dihasilkan dalam skala waktu dapat ditentukan dengan menggunakan alathaemocytometer. Cara penggunaanhaemocytometerini yaitu dengan cara meneteskan kultur selDunaliellasp. yang akan dianalisa

kepadatan selnya sebanyak satu tetes ke masing-masing dua bagian

haemocytometer.Tutup dengan menggunakan slide.Haemocytometerini dilengkapi dengan mikroskop.Haemocytometeryang telah diberikan kultur sel

Dunaliellasp.diletakkan di bawah lensa objektif dan difokuskan hingga terlihat kisi-kisi tempat perhitungan sel yang terdiri dari lima kisi perhitungan.

35

3. PemanenanDunaliellasp.

Pemanenan dilakukan pada fase stasioner yang diketahui dari kurva pertumbuhan mikroalgaDunaliellasp. (Lampiran 1) menggunakan teknik sentrifugasi.

Sentrifugasi dilakukan pada suhu 4°C, kecepatan 8500 rpm, selama 15 menit. Filtrat hasil sentrifugasi yang mengandung eksopolisakarida ditampung untuk kemudian dianalisis menggunakan potensiostat dan biomassaDunaliellasp. yang diperoleh kemudian ditimbang dan diekstraksi menggunakan pelarutaquapure water.

4. Freeze-Dry

Biomassa basahDunaliellasp. yang telah dipanen, kemudian dikeringkan dengan metodefreeze-dry.Sampel divakum pada suhu -108°C, selama 2-3 hari hingga diperoleh biomassa kering.

5. Ekstraksi Biomassa KeringDunaliellasp.

Ekstraksi biomassa keringDunaliellasp.menggunakan metode ultrasonikasi. Sebanyak 0,5 gram biomassa keringDunaliellasp.dilarutkan denganaquapure waterdalam labu ukur 10 mL, kemudian diultrasonikasi menggunakan alat ultrasonik. Setelah diekstraksi dengan ultrasonik, larutan disaring dan diambil ekstraknya.

6. Pembuatan Larutan Blangko

Larutan blangko dibuat dengan mencampurkan 2 mLaquapure waterdan 1 mL elektrolit pendukung NaCl 0,1 M. Larutan blangko dibuat duplo yaitu tanpa dan dengan kandungan oksigen. Larutan blangko tanpa oksigen dibuat dengan cara dijenuhkan dengan gas nitrogen selama 5 menit.

7. Pembuatan Larutan Standar Asam Askorbat Murni a. Pembuatan Stok Larutan Standar

Larutan stok asam askorbat dibuat dengan konsentrasi 2,5 mM. Pembuatan larutan stok dilakukan dengan menimbang 0,011 gram asam askorbat (Mr = 176,12) kemudian dilarutkan denganaquapure water ke dalam labu ukur 25 mL, diencerkan sampai tanda batas labu ukur (Lampiran 2).

b. Pembuatan Larutan Kerja Standar

Larutan kerja standar asam askorbat murni dibuat dengan mengencerkan larutan stok asam askorbat 2,5 mM. Variasi konsentrasi larutan kerja yang dipakai yaitu (mM): blangko; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0.7; 0.8; 0.9; 1. Data pengenceran larutan kerja standar asam askorbat disajikan pada Tabel 5 dan perhitungannya terdapat pada Lampiran 2.

37

Tabel 5. Data pengenceran larutan kerja standar asam askorbat

Standar V1(mL) M1(mM) V2(mL) M2(mM)

0 0 2,5 5 0

1 0,2 2,5 5 0,1

2 0,4 2,5 5 0,2

3 0,6 2,5 5 0,3

4 0,8 2,5 5 0,4

5 0,9 2,5 5 0,5

6 1,0 2,5 5 0,6

7 1,2 2,5 5 0,7

8 1,4 2,5 5 0,8

9 1,8 2,5 5 0,9

10 2,0 2,5 5 1,0

8. Pengukuran Aktivitas Antioksidan

Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan tekniklinear sweep voltammetry. Seperangkat alat potensiostat terdiri dari sel elektrokimia berukuran 2,5 mL dan tiga buah elektroda yaitu elektroda kerjaglassy carbon, elektroda referensi Ag/AgCl, dan elektroda bantu Platina. Ketiga jenis elektroda tersebut dilakukanpolishingsebelum pengukuran voltammetri dilakukan. Elektroda kerja dihubungkan pada kabel berwarna hijau, elektroda acuan dihubungkan pada kabel berwarna kuning, dan elektroda bantu dihubungkan pada kabel berwarna merah. Alat diatur dengan beberapa kondisi pengukuran reduksi oksigen dan oksidasi asam askorbat yang disajikan pada Tabel 6 dan Tabel 7.

Tabel 6. Kondisi pengukuran reduksi oksigen

Parameter Keterangan

Mode Linear

Initial E 0 mV

Final E -1000 mV

Rate 100 mV/detik

Range arus 10 µA

Tabel 7. Kondisi pengukuran oksidasi asam askorbat

Parameter Keterangan

Mode Linear

Initial E 0 mV

Final E 1000 mV

Rate 100 mV/detik

Range arus 10 µA

Larutan standar dan larutan sampel yang sudah disiapkan, masing-masing dipipet sebanyak 2 mL dan dimasukkan ke dalam wadah (sel elektrokimia) berukuran 2,5 mL kemudian ditambahkan 1 mL elektrolit pendukung NaCl 0,1 M. Wadah ditutup rapat kemudian dilakukan pengukuran. Pengukuran larutan blangko tanpa oksigen akan dihasilkan arus yang dinyatakan sebagai nilai arus residual (Ires). Pengukuran larutan blangko yang mengandung oksigen akan menghasilkan arus yang dinyatakan sebagai nilai limit arus oksigen (Ior). Pengukuran larutan standar antioksidan dilakukan dari konsentrasi terendah ke konsentrasi tertinggi,

kemudian dilanjutkan dengan pengukuran larutan sampel. Data yang diperoleh berupa arus reduksi oksigen dengan potensial reduksi oksigen sekitar -850 mV. Hasiloutputalat potensiostat adalah voltammogram (potensial vs arus).

39

densitas arus reduksi oksigen. Koefisien aktivitas antioksidan (K) ditentukan dengan rumus:

K = Δ j

(j j )Δ c

Keterangan:

Δ j : perubahan densitas arus reduksi oksigen

jor :densitas arus limit dari reduksi oksigen tanpa antioksidan (blangko) jres : densitas arus residual tanpa oksigen

Δ c : perubahan konsentrasi antioksidan

9. Validasi Metode a. Linieritas

Penentuan linieritas dilakukan dengan pengukuran 10 larutan standar asam askorbat. Masing-masing larutan standar dilakukan pengukuran sebanyak 1 kali. Pengukuran dilakukan dari konsentrasi asam askorbat terendah hingga konsentrasi asam askorbat tertinggi. Catat arus radikal anion superoksida (O2●-) hasil

pengukuran masing-masing larutan standar. Kemudian dibuat grafik hasil pengukuran larutan standar tersebut dan ditentukan koefisien regresi, kurva konsentrasi antioksidan terhadap respon arus (ired).

b. Presisi

Penentuan presisi dilakukan dengan menganalisis larutan sampel yang sama pada hari yang sama. Larutan sampel dibagi menjadi 3 bagian. Masing-masing larutan sampel dianalisis sebanyak satu kali. Dibuat grafik antara arus hasil pengukuran

dan konsentrasi antioksidan. Kemudian tentukan rata-rata (mean), simpangan baku (SD) dan persen relatif simpangan baku (%RSD) hasil pengukuran tersebut.

c. Akurasi

Penentuan akurasi dilakukan dengan menganalisis sampel yang ditambahkan larutan standar sebanyak 6 kali pengukuran. Kemudian arus hasil pengukuran diplot ke grafik. Kemudian dilakukan ujirecovery.

d. Limit Deteksi

Penentuan limit deteksi dilakukan dengan pengukuran larutan blangko yang dibagi menjadi 3 bagian. Masing-masing larutan blangko dilakukan pengukuran sebanyak 1 kali pengulangan. Kemudian plot arus hasil pengukuran. Hitung simpangan baku (SD) hasil pengukuran. Nilai limit deteksi sebesar 3 kali SD.

BAB V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai berikut:

1. Parameter uji linieritas, presisi, dan akurasi untuk validasi metode analisis aktivitas antioksidan pada fraksi air dariDunaliellasp. dengan teknik

linear sweep voltammetrymenunjukkan hasil yang baik.

2. Limit deteksi pengujian sampelDunaliellasp. adalah 0,079 mM. 3. Rentang kerja pengujian sampelDunaliellasp. yaitu 0,079 - 0,700 mM 4. Koefisien aktivitas antioksidan asam askorbat adalah 0,305.

B. Saran

Penulis menyarankan untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan variasi konsentrasi sampel sehingga koefisien aktivitas antioksidan dariDunaliellasp. dapat diketahui.

DAFTAR PUSTAKA

Albina, J. E. and J. S. Reichner. 1998.Role of Nitric Oxide in Mediation of

Macrophage Cytotoxicity and Apoptosis.Cancer Metatasis. 17: 38-53 hlm. Andrienko, D. 2008.Cyclic Voltammetry.

Association of Official Analytical Chemist (AOAC). 2002.Official Method of Analysis of the Association of Official Analytical Chemist. Benyamin Franklin Station. Washington, D.C.

Ben-Amotz, A., A. Lers., and M. Avron. 1988.Stereoisomers of β-carotene and Phytoene in Alga Dunaliella bardawil. Plant Physiol. 86: 1286_–1291 hlm. Borowitzka, M. A. and L. J. Borowitzka. 1988.Dunaliella.In: Microalga

Biotechnology. Cambridge University Press. Cambridge. 27-58 hlm. Cameron, D. K. and Y. J. Wang. 2006.Application of Protease and High-Intensity

Ultrasound in Corn Starch Isolation from Degermed Corn Flour. Journal Food Sience University Of Arkansas. 83 (5): 505-509 hlm.

Chen, C. Y., K. L. Yeh., R. Aisyah., D. J. Lee., and J. S. Chang. 2011.

Cultivation, Photobioreactor Design and Harvesting Microalga for Biodiesel Production. Bioresource Technology. 101: 87-96.

Chisti, J. 2007.Biodiesel From Microalgae. Biotechnology Advances. 25: 294-306 hlm.

EMEA. 1995.The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products.

ICH Topic Q 2 B.Validation of Analytical Procedures: Methodology. Diakses pada tanggal 8 Juli 2014 pukul 09.23 WIB.

http://www.pharmacontract.ch/support/pdf_support/Q2a.pdf.

Eurachem. 2014.The Fitness for Purpose of Analytical Methods:A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics(2ndedition). Europe. Fogg, G. E. 1975.Alga Culture and Phytoplankton Ecology. The University of

60

Hadi, A. 2007.Pemahaman dan Penerapan ISO/IEC 17025 : 2005. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hadi, H. P. 2011. Vitamin C (Asam Askorbat). The Pharmacist. Diakses pada tanggal 9 Juli 2014 pukul 10.00 WIB.

http://apoteksejati24.blogspot.com/2011/04/vitamin-c-asam-askorbat.html. Hariyatmi. 2004.Kemampuan Vitamin C Sebagai Antioksidan Terhadap radikal

Bebas Pada Lanjut Usia. Jurnal MIPA. UMS. Surakarta. 14 (1). Haryadi, W.1993.Ilmu Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia Pustaka. Jakarta. Huber, L. 2001.Validation of Analytical Methods. Diakses pada tanggal 9 Juli

2014 pukul 20.15 WIB. www.labcompliance.com.

Inoue, M. 2001.Protective Mechanisms Against Reactive Oxygen Species. In: Arias IM The Liver Biology and Pathobiology. Lippincott Williams and Wilkins 4th-ed. Philadelphia. 281-290 hlm.

International Conference on Harmonization (ICH). 1996.Validation of Analytical Procedures and Methodology. Diakses pada tanggal 9 Juli 2014 pukul 10.13 WIB. www.ich.org.

Isnansetyo, A. dan Kurniastuty. 1995.Teknik Kultur Phytoplankton dan

Zooplankton. Pakan Alami untuk Pembenihan Organisme Laut.Kanisius. Yogyakarta.

Kabinawa, I. N. K. 1994.Kultur Mikroalga: Aspek dan Prospek. Prosiding Seminar Nasional Bioteknologi Mikroalga.Puslitbang-Biotek. LIPI. Bogor.

Keil, F. J. 2007.Modeling of Process Intensification. 2009. Ultrasonic Vs.

Microwave Extraction Intensification of Active Principles From Medicinal Plants. AIDIC Conference Series. 9: 1-8 hlm.

Kennedy, J. H. 1990.Analytical Chemistry. Harcout Brace. Javanovich Publisher San Diego. 289 hlm.

Korotkova, E. I., Y. A. Karbainov., and A. V. Shevchuk. 2002.Study of Antioxidant Properties by Voltammetry. Journal of Electroanalytical Chemistry. 518: 56-60 hlm.

Krisanti, M. 2003. Peran Zeolit Sebagai Substrat dan Penyedia Unsur Hara Bagi Mikroalga (Tesis).Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Kuldiloke, J. 2002.Effect of Ultrasound, Temperature and Pressure Treatments on Enzyme Activity and Quality Indicators of Fruit and Vegetable Juices. Dissertationder Technischen Universität Berlin. Berlin.

Kikuzaki, H. and N. Nakatani. 1993.Antioxidant Effect of Some Ginger Constituent. J. Food Science.

Lestari, I. B., Kusmiati., H. Rahmawati., dan N. W. S. Agustini. 2009.Isolasi, Identifikasi Dan Uji Antimikroba Dari Senyawa Dalam Mikroalga Dunaliella salina. FFUP. Jakarta.

Liadler, K. 1996.Principles of Chemistry. The University of Ottawa. Kanada. Liu, Q. M., X. M. Yang., L. Zhang., and M. George. 2010.Optimization of

Ultrasonic-assisted Extraction of Chlorogenic Acid from Folium eucommiae and Evaluation of its Antioxidant Activity.Journal of Medicinal Plants Research. 4 (23): 2503-2511 hlm.

Matejtschuk, P. 2007.Lyophilization of protein. In Day, J. G. and G. N. Stacey. 2007.Cryopreservation and freeze-drying protocol.2nd ed. Humana Press Inc. New Jersey. xi+347 hlm.

Mason, T. J. 1990.Introduction, Chemistry with Ultrasound. Edited by T.J Mason. Elsevier Applied Science. London.

McClements, D. J. 1995.Advances in The Application of Ultrasound in Food Analysis and rocessing.Trends Food Sci. Techn. 6: 293-299 hlm. Nielsen, S. S. 2003.Introduction to Food Analysis. Di dalam Nielsen, S. S. ed.

Food Analysis 3rd ed. Kluwer Academic/ Plenum Publishers. New York. Nurhadi, A. 2012.Materi Pelatihan Validasi Metode Uji. Unila. Bandar

Lampung.

Pranayogi, D. 2003.Studi Potensi Pigmen Klorofil dan Karotenoid dari Mikroalga Jenis Chlorophyceae.Universitas Lampung. Lampung.

Pujiastuti, A., M. Mohaemin., dan H. Wijayanti. 2010.Pertumbuhan Tetraselmis

sp. di Media Kultur Berbeda dengan Penambahan Pb2+. Jurnal Ilmu Perikanan dan Sumberdaya Perairan.

Seambiotic. 2008.Dunaliellasp. Diakses pada tanggal 1 Juni 2014 pukul 20.15 WIB. http://www.seambiotic.com.

Sies, H. and W. Stahl. 1995.Vitamin E and C,β-karoten and Other Carotenoids as Antioxidants. Am. J. Clin. Nutr. Suppl. 62: 1315-1321hlm.

Skoog, D. A., M. Donald., F. West., and H. James. 1998.Principles of Analysis, 5thed. Saunders College Publishing.

62

Smyth, W. F. 1992.Voltammetric Determination of Molecules of Biological Significance.John Wiley and Sons. Chichester. 20-22 hlm.

Suslick, K. S. 1988.Ultrasounds: Its Chemical, Physical and Biological Effects. VHC Publishers. New York.

Taylor, A. 1993.Relationships Between Nutrition and Oxidation. J. Am. Coll. Nutr. 12: 138-146 hlm.

Thompson, M., S. L. R. Ellison., and R. Wood. 2002.Harmonized guidelines for single laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical report). Pure Applied Chemistry74 (5): 835-855 hlm.

Thurnham, D. I., D. A. Bender., J. Scott., and C. H. Halsted. 2000.Water soluble vitamins, Human Nutritions and Dietatics(Garrow J.S., James W. P. T., and Ralph A., eds). Harcourt Publishers Limited. United Kingdom. 249-257 hlm.

Tjahjo, W., L. Erawati., dan S. Hanung. 2002. Budidaya Fitoplankton dan Zooplankton. Direktorat Jendral Perikanan Budidaya Departemen Kelautan dan Perikanan: Proyek Pngembangan Perekayasaan Ekologi Balai Budidaya Laut Lampung. Lampung.

Wang, J. 1989.Voltammetry Following Nonelectrolytic Preconcentration.In: Brad, A. J. (ed.)Electroanalytical Chemistry.Marcel Dekker. New York. 16: 1-80 hlm.

Wang, S. Y. 2001.Antioxidant Activity and Phenolic Compound in Selected Herbs.Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49: 5165-5170 hlm. Winarno.1984.Kimia Pangan dan Gizi. PT.Gramedia. Jakarta.

40

dan konsentrasi antioksidan. Kemudian tentukan rata-rata (mean), simpangan baku (SD) dan persen relatif simpangan baku (%RSD) hasil pengukuran tersebut.

c. Akurasi

Penentuan akurasi dilakukan dengan menganalisis sampel yang ditambahkan larutan standar sebanyak 6 kali pengukuran. Kemudian arus hasil pengukuran diplot ke grafik. Kemudian dilakukan ujirecovery.

d. Limit Deteksi

Penentuan limit deteksi dilakukan dengan pengukuran larutan blangko yang dibagi menjadi 3 bagian. Masing-masing larutan blangko dilakukan pengukuran sebanyak 1 kali pengulangan. Kemudian plot arus hasil pengukuran. Hitung simpangan baku (SD) hasil pengukuran. Nilai limit deteksi sebesar 3 kali SD.

berikut:

1. Parameter uji linieritas, presisi, dan akurasi untuk validasi metode analisis aktivitas antioksidan pada fraksi air dariDunaliellasp. dengan teknik linear sweep voltammetrymenunjukkan hasil yang baik.

2. Limit deteksi pengujian sampelDunaliellasp. adalah 0,079 mM. 3. Rentang kerja pengujian sampelDunaliellasp. yaitu 0,079 - 0,700 mM 4. Koefisien aktivitas antioksidan asam askorbat adalah 0,305.

B. Saran

Penulis menyarankan untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan variasi konsentrasi sampel sehingga koefisien aktivitas antioksidan dariDunaliellasp. dapat diketahui.

59

DAFTAR PUSTAKA

Albina, J. E. and J. S. Reichner. 1998.Role of Nitric Oxide in Mediation of

Macrophage Cytotoxicity and Apoptosis.Cancer Metatasis. 17: 38-53 hlm. Andrienko, D. 2008.Cyclic Voltammetry.

Association of Official Analytical Chemist (AOAC). 2002.Official Method of Analysis of the Association of Official Analytical Chemist. Benyamin Franklin Station. Washington, D.C.

Ben-Amotz, A., A. Lers., and M. Avron. 1988.Stereoisomers of β-carotene and Phytoene in Alga Dunaliella bardawil. Plant Physiol. 86: 1286_–1291 hlm. Borowitzka, M. A. and L. J. Borowitzka. 1988.Dunaliella.In: Microalga

Biotechnology. Cambridge University Press. Cambridge. 27-58 hlm. Cameron, D. K. and Y. J. Wang. 2006.Application of Protease and High-Intensity

Ultrasound in Corn Starch Isolation from Degermed Corn Flour. Journal Food Sience University Of Arkansas. 83 (5): 505-509 hlm.

Chen, C. Y., K. L. Yeh., R. Aisyah., D. J. Lee., and J. S. Chang. 2011. Cultivation, Photobioreactor Design and Harvesting Microalga for Biodiesel Production. Bioresource Technology. 101: 87-96.

Chisti, J. 2007.Biodiesel From Microalgae. Biotechnology Advances. 25: 294-306 hlm.

EMEA. 1995.The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. ICH Topic Q 2 B.Validation of Analytical Procedures: Methodology. Diakses pada tanggal 8 Juli 2014 pukul 09.23 WIB.

http://www.pharmacontract.ch/support/pdf_support/Q2a.pdf.

Eurachem. 2014.The Fitness for Purpose of Analytical Methods:A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics(2ndedition). Europe. Fogg, G. E. 1975.Alga Culture and Phytoplankton Ecology. The University of

http://apoteksejati24.blogspot.com/2011/04/vitamin-c-asam-askorbat.html. Hariyatmi. 2004.Kemampuan Vitamin C Sebagai Antioksidan Terhadap radikal

Bebas Pada Lanjut Usia. Jurnal MIPA. UMS. Surakarta. 14 (1). Haryadi, W.1993.Ilmu Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia Pustaka. Jakarta. Huber, L. 2001.Validation of Analytical Methods. Diakses pada tanggal 9 Juli

2014 pukul 20.15 WIB. www.labcompliance.com.

Inoue, M. 2001.Protective Mechanisms Against Reactive Oxygen Species. In: Arias IM The Liver Biology and Pathobiology. Lippincott Williams and Wilkins 4th-ed. Philadelphia. 281-290 hlm.

International Conference on Harmonization (ICH). 1996.Validation of Analytical Procedures and Methodology. Diakses pada tanggal 9 Juli 2014 pukul 10.13 WIB. www.ich.org.

Isnansetyo, A. dan Kurniastuty. 1995.Teknik Kultur Phytoplankton dan

Zooplankton. Pakan Alami untuk Pembenihan Organisme Laut.Kanisius. Yogyakarta.

Kabinawa, I. N. K. 1994.Kultur Mikroalga: Aspek dan Prospek. Prosiding Seminar Nasional Bioteknologi Mikroalga.Puslitbang-Biotek. LIPI. Bogor.

Keil, F. J. 2007.Modeling of Process Intensification. 2009. Ultrasonic Vs.

Microwave Extraction Intensification of Active Principles From Medicinal Plants. AIDIC Conference Series. 9: 1-8 hlm.

Kennedy, J. H. 1990.Analytical Chemistry. Harcout Brace. Javanovich Publisher San Diego. 289 hlm.

Korotkova, E. I., Y. A. Karbainov., and A. V. Shevchuk. 2002.Study of Antioxidant Properties by Voltammetry. Journal of Electroanalytical Chemistry. 518: 56-60 hlm.

Krisanti, M. 2003. Peran Zeolit Sebagai Substrat dan Penyedia Unsur Hara Bagi Mikroalga (Tesis).Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor.

61

Kuldiloke, J. 2002.Effect of Ultrasound, Temperature and Pressure Treatments on Enzyme Activity and Quality Indicators of Fruit and Vegetable Juices. Dissertationder Technischen Universität Berlin. Berlin.

Kikuzaki, H. and N. Nakatani. 1993.Antioxidant Effect of Some Ginger Constituent. J. Food Science.

Lestari, I. B., Kusmiati., H. Rahmawati., dan N. W. S. Agustini. 2009.Isolasi, Identifikasi Dan Uji Antimikroba Dari Senyawa Dalam Mikroalga Dunaliella salina. FFUP. Jakarta.

Liadler, K. 1996.Principles of Chemistry. The University of Ottawa. Kanada. Liu, Q. M., X. M. Yang., L. Zhang., and M. George. 2010.Optimization of

Ultrasonic-assisted Extraction of Chlorogenic Acid from Folium eucommiae and Evaluation of its Antioxidant Activity.Journal of Medicinal Plants Research. 4 (23): 2503-2511 hlm.

Matejtschuk, P. 2007.Lyophilization of protein. In Day, J. G. and G. N. Stacey. 2007.Cryopreservation and freeze-drying protocol.2nd ed. Humana Press Inc. New Jersey. xi+347 hlm.

Mason, T. J. 1990.Introduction, Chemistry with Ultrasound. Edited by T.J Mason. Elsevier Applied Science. London.

McClements, D. J. 1995.Advances in The Application of Ultrasound in Food Analysis and rocessing.Trends Food Sci. Techn. 6: 293-299 hlm. Nielsen, S. S. 2003.Introduction to Food Analysis. Di dalam Nielsen, S. S. ed.

Food Analysis 3rd ed. Kluwer Academic/ Plenum Publishers. New York. Nurhadi, A. 2012.Materi Pelatihan Validasi Metode Uji. Unila. Bandar

Lampung.

Pranayogi, D. 2003.Studi Potensi Pigmen Klorofil dan Karotenoid dari Mikroalga Jenis Chlorophyceae.Universitas Lampung. Lampung.

Pujiastuti, A., M. Mohaemin., dan H. Wijayanti. 2010.Pertumbuhan Tetraselmis sp. di Media Kultur Berbeda dengan Penambahan Pb2+. Jurnal Ilmu Perikanan dan Sumberdaya Perairan.

Seambiotic. 2008.Dunaliellasp. Diakses pada tanggal 1 Juni 2014 pukul 20.15 WIB. http://www.seambiotic.com.

Sies, H. and W. Stahl. 1995.Vitamin E and C,β-karoten and Other Carotenoids as Antioxidants. Am. J. Clin. Nutr. Suppl. 62: 1315-1321hlm.

Skoog, D. A., M. Donald., F. West., and H. James. 1998.Principles of Analysis, 5thed. Saunders College Publishing.

Taylor, A. 1993.Relationships Between Nutrition and Oxidation. J. Am. Coll. Nutr. 12: 138-146 hlm.

Thompson, M., S. L. R. Ellison., and R. Wood. 2002.Harmonized guidelines for single laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical report). Pure Applied Chemistry74 (5): 835-855 hlm.

Thurnham, D. I., D. A. Bender., J. Scott., and C. H. Halsted. 2000.Water soluble vitamins, Human Nutritions and Dietatics(Garrow J.S., James W. P. T., and Ralph A., eds). Harcourt Publishers Limited. United Kingdom. 249-257 hlm.

Tjahjo, W., L. Erawati., dan S. Hanung. 2002. Budidaya Fitoplankton dan Zooplankton. Direktorat Jendral Perikanan Budidaya Departemen Kelautan dan Perikanan: Proyek Pngembangan Perekayasaan Ekologi Balai Budidaya Laut Lampung. Lampung.

Wang, J. 1989.Voltammetry Following Nonelectrolytic Preconcentration.In:

Brad, A. J. (ed.)Electroanalytical Chemistry.Marcel Dekker. New York.

16: 1-80 hlm.

Wang, S. Y. 2001.Antioxidant Activity and Phenolic Compound in Selected Herbs.Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49: 5165-5170 hlm. Winarno.1984.Kimia Pangan dan Gizi. PT.Gramedia. Jakarta.