Analisis Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) pada Sapi
KERAGAMAN NUKLEOTIDA RUAS EKSON 4
GEN BRANCHED CHAIN KETOACID DEHYDROGENASE E1-α
POLYPEPTIDE (BCKDHA) PADA SAPI
YOVITA SARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Nukleotida
Ruas Ekson 4 Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide
(BCKDHA) pada Sapi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Yovita Sari
NIM G34090028
ABSTRAK
YOVITA SARI. Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen Branched
Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) pada Sapi.
Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI.
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) merupakan
kompleks enzim yang berperan dalam mengubah asam amino bercabang
(leusin, isoleusin, dan valin) menjadi α-keto agar dapat masuk ke siklus
Krebs. Defisiensi dari kompleks enzim BCKD akan menyebabkan
penyakit Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Penelitian ini dilakukan
untuk menganalisis keragaman nukleotida ruas ekson 4 dari gen BCKDHA
pada sapi. Analisis varian gen BCKDHA dilakukan terhadap lima sampel
DNA sapi madura, tiga sampel DNA sapi sumba ongole (so), dan tiga
sampel DNA sapi peranakan ongole (po) dan perunutan nukleotida
dilakukan terhadap produk PCR dengan menggunakan metode sampel
DNA pooling. Varian yang ditemukan pada ekson 4, yaitu G36T pada sapi
po. Varian ini termasuk substitusi transversi yang mengubah asam
glutamat (GAA) menjadi stop kodon (TAA). Varian berikutnya G144C
ditemukan pada intron 4 pada sapi madura dan sapi so.
Kata kunci: BCKDHA, ekson 4, varian, DNA pooling, MSUD.
YOVITA SARI. Variability of Exon 4 Nucleotides of Branched Chain
Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Gene on Cattle.
Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and DYAH PERWITASARI.
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) is the enzyme
complex that have a role in changing branched chain amino acid (leusin,
isoleusin, and valin) into α-keto which can involve in Crebs cycle.
Deficiency of enzyme complex BCKD will cause Maple Syrup Urine
Disease (MSUD). This research aimed to analyze the variability of exon 4
nucleotides of BCKDHA gene on cattle. Analysis of variants from
BCKDHA gene was performed using 5 DNA samples from madura cattle,
3 DNA samples from sumba ongole (so) cattle, and 3 DNA samples from
ongole descendant cattle and nucleotides sequencing was conducted on
PCR product from amplification of DNA pooling sample method. The
variant of the exon 4 was G36T on po cattle. This variant revealed
transversion substitution which changed Glu (GAA) to stop codon (TAA).
The other variant, G144C was found in intron 4 of madura and so cattle.
Keywords : BCKDHA, exon 4, variant, DNA pooling, MSUD.
KERAGAMAN NUKLEOTIDA RUAS EKSON 4
GEN BRANCHED CHAIN KETOACID DEHYDROGENASE E1-α
POLYPEPTIDE (BCKDHA) PADA SAPI
YOVITA SARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen Branched
Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA)
pada Sapi
Nama
: Yovita Sari
NIM
: G34090028
Disetujui oleh
Dr Achmad Farajallah
Pembimbing I
Dr Dyah Perwitasari
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari-Juni 2013 ini
ialah keragaman, dengan judul Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) pada
Sapi. Penelitian dilaksanakan di laboratorium molekuler, bagian Fungsi Hayati
dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Achmad Farajallah dan
Ibu Dr Dyah Perwitasari selaku dosen pembimbing, serta Dr Ir Utut Widyastuti,
MSi selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam
penyusunan skripsi ini. Penghargaan penulis sampaikan kepada keluarga besar
zoologi (Mbak Tini, Mbak Ani, Pak Adi, Ibu Maria Ulfah, Kak Wildan, Kak
Yanti, Kak Esa, Kak Lora, Kak Vendi, Mbak Kanthi, Kak Bulan, Kak Lili, Kak
Rendi, dan Kak Made) yang telah berbagi ilmu dan bimbingan selama penelitian.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga,
atas segala doa dan kasih sayangnya, kepada sahabat seperjuangan (Della Yuniar
Windi, Muhamad Abduh, dan Ria Maria Bakrie) atas segala bantuan, nasehat, dan
dukungan yang telah diberikan selama penelitian ini, kepada teman-teman Pondok
Unyu (Resty, Chipy, Sandra, Ika, Imas, dan Novi), Zuhad Syafril Huda, keluarga
besar PSM IPB Agria Swara (khususnya Nadia, Dini, Stefy, Firdha, Esa, Adhit,
Wengki, dan Annisa), dan teman-teman biologi angkatan 46 (Nurifah, Dheasinta,
dan Surya), angkatan 47, dan 48 yang telah memberikan motivasi kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat dan menambah ilmu
pengetahuan kita semua. Saran dan kritik penulis harapkan untuk hasil yang lebih
baik.
Bogor, September 2013
Yovita Sari
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan
2
METODE
2
Sampel
2
Ekstraksi dan Isolasi DNA
2
Amplifikasi gen BCKDHA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
2
Perunutan Nukleotida Gen BCKDHA
3
Analisis Runutan DNA
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Hasil
3
Pembahasan
5
SIMPULAN
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
8
RIWAYAT HIDUP
10
DAFTAR TABEL
1 Hasil pensejajaran nukleotida ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari
sampel sapi madura, sapi so, dan sapi po terhadap nukleotida gen
BCKDHA Bos taurus (NW1493616)
2 Ringkasan hasil translasi protein
4
5
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari sampel sapi
madura (m), sapi sumba ongole (so), dan sapi peranakan ongole (po)
dalam PAGE 6% dengan pewarnaan sensitif perak
2 Varian pada ekson 4 yang terjadi pada sampel sapi po dan varian pada
intron 4 yang terjadi pada sapi madura dan sapi so
3
4
DAFTAR LAMPIRAN
1 Gambar sapi madura (A), sapi sumba ongole (B), dan sapi peranakan
ongole (C)
2 Posisi penempelan primer AF320 dan AF321 pada ruas ekson dan
intron 4 gen BCKDHA Bos taurus (NW1493616)
8
9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi merupakan salah satu hewan ternak dari famili Bovidae. Bangsa sapi
lokal di Indonesia antara lain sapi bali, sapi madura, sapi aceh, sapi pesisir, dan
sapi peranakan ongole. Ongole murni pertama kali dibawa ke Pulau Sumba yang
kemudian dikenal dengan sebutan sumba ongole (so) dan selanjutnya dibawa ke
wilayah lain di Indonesia untuk disebarkan. Sapi ongole yang masuk ke pulau
Jawa disilangkan dengan sapi lokal jawa membentuk sapi peranakan ongole (po),
sedangkan sapi ongole yang masuk ke pulau Madura disilangkan dengan banteng
(Bos javanicus) membentuk sapi madura. Sapi madura mempunyai kemampuan
adaptasi yang baik dan toleran terhadap iklim panas/tropik. Ternak sapi madura
yang berada di pulau Madura dikelola dengan baik dalam jangka waktu yang
panjang (Mohamad et al. 2009) (Lampiran 1).
Mitokondria merupakan organel yang berperan sebagai pusat pembangkitan
energi dan pusat metabolisme. Reaksi metabolisme intermediet merupakan fungsi
vital organel mitokondria. Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase (BCKD)
merupakan kompleks enzim yang berperan dalam metabolisme intermediet siklus
Krebs, yaitu mengubah asam amino bercabang (leusin, isoleusin, dan valin)
menjadi α-keto agar dapat masuk ke siklus Krebs. Defisiensi dari kompleks enzim
BCKD akan menyebabkan penyakit Maple Syrup Urine Disease (MSUD)
(Skvorak 2009). Defisiensi dari BCKD ditandai dengan bau sirup maple pada urin
dan selaput lendir (di telinga, anus, dan rongga mulut) akibat meningkatnya
konsentrasi asam amino bercabang di dalam plasma. Ada tiga penyebab defisiensi
dari BCKD yang dilaporkan pada manusia. Penyebab pertama adalah autoantigen
dan penyebab kedua anti-mitochondrial antibodies (Friedrich et al. 2012).
Peluang terbesar dari dua penyebab pertama adalah akibat akumulasi limbah
radikal bebas dari reaksi reduksi-oksidasi sistem pembangkitan energi
mitokondria dan dari polutan lingkungan. Hal ini menunjukkan bahwa munculnya
gejala klinis MSUD berkaitan dengan penuaan (ageing). Penyebab ketiga adalah
mutasi genetik (Zhang et al. 1990, Friedrich et al. 2012). Selain itu, mutasi pada
gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA)
dapat mengubah efisiensi kompleks enzim BCKD menjadi lebih efisien ataupun
sebaliknya. Mutasi yang menyebabkan penyakit MSUD adalah perubahan basa C
menjadi T pada daerah 5’ ekson 2 dari subunit E1-α gen BCKDHA (Healy 1996).
Titik-titik mutasi di luar ekson 2 gen BCKDHA pada sapi belum pernah
dilaporkan (Zhang et al. 1990), termasuk mutasi pada ekson 4 dari gen ini.
Berbagai metode telah banyak berkembang dan dapat digunakan untuk
mendeteksi mutasi pada tingkat DNA. Metode yang sering digunakan adalah
metode PCR dan elektroforesis terhadap sampel yang dijadikan dalam satu tabung
(DNA pooling) yang dilanjutkan dengan penentuan runutan nukleotida atau DNA
sequencing. Teknik DNA pooling untuk perunutan merupakan teknik dalam
mendeteksi delesi, insersi, dan substitusi nukleotida dikenal sebagai Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
2
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman nukleotida ruas ekson 4
dari gen BCKDHA pada sapi.
METODE
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai Juni 2013 di Laboratorium
Molekuler, Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel
Sampel yang digunakan berjumlah 11, terdiri atas lima sampel darah dan enam
sampel DNA sapi. Sampel darah yang digunakan merupakan koleksi Dr Dyah
Perwitasari. Sampel darah diperoleh dari lima ekor sapi madura dari Kabupaten
Sumenep, Madura yang diperuntukkan sebagai sapi sonok (sapi jinak dan penurut).
Sampel DNA terdiri atas tiga sampel DNA sapi sumba ongole (so) dan tiga sampel
DNA sapi peranakan ongole (po) yang merupakan koleksi dari Dr Jakaria,
Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak, Fakultas Peternakan.
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan dari koleksi sel-sel darah sapi madura yang
disimpan dalam alkohol menggunakan Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood
(Geneaid) dengan sedikit modifikasi. Modifikasi yang dilakukan berkenaan dengan
penghilangan alkohol dari sampel darah agar tidak menggangu proses ekstraksi
selanjutnya.
Amplifikasi gen BCKDHA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi nukleotida ruas ekson dan intron 4 gen BCKDHA dilakukan
terhadap masing-masing pooled sampel, yaitu lima sampel sapi madura, tiga sampel
sapi so, dan tiga sampel sapi po menggunakan primer forward AF320 (5’AGGGCCGCATATCCTTCTAC)
dan
primer
reverse
AF321
(5’CTAATGTAGACCTCGCCTTCTGA) dengan panjang amplikon 224 pb (Lampiran 2).
Reaksi PCR menggunakan taq KAPA2G Fast DNA polymerase beserta bufernya yang
mengandung MgCl2 (1,5 mM), campuran dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP,
masing-masing dengan konsentrasi 10 mM), dan primer AF320 dan AF321 (masingmasing dengan konsentrasi 1 mM). Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pradenaturasi
pada suhu 90oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 28 siklus yang terdiri atas
denaturasi suhu 94oC selama 10 detik, penempelan primer suhu 58oC selama 1,5 menit,
pemanjangan suhu 72oC selama 2 menit, dan pemanjangan akhir suhu 72oC selama 2
menit. Keberhasilan PCR diamati menggunakan metode polyacrilamide gel
electrophoresis (PAGE) 6% dengan penanda 100 pb yang dijalankan pada tegangan 200
V selama 40 menit. Visualisasi pita DNA setelah elektroforesis dilakukan dengan
pewarnaan sensitif perak (Byun et al. 2009).
3
Perunutan Nukleotida Gen BCKDHA
Perunutan nukeotida dilakukan terhadap amplikon yang menunjukkan pita
tunggal dan tebal di atas gel poliakrilamid. Untuk itu, amplikon dari lima sampel DNA
sapi madura, tiga sampel DNA sapi so, dan tiga sampel DNA sapi po masing-masing
disatukan (DNA pooling) dan dijadikan cetakan dalam reaksi perunutan nukleotida
menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi awal. Reaksi perunutan
menggunakan metode sequencing big dye terminator yang dilakukan oleh Lembaga
Komersial jasa sequencing First Base.
Analisis Runutan DNA
Hasil perunutan dari arah forward dan reverse diedit berdasarkan kromatogram
yang dihasilkan oleh mesin elektroforesis sequencing menggunakan program BioEdit
versi 7.1.11. Kemudian, keduanya digabung menjadi satu runutan nukleotida.
Pengeditan runutan lebih lanjut dilakukan secara manual berdasarkan penyandian
menjadi polipeptida. Setelah diedit, runutan nukleotida dari masing-masing sampel sapi
tersebut saling disejajarkan menggunakan MEGA versi 5.0.5 (Moleculer Evolutionary
Genetics Analysis).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA
Ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari sampel sapi madura, sapi so, dan sapi po
berhasil teramplifikasi menggunakan pasangan primer AF320 dan AF321 dalam mesin
thermocycler dan terdeteksi dengan PAGE 6% dengan ukuran amplikon sekitar 224 pb
yang sesuai dengan desain primer (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari sampel sapi madura
(m), sapi sumba ongole (so), dan sapi peranakan ongole (po) dalam PAGE
6% dengan pewarnaan sensitif perak. Keterangan p= penanda 100 pb.
Analisis Varian Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen BCKDHA
Adanya varian nukleotida terlihat pada puncak kromatogram yang saling
tumpang tindih. Varian basa G dan T ditemukan pada sampel sapi po (Gambar 2A).
Varian basa G dan C ditemukan pada sampel sapi madura dan sapi so (Gambar 2B dan
2C). Analisis selanjutnya menggabungkan runutan amplikon gen BCKDHA dari arah
4
forward dan reverse. Hasil perunutan gen BCKDHA, yaitu sepanjang 220 nukleotida,
terdiri atas 111 nukleotida ruas ekson 4 dan 109 nukleotida ruas intron 4. Hasil
pensejajaran nukleotida ruas ekson 4 dari sampel sapi madura, sapi so, dan sapi po
terhadap Bos taurus dengan nomor akses GeneBank NW1493616 menunjukkan bahwa
B. taurus, sapi madura, dan sapi so memiliki basa G pada posisi nukleotida ke 36,
sedangkan sapi po memiliki varian nukleotida, yaitu basa G dan T. Varian nukleotida
berikutnya ditemukan pada intron 4, yaitu basa G dan C pada posisi nukleotida ke 144
pada sampel sapi madura dan sapi so, berbeda dengan B. taurus yang memiliki basa G
dan sapi po yang memiliki basa C (Tabel 1).
A
B
C
Gambar 2 Varian pada ekson 4 yang terjadi pada sampel sapi po (A) dan varian
pada intron 4 yang terjadi pada sapi madura (B) dan sapi so (C).
Tabel 1 Hasil pensejajaran nukleotida ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari
sampel sapi madura, so, dan po terhadap nukleotida gen BCKDHA Bos
Taurus (NW1493616)
Ekson 4
Intron 4
Bangsa
1 1 1 1 1 1 1
3 3 3 3 3 3 3
4 4 4 4 4 4 4
3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7
Bos taurus (NW1493616)
G G C G A A G
A G T G G G G
Sapi madura
G G C G A A G
A G T G/C G G G
Sapi sumba ongole (so)
G G C G A A G
A G T G/C G G G
Sapi peranakan ongole (po)
G G C G/T A A G
A G T C G G G
Keterangan: Nomor posisi nukleotida dibaca secara vertikal di tiga baris pertama.
Bagian yang dicetak tebal menunjukkan adanya varian.
Translasi Protein
Translasi protein dilakukan setelah pensejajaran nukleotida ruas ekson dan
intron 4 gen BCKDHA. Berdasarkan translasi protein gen BCKDHA pada B.
taurus (NW1493616), varian G36T pada sapi po menyebabkan perubahan asam
glutamat (E) menjadi stop kodon (*) pada posisi asam amino ke 147 (Tabel 2).
Asam amino yang ditranslasikan berjumlah 37 asam amino. Varian G144C tidak
menyebabkan perubahan asam amino karena intron tidak ditranslasikan.
5
Tabel 2 Ringkasan hasil translasi protein
Bangsa
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5
6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5
Bos taurus (NW1493616)
GR I S FYMTNYG EE GT HVGSA
Sapi madura
GR I S FYMTNYG EE GT HVGSA
Sapi sumba ongole
GR I S FYMTNYG EE GT HVGSA
Sapi peranakan ongole
GR I S FYMTNYG * E GT HVGSA
Keterangan: Nomor posisi asam amino dibaca secara vertikal di tiga baris pertama.
Bagian yang dicetak tebal menunjukkan adanya mutasi.
Pembahasan
Amplifikasi dan visualisasi ekson dan intron 4 gen BCKDHA menghasilkan
pita yang tebal dan beberapa pita tambahan yang samar-samar. Pita tambahan
tersebut merupakan pengotor yang terdeteksi pada gel poliakrilamid setelah
pewarnaan perak dan tidak menggangu runutan amplikon. Hal tersebut didukung
dengan puncak kromatogram yang jelas dengan jarak antar puncak yang sebagian
besar sama. Pewarnaan sensitif perak yang digunakan untuk mendeteksi pita-pita
DNA dalam gel poliakrilamid sangat sesuai dengan volume dan konsentrasi
sampel yang sangat kecil, yaitu 2 µl [10 ng] (Avise 1994). Hal ini dikarenakan
pewarnaan sensitif perak merupakan metode dengan sensitifitas yang sangat tinggi
dan cepat dalam mendeteksi pita-pita DNA yang sangat kecil dengan konsentrasi
berkisar 10 ng (Byun et al. 2009).
Adanya dua puncak pada kromatogram yang saling tumpang tindih
merupakan sebuah data kualitatif yang diharapkan, karena menunjukkan adanya
varian pada ekson dan intron 4. Puncak-puncak tersebut merupakan hasil dari
pembacaan mesin perunutan PCR dan elektroforesis terhadap sampel yang
dijadikan dalam satu tabung (DNA pooling). Secara umum, teknik DNA pooling
untuk perunutan merupakan teknik dalam mendeteksi delesi, insersi, dan
substitusi nukleotida dikenal sebagai Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
Teknik DNA pooling yang digunakan dalam penelitian ini merupakan teknik yang
dapat mendeteksi varian pada suatu lokus namun varian tersebut tidak dapat
diketahui terjadi pada sampel yang mana. Hal ini karena sampel-sampel tersebut
dijadikan dalam satu tabung (pooling) sehingga teknik ini sangat hemat sebagai
penanda molekuler dan proses screening pada sampel dapat terjadi secara tepat.
Perunutan ekson dan intron 4 gen BCKDHA menunjukkan bahwa varian
G36T hanya ditemukan pada sapi po, sedangkan varian G144C ditemukan pada
intron 4 pada sapi madura dan sapi so. Varian G144C pada sapi madura dan sapi
so tidak menyebabkan perubahan asam amino karena intron tidak ditranslasikan.
Varian G36T pada sapi po menyebabkan perubahan asam amino dari asam
glutamat (GAA) atau (E) menjadi stop kodon (TAA) atau (*). Perbedaan asam
amino pada varian G36T karena perubahan nukleotida pada posisi basa pertama.
Perubahan tersebut termasuk mutasi substitusi transversi. Substitusi transversi
adalah pertukaran atau pergantian satu basa purin dengan satu basa pirimidin atau
sebaliknya. Selain itu, mutasi tersebut bersifat nonsense karena menyebabkan
6
perubahan suatu asam amino menjadi stop kodon prematur, yaitu asam glutamat
menjadi stop kodon (Elrod dan Stansfield 2002).
Stop kodon prematur adalah mutasi yang mengakibatkan sel berhenti
membaca instruksi genetika pada proses sintesis protein sehingga rantai protein
yang dihasilkan tidak sempurna (Elrod dan Stansfield 2002). Ketidaksempurnaan
rantai protein yang dihasilkan dapat mempengaruhi pembentukan suatu protein
yang fungsional, seperti enzim, sedangkan enzim mempunyai peranan penting
dalam kegiatan metabolisme. Defisiensi dan tidak terbentuknya suatu enzim dapat
menghambat kegiatan metabolisme, bahkan dapat menyebabkan suatu penyakit,
seperti penyakit MSUD.
Titik-titik mutasi di luar ekson 2 gen BCKDHA pada sapi belum pernah
dilaporkan (Zhang et al. 1990), termasuk mutasi pada ekson 4 dari gen ini. Healy
(1996) melaporkan adanya mutasi pada ekson 2 subunit E1-α gen BCKDHA pada
sapi Polled Shothorn dengan metode PCR. Mutasi yang menyebabkan penyakit
MSUD adalah perubahan basa C menjadi T pada daerah 5’ ekson 2 dari subunit
E1-α gen BCKDHA. Kelainan pada gen BCKDHA penyebab MSUD ditemukan
pada individu homozigot resesif karena MSUD termasuk penyakit resesif
autosomal (King 2013). Walaupun terjadi mutasi pada ekson 4, namun sapi po
dalam penelitian ini belum tentu mengalami kelainan. Hal ini disebabkan oleh
kemungkinan kondisi heterozigot pada gen BCKDHA. Penyakit resesif autosomal
muncul saat individu memiliki dua kopi gen mutan (homozigot).
SIMPULAN
Perunutan nukleotida ruas ekson dan intron 4 gen BCKDHA pada sapi
madura, sapi so, dan sapi po dengan teknik sampel DNA pooling menunjukkan
bahwa ekson 4 memiliki varian G36T pada sapi po. Varian berikutnya, yaitu
G144C ditemukan pada intron 4 pada sapi madura dan sapi so. Analisis varian
menunjukkan bahwa varian G36T menyebabkan perubahan asam amino dari asam
glutamat (GAA) menjadi stop kodon (TAA). Perubahan tersebut termasuk mutasi
substitusi transversi dan bersifat nonsense.
DAFTAR PUSTAKA
Avise JC. 1994. Molecular Markers, Natural History and Evolution. New York
(USA): Chapman & Hall.
Bunik V, Fernie AR. 2009. Metabolic control exerted by the 2-oxoglutarate
dehydrogenase reaction: a cross-kingdom comparison of the crossroad
between energy production and nitrogen assimilation. Journal
Biochemistry. 422:405-421.
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver
staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Analytical
Biochemistry. 385:174-175.
Elrod SL, Stansfield WD. 2002. Schaums’s Outlines of Theory and Problems of
Genetics, Fourth Edition. California (USA): The McGraw-Hill Companies.
7
Friedrich T, Lambert AM, Masino MA, Downes GB. 2012. Mutations of
zebrafish dihydrolipoamide branched-chain transacylase E2 results in
motor dysfunction and models maple syrup urine disease. Disease Model
and Mechanism. 5:248-258.
Healy PJ. 1996. Testing for Undesirable Traits in Cattle: An Australian
Perspective. Journal Animal Sciences. 74:917-922.
King MW. 2013. Introduction to Maple Syrup Urine Disease: MSUD.
[terhubung berkala] http://themedicalbiochemistrypage.org/msud.php
diakses 2013 Agustus 18.
Mohamad K, Olsson M, van Tol HTA, Mikko S, Vlamings BH, Andersson G,
Martinez HR, Purwantara B, Paling RW, Colenbrader B et al. 2009. On
the origin of Indonesian cattle. PLos ONE. 4:3-4.
Skvorak KJ. 2009. Animal models of maple syrup urine disease. Journal
Inheritance Metabolism Disease. 32:8-9.
Zhang B, Healy PJ, Zhao Y, Crabb DW, Harris RA. 1990. Premature translation
termination of the pre-E1a subunit of the branched chain ketoacid
dehydrogenase as a cause of maple syrup urine disease in polled hereford
calves. Journal Biological Chemistry. 265:2425-2427.
8
Lampiran 1 Gambar sapi madura (A), sapi sumba ongole (B), dan sapi peranakan
ongole (C)
A
B
C
(Sumber: http://ditjennak.deptan.go.id)
9
Lampiran 2 Posisi penempelan primer AF 320 dan AF321 pada ruas ekson dan
intron 4 gen BCKDHA Bos taurus (NW1493616)
1
51
101
151
201
agggccgcat
gtggggagcg
ccgggaggca
tggatttgtg
gaaggcgagg
atccttctac
cagcagccct
ggtacgtcgg
gtctccgtgg
tctacattag
atgaccaact
ggacgacaca
aggtcagcca
agacaggtca
atggcgaaga
gacctggtgt
ggccctatga
ggctcagtcc
ggggacacac
ttggccagta
agtggggccc
cgcctgctca
Keterangan: urutan nukleotida yang digarisbawahi merupakan primer AF320 pada
posisi nukleotida ke 1-20 dan primer AF321 pada posisi nukleotida
ke 201-220
10
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Januari 1992. Penulis
merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Bambang Sartono
dan Masita Damanik
Penulis lulus dari SMAN 2 Ciputat (SMAN 4 Kota Tangerang Selatan)
pada tahun 2009 dan melanjutkan pendidikan di Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
Selama masa studi di IPB penulis aktif di berbagai organisasi mahasiswa.
Tahun 2010 sebagai ketua divisi kesejahteraan UKM PSM IPB Agria Swara dan
sekretaris divisi Pengembangan Sumberdaya Manusia (PSDM) Himpunan
Mahasiswa Biologi (HIMABIO) IPB, tahun 2011 sebagai bendahara divisi
kesejahteraan UKM PSM IPB Agria Swara dan anggota divisi Informasi dan
Komunikasi (INFOKOM) Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) IPB, tahun
2012 sebagai sekretaris sekaligus delegasi Institut Pertanian Bogor dalam Festival
Luar Negeri “The 4th International Mission in Art and Culture” di Finlandia,
tahun 2013 sebagai ketua divisi sponsorship sekaligus delegasi Institut Pertanian
Bogor dalam Festival Luar Negeri “The 5th International Mission in Art and
Culture” serta terlibat dalam beberapa kepanitiaan kegiatan kampus seperti
Konser Tahunan 2011 PSM IPB Agria Swara “Harmony and Cacaphony”, Grand
Biodiversity, Masa Orientasi dan Informasi Biologi (MORFOLOGI) Angkatan 47,
Pesta Sains Nasional 2011, Konser Tahunan 2012 PSM IPB Agria Swara
“Chantelier Charms II”, dan Konser Tahunan 2013 PSM IPB Agria Swara
“Vocamorphosa”. Penulis pernah meraih penghargaan juara II lomba Paduan
Suara Lagu Perjuangan di Universitas Tarumanegara bersama PSM IPB Agria
Swara tahun 2010 dan 2011, juara III dan juara favorit lomba akustik SPIRIT
FMIPA 2011, juara 3 lomba akustik “The 3rd FORTEX 2011”, Himpunan
Mahasiswa Hasil Hutan IPB, juara III lomba lari esrafet putri SPIRIT FMIPA
2012, juara I lomba akustik “The 4th FORTEX 2012” Himpunan Mahasiswa Hasil
Hutan IPB. Penulis pernah menjadi pengisi acara di beberapa kegiatan kampus
dan luar kampus, baik bersama PSM IPB Agria Swara maupun Akustik Biologi
46 (Accoulogy).
Penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar Tingkat Persiapan
Bersama tahun 2011, 2012, dan 2013, Struktur Hewan, Ilmu Lingkungan, dan
Vertebrata tahun 2013. Penulis telah melakukan praktik lapangan pada bulan Juli
2012 di CV. Bening Jati Anugerah, Jawa Barat. Selama studi penulis juga
menerima beasiswa Paguyuban Orangtua Mahasiswa (POM) dan Peningkatan
Prestasi Akademik (PPA).
GEN BRANCHED CHAIN KETOACID DEHYDROGENASE E1-α
POLYPEPTIDE (BCKDHA) PADA SAPI
YOVITA SARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Nukleotida
Ruas Ekson 4 Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide
(BCKDHA) pada Sapi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Yovita Sari
NIM G34090028
ABSTRAK
YOVITA SARI. Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen Branched
Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) pada Sapi.
Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI.
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) merupakan
kompleks enzim yang berperan dalam mengubah asam amino bercabang
(leusin, isoleusin, dan valin) menjadi α-keto agar dapat masuk ke siklus
Krebs. Defisiensi dari kompleks enzim BCKD akan menyebabkan
penyakit Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Penelitian ini dilakukan
untuk menganalisis keragaman nukleotida ruas ekson 4 dari gen BCKDHA
pada sapi. Analisis varian gen BCKDHA dilakukan terhadap lima sampel
DNA sapi madura, tiga sampel DNA sapi sumba ongole (so), dan tiga
sampel DNA sapi peranakan ongole (po) dan perunutan nukleotida
dilakukan terhadap produk PCR dengan menggunakan metode sampel
DNA pooling. Varian yang ditemukan pada ekson 4, yaitu G36T pada sapi
po. Varian ini termasuk substitusi transversi yang mengubah asam
glutamat (GAA) menjadi stop kodon (TAA). Varian berikutnya G144C
ditemukan pada intron 4 pada sapi madura dan sapi so.
Kata kunci: BCKDHA, ekson 4, varian, DNA pooling, MSUD.
YOVITA SARI. Variability of Exon 4 Nucleotides of Branched Chain
Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Gene on Cattle.
Supervised by ACHMAD FARAJALLAH and DYAH PERWITASARI.
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) is the enzyme
complex that have a role in changing branched chain amino acid (leusin,
isoleusin, and valin) into α-keto which can involve in Crebs cycle.
Deficiency of enzyme complex BCKD will cause Maple Syrup Urine
Disease (MSUD). This research aimed to analyze the variability of exon 4
nucleotides of BCKDHA gene on cattle. Analysis of variants from
BCKDHA gene was performed using 5 DNA samples from madura cattle,
3 DNA samples from sumba ongole (so) cattle, and 3 DNA samples from
ongole descendant cattle and nucleotides sequencing was conducted on
PCR product from amplification of DNA pooling sample method. The
variant of the exon 4 was G36T on po cattle. This variant revealed
transversion substitution which changed Glu (GAA) to stop codon (TAA).
The other variant, G144C was found in intron 4 of madura and so cattle.
Keywords : BCKDHA, exon 4, variant, DNA pooling, MSUD.
KERAGAMAN NUKLEOTIDA RUAS EKSON 4
GEN BRANCHED CHAIN KETOACID DEHYDROGENASE E1-α
POLYPEPTIDE (BCKDHA) PADA SAPI
YOVITA SARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen Branched
Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA)
pada Sapi
Nama
: Yovita Sari
NIM
: G34090028
Disetujui oleh
Dr Achmad Farajallah
Pembimbing I
Dr Dyah Perwitasari
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari-Juni 2013 ini
ialah keragaman, dengan judul Keragaman Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) pada
Sapi. Penelitian dilaksanakan di laboratorium molekuler, bagian Fungsi Hayati
dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Achmad Farajallah dan
Ibu Dr Dyah Perwitasari selaku dosen pembimbing, serta Dr Ir Utut Widyastuti,
MSi selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam
penyusunan skripsi ini. Penghargaan penulis sampaikan kepada keluarga besar
zoologi (Mbak Tini, Mbak Ani, Pak Adi, Ibu Maria Ulfah, Kak Wildan, Kak
Yanti, Kak Esa, Kak Lora, Kak Vendi, Mbak Kanthi, Kak Bulan, Kak Lili, Kak
Rendi, dan Kak Made) yang telah berbagi ilmu dan bimbingan selama penelitian.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga,
atas segala doa dan kasih sayangnya, kepada sahabat seperjuangan (Della Yuniar
Windi, Muhamad Abduh, dan Ria Maria Bakrie) atas segala bantuan, nasehat, dan
dukungan yang telah diberikan selama penelitian ini, kepada teman-teman Pondok
Unyu (Resty, Chipy, Sandra, Ika, Imas, dan Novi), Zuhad Syafril Huda, keluarga
besar PSM IPB Agria Swara (khususnya Nadia, Dini, Stefy, Firdha, Esa, Adhit,
Wengki, dan Annisa), dan teman-teman biologi angkatan 46 (Nurifah, Dheasinta,
dan Surya), angkatan 47, dan 48 yang telah memberikan motivasi kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat dan menambah ilmu
pengetahuan kita semua. Saran dan kritik penulis harapkan untuk hasil yang lebih
baik.
Bogor, September 2013
Yovita Sari
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan
2
METODE
2
Sampel
2
Ekstraksi dan Isolasi DNA
2
Amplifikasi gen BCKDHA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
2
Perunutan Nukleotida Gen BCKDHA
3
Analisis Runutan DNA
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Hasil
3
Pembahasan
5
SIMPULAN
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
8
RIWAYAT HIDUP
10
DAFTAR TABEL
1 Hasil pensejajaran nukleotida ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari
sampel sapi madura, sapi so, dan sapi po terhadap nukleotida gen
BCKDHA Bos taurus (NW1493616)
2 Ringkasan hasil translasi protein
4
5
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari sampel sapi
madura (m), sapi sumba ongole (so), dan sapi peranakan ongole (po)
dalam PAGE 6% dengan pewarnaan sensitif perak
2 Varian pada ekson 4 yang terjadi pada sampel sapi po dan varian pada
intron 4 yang terjadi pada sapi madura dan sapi so
3
4
DAFTAR LAMPIRAN
1 Gambar sapi madura (A), sapi sumba ongole (B), dan sapi peranakan
ongole (C)
2 Posisi penempelan primer AF320 dan AF321 pada ruas ekson dan
intron 4 gen BCKDHA Bos taurus (NW1493616)
8
9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi merupakan salah satu hewan ternak dari famili Bovidae. Bangsa sapi
lokal di Indonesia antara lain sapi bali, sapi madura, sapi aceh, sapi pesisir, dan
sapi peranakan ongole. Ongole murni pertama kali dibawa ke Pulau Sumba yang
kemudian dikenal dengan sebutan sumba ongole (so) dan selanjutnya dibawa ke
wilayah lain di Indonesia untuk disebarkan. Sapi ongole yang masuk ke pulau
Jawa disilangkan dengan sapi lokal jawa membentuk sapi peranakan ongole (po),
sedangkan sapi ongole yang masuk ke pulau Madura disilangkan dengan banteng
(Bos javanicus) membentuk sapi madura. Sapi madura mempunyai kemampuan
adaptasi yang baik dan toleran terhadap iklim panas/tropik. Ternak sapi madura
yang berada di pulau Madura dikelola dengan baik dalam jangka waktu yang
panjang (Mohamad et al. 2009) (Lampiran 1).
Mitokondria merupakan organel yang berperan sebagai pusat pembangkitan
energi dan pusat metabolisme. Reaksi metabolisme intermediet merupakan fungsi
vital organel mitokondria. Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase (BCKD)
merupakan kompleks enzim yang berperan dalam metabolisme intermediet siklus
Krebs, yaitu mengubah asam amino bercabang (leusin, isoleusin, dan valin)
menjadi α-keto agar dapat masuk ke siklus Krebs. Defisiensi dari kompleks enzim
BCKD akan menyebabkan penyakit Maple Syrup Urine Disease (MSUD)
(Skvorak 2009). Defisiensi dari BCKD ditandai dengan bau sirup maple pada urin
dan selaput lendir (di telinga, anus, dan rongga mulut) akibat meningkatnya
konsentrasi asam amino bercabang di dalam plasma. Ada tiga penyebab defisiensi
dari BCKD yang dilaporkan pada manusia. Penyebab pertama adalah autoantigen
dan penyebab kedua anti-mitochondrial antibodies (Friedrich et al. 2012).
Peluang terbesar dari dua penyebab pertama adalah akibat akumulasi limbah
radikal bebas dari reaksi reduksi-oksidasi sistem pembangkitan energi
mitokondria dan dari polutan lingkungan. Hal ini menunjukkan bahwa munculnya
gejala klinis MSUD berkaitan dengan penuaan (ageing). Penyebab ketiga adalah
mutasi genetik (Zhang et al. 1990, Friedrich et al. 2012). Selain itu, mutasi pada
gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA)
dapat mengubah efisiensi kompleks enzim BCKD menjadi lebih efisien ataupun
sebaliknya. Mutasi yang menyebabkan penyakit MSUD adalah perubahan basa C
menjadi T pada daerah 5’ ekson 2 dari subunit E1-α gen BCKDHA (Healy 1996).
Titik-titik mutasi di luar ekson 2 gen BCKDHA pada sapi belum pernah
dilaporkan (Zhang et al. 1990), termasuk mutasi pada ekson 4 dari gen ini.
Berbagai metode telah banyak berkembang dan dapat digunakan untuk
mendeteksi mutasi pada tingkat DNA. Metode yang sering digunakan adalah
metode PCR dan elektroforesis terhadap sampel yang dijadikan dalam satu tabung
(DNA pooling) yang dilanjutkan dengan penentuan runutan nukleotida atau DNA
sequencing. Teknik DNA pooling untuk perunutan merupakan teknik dalam
mendeteksi delesi, insersi, dan substitusi nukleotida dikenal sebagai Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
2
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman nukleotida ruas ekson 4
dari gen BCKDHA pada sapi.
METODE
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai Juni 2013 di Laboratorium
Molekuler, Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel
Sampel yang digunakan berjumlah 11, terdiri atas lima sampel darah dan enam
sampel DNA sapi. Sampel darah yang digunakan merupakan koleksi Dr Dyah
Perwitasari. Sampel darah diperoleh dari lima ekor sapi madura dari Kabupaten
Sumenep, Madura yang diperuntukkan sebagai sapi sonok (sapi jinak dan penurut).
Sampel DNA terdiri atas tiga sampel DNA sapi sumba ongole (so) dan tiga sampel
DNA sapi peranakan ongole (po) yang merupakan koleksi dari Dr Jakaria,
Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Ternak, Fakultas Peternakan.
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan dari koleksi sel-sel darah sapi madura yang
disimpan dalam alkohol menggunakan Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood
(Geneaid) dengan sedikit modifikasi. Modifikasi yang dilakukan berkenaan dengan
penghilangan alkohol dari sampel darah agar tidak menggangu proses ekstraksi
selanjutnya.
Amplifikasi gen BCKDHA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi nukleotida ruas ekson dan intron 4 gen BCKDHA dilakukan
terhadap masing-masing pooled sampel, yaitu lima sampel sapi madura, tiga sampel
sapi so, dan tiga sampel sapi po menggunakan primer forward AF320 (5’AGGGCCGCATATCCTTCTAC)
dan
primer
reverse
AF321
(5’CTAATGTAGACCTCGCCTTCTGA) dengan panjang amplikon 224 pb (Lampiran 2).
Reaksi PCR menggunakan taq KAPA2G Fast DNA polymerase beserta bufernya yang
mengandung MgCl2 (1,5 mM), campuran dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP,
masing-masing dengan konsentrasi 10 mM), dan primer AF320 dan AF321 (masingmasing dengan konsentrasi 1 mM). Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi pradenaturasi
pada suhu 90oC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan 28 siklus yang terdiri atas
denaturasi suhu 94oC selama 10 detik, penempelan primer suhu 58oC selama 1,5 menit,
pemanjangan suhu 72oC selama 2 menit, dan pemanjangan akhir suhu 72oC selama 2
menit. Keberhasilan PCR diamati menggunakan metode polyacrilamide gel
electrophoresis (PAGE) 6% dengan penanda 100 pb yang dijalankan pada tegangan 200
V selama 40 menit. Visualisasi pita DNA setelah elektroforesis dilakukan dengan
pewarnaan sensitif perak (Byun et al. 2009).
3
Perunutan Nukleotida Gen BCKDHA
Perunutan nukeotida dilakukan terhadap amplikon yang menunjukkan pita
tunggal dan tebal di atas gel poliakrilamid. Untuk itu, amplikon dari lima sampel DNA
sapi madura, tiga sampel DNA sapi so, dan tiga sampel DNA sapi po masing-masing
disatukan (DNA pooling) dan dijadikan cetakan dalam reaksi perunutan nukleotida
menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi awal. Reaksi perunutan
menggunakan metode sequencing big dye terminator yang dilakukan oleh Lembaga
Komersial jasa sequencing First Base.
Analisis Runutan DNA
Hasil perunutan dari arah forward dan reverse diedit berdasarkan kromatogram
yang dihasilkan oleh mesin elektroforesis sequencing menggunakan program BioEdit
versi 7.1.11. Kemudian, keduanya digabung menjadi satu runutan nukleotida.
Pengeditan runutan lebih lanjut dilakukan secara manual berdasarkan penyandian
menjadi polipeptida. Setelah diedit, runutan nukleotida dari masing-masing sampel sapi
tersebut saling disejajarkan menggunakan MEGA versi 5.0.5 (Moleculer Evolutionary
Genetics Analysis).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA
Ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari sampel sapi madura, sapi so, dan sapi po
berhasil teramplifikasi menggunakan pasangan primer AF320 dan AF321 dalam mesin
thermocycler dan terdeteksi dengan PAGE 6% dengan ukuran amplikon sekitar 224 pb
yang sesuai dengan desain primer (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari sampel sapi madura
(m), sapi sumba ongole (so), dan sapi peranakan ongole (po) dalam PAGE
6% dengan pewarnaan sensitif perak. Keterangan p= penanda 100 pb.
Analisis Varian Nukleotida Ruas Ekson 4 Gen BCKDHA
Adanya varian nukleotida terlihat pada puncak kromatogram yang saling
tumpang tindih. Varian basa G dan T ditemukan pada sampel sapi po (Gambar 2A).
Varian basa G dan C ditemukan pada sampel sapi madura dan sapi so (Gambar 2B dan
2C). Analisis selanjutnya menggabungkan runutan amplikon gen BCKDHA dari arah
4
forward dan reverse. Hasil perunutan gen BCKDHA, yaitu sepanjang 220 nukleotida,
terdiri atas 111 nukleotida ruas ekson 4 dan 109 nukleotida ruas intron 4. Hasil
pensejajaran nukleotida ruas ekson 4 dari sampel sapi madura, sapi so, dan sapi po
terhadap Bos taurus dengan nomor akses GeneBank NW1493616 menunjukkan bahwa
B. taurus, sapi madura, dan sapi so memiliki basa G pada posisi nukleotida ke 36,
sedangkan sapi po memiliki varian nukleotida, yaitu basa G dan T. Varian nukleotida
berikutnya ditemukan pada intron 4, yaitu basa G dan C pada posisi nukleotida ke 144
pada sampel sapi madura dan sapi so, berbeda dengan B. taurus yang memiliki basa G
dan sapi po yang memiliki basa C (Tabel 1).
A
B
C
Gambar 2 Varian pada ekson 4 yang terjadi pada sampel sapi po (A) dan varian
pada intron 4 yang terjadi pada sapi madura (B) dan sapi so (C).
Tabel 1 Hasil pensejajaran nukleotida ekson dan intron 4 gen BCKDHA dari
sampel sapi madura, so, dan po terhadap nukleotida gen BCKDHA Bos
Taurus (NW1493616)
Ekson 4
Intron 4
Bangsa
1 1 1 1 1 1 1
3 3 3 3 3 3 3
4 4 4 4 4 4 4
3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7
Bos taurus (NW1493616)
G G C G A A G
A G T G G G G
Sapi madura
G G C G A A G
A G T G/C G G G
Sapi sumba ongole (so)
G G C G A A G
A G T G/C G G G
Sapi peranakan ongole (po)
G G C G/T A A G
A G T C G G G
Keterangan: Nomor posisi nukleotida dibaca secara vertikal di tiga baris pertama.
Bagian yang dicetak tebal menunjukkan adanya varian.
Translasi Protein
Translasi protein dilakukan setelah pensejajaran nukleotida ruas ekson dan
intron 4 gen BCKDHA. Berdasarkan translasi protein gen BCKDHA pada B.
taurus (NW1493616), varian G36T pada sapi po menyebabkan perubahan asam
glutamat (E) menjadi stop kodon (*) pada posisi asam amino ke 147 (Tabel 2).
Asam amino yang ditranslasikan berjumlah 37 asam amino. Varian G144C tidak
menyebabkan perubahan asam amino karena intron tidak ditranslasikan.
5
Tabel 2 Ringkasan hasil translasi protein
Bangsa
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5
6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5
Bos taurus (NW1493616)
GR I S FYMTNYG EE GT HVGSA
Sapi madura
GR I S FYMTNYG EE GT HVGSA
Sapi sumba ongole
GR I S FYMTNYG EE GT HVGSA
Sapi peranakan ongole
GR I S FYMTNYG * E GT HVGSA
Keterangan: Nomor posisi asam amino dibaca secara vertikal di tiga baris pertama.
Bagian yang dicetak tebal menunjukkan adanya mutasi.
Pembahasan
Amplifikasi dan visualisasi ekson dan intron 4 gen BCKDHA menghasilkan
pita yang tebal dan beberapa pita tambahan yang samar-samar. Pita tambahan
tersebut merupakan pengotor yang terdeteksi pada gel poliakrilamid setelah
pewarnaan perak dan tidak menggangu runutan amplikon. Hal tersebut didukung
dengan puncak kromatogram yang jelas dengan jarak antar puncak yang sebagian
besar sama. Pewarnaan sensitif perak yang digunakan untuk mendeteksi pita-pita
DNA dalam gel poliakrilamid sangat sesuai dengan volume dan konsentrasi
sampel yang sangat kecil, yaitu 2 µl [10 ng] (Avise 1994). Hal ini dikarenakan
pewarnaan sensitif perak merupakan metode dengan sensitifitas yang sangat tinggi
dan cepat dalam mendeteksi pita-pita DNA yang sangat kecil dengan konsentrasi
berkisar 10 ng (Byun et al. 2009).
Adanya dua puncak pada kromatogram yang saling tumpang tindih
merupakan sebuah data kualitatif yang diharapkan, karena menunjukkan adanya
varian pada ekson dan intron 4. Puncak-puncak tersebut merupakan hasil dari
pembacaan mesin perunutan PCR dan elektroforesis terhadap sampel yang
dijadikan dalam satu tabung (DNA pooling). Secara umum, teknik DNA pooling
untuk perunutan merupakan teknik dalam mendeteksi delesi, insersi, dan
substitusi nukleotida dikenal sebagai Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
Teknik DNA pooling yang digunakan dalam penelitian ini merupakan teknik yang
dapat mendeteksi varian pada suatu lokus namun varian tersebut tidak dapat
diketahui terjadi pada sampel yang mana. Hal ini karena sampel-sampel tersebut
dijadikan dalam satu tabung (pooling) sehingga teknik ini sangat hemat sebagai
penanda molekuler dan proses screening pada sampel dapat terjadi secara tepat.
Perunutan ekson dan intron 4 gen BCKDHA menunjukkan bahwa varian
G36T hanya ditemukan pada sapi po, sedangkan varian G144C ditemukan pada
intron 4 pada sapi madura dan sapi so. Varian G144C pada sapi madura dan sapi
so tidak menyebabkan perubahan asam amino karena intron tidak ditranslasikan.
Varian G36T pada sapi po menyebabkan perubahan asam amino dari asam
glutamat (GAA) atau (E) menjadi stop kodon (TAA) atau (*). Perbedaan asam
amino pada varian G36T karena perubahan nukleotida pada posisi basa pertama.
Perubahan tersebut termasuk mutasi substitusi transversi. Substitusi transversi
adalah pertukaran atau pergantian satu basa purin dengan satu basa pirimidin atau
sebaliknya. Selain itu, mutasi tersebut bersifat nonsense karena menyebabkan
6
perubahan suatu asam amino menjadi stop kodon prematur, yaitu asam glutamat
menjadi stop kodon (Elrod dan Stansfield 2002).
Stop kodon prematur adalah mutasi yang mengakibatkan sel berhenti
membaca instruksi genetika pada proses sintesis protein sehingga rantai protein
yang dihasilkan tidak sempurna (Elrod dan Stansfield 2002). Ketidaksempurnaan
rantai protein yang dihasilkan dapat mempengaruhi pembentukan suatu protein
yang fungsional, seperti enzim, sedangkan enzim mempunyai peranan penting
dalam kegiatan metabolisme. Defisiensi dan tidak terbentuknya suatu enzim dapat
menghambat kegiatan metabolisme, bahkan dapat menyebabkan suatu penyakit,
seperti penyakit MSUD.
Titik-titik mutasi di luar ekson 2 gen BCKDHA pada sapi belum pernah
dilaporkan (Zhang et al. 1990), termasuk mutasi pada ekson 4 dari gen ini. Healy
(1996) melaporkan adanya mutasi pada ekson 2 subunit E1-α gen BCKDHA pada
sapi Polled Shothorn dengan metode PCR. Mutasi yang menyebabkan penyakit
MSUD adalah perubahan basa C menjadi T pada daerah 5’ ekson 2 dari subunit
E1-α gen BCKDHA. Kelainan pada gen BCKDHA penyebab MSUD ditemukan
pada individu homozigot resesif karena MSUD termasuk penyakit resesif
autosomal (King 2013). Walaupun terjadi mutasi pada ekson 4, namun sapi po
dalam penelitian ini belum tentu mengalami kelainan. Hal ini disebabkan oleh
kemungkinan kondisi heterozigot pada gen BCKDHA. Penyakit resesif autosomal
muncul saat individu memiliki dua kopi gen mutan (homozigot).
SIMPULAN
Perunutan nukleotida ruas ekson dan intron 4 gen BCKDHA pada sapi
madura, sapi so, dan sapi po dengan teknik sampel DNA pooling menunjukkan
bahwa ekson 4 memiliki varian G36T pada sapi po. Varian berikutnya, yaitu
G144C ditemukan pada intron 4 pada sapi madura dan sapi so. Analisis varian
menunjukkan bahwa varian G36T menyebabkan perubahan asam amino dari asam
glutamat (GAA) menjadi stop kodon (TAA). Perubahan tersebut termasuk mutasi
substitusi transversi dan bersifat nonsense.
DAFTAR PUSTAKA
Avise JC. 1994. Molecular Markers, Natural History and Evolution. New York
(USA): Chapman & Hall.
Bunik V, Fernie AR. 2009. Metabolic control exerted by the 2-oxoglutarate
dehydrogenase reaction: a cross-kingdom comparison of the crossroad
between energy production and nitrogen assimilation. Journal
Biochemistry. 422:405-421.
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver
staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Analytical
Biochemistry. 385:174-175.
Elrod SL, Stansfield WD. 2002. Schaums’s Outlines of Theory and Problems of
Genetics, Fourth Edition. California (USA): The McGraw-Hill Companies.
7
Friedrich T, Lambert AM, Masino MA, Downes GB. 2012. Mutations of
zebrafish dihydrolipoamide branched-chain transacylase E2 results in
motor dysfunction and models maple syrup urine disease. Disease Model
and Mechanism. 5:248-258.
Healy PJ. 1996. Testing for Undesirable Traits in Cattle: An Australian
Perspective. Journal Animal Sciences. 74:917-922.
King MW. 2013. Introduction to Maple Syrup Urine Disease: MSUD.
[terhubung berkala] http://themedicalbiochemistrypage.org/msud.php
diakses 2013 Agustus 18.
Mohamad K, Olsson M, van Tol HTA, Mikko S, Vlamings BH, Andersson G,
Martinez HR, Purwantara B, Paling RW, Colenbrader B et al. 2009. On
the origin of Indonesian cattle. PLos ONE. 4:3-4.
Skvorak KJ. 2009. Animal models of maple syrup urine disease. Journal
Inheritance Metabolism Disease. 32:8-9.
Zhang B, Healy PJ, Zhao Y, Crabb DW, Harris RA. 1990. Premature translation
termination of the pre-E1a subunit of the branched chain ketoacid
dehydrogenase as a cause of maple syrup urine disease in polled hereford
calves. Journal Biological Chemistry. 265:2425-2427.
8
Lampiran 1 Gambar sapi madura (A), sapi sumba ongole (B), dan sapi peranakan
ongole (C)
A
B
C
(Sumber: http://ditjennak.deptan.go.id)
9
Lampiran 2 Posisi penempelan primer AF 320 dan AF321 pada ruas ekson dan
intron 4 gen BCKDHA Bos taurus (NW1493616)
1
51
101
151
201
agggccgcat
gtggggagcg
ccgggaggca
tggatttgtg
gaaggcgagg
atccttctac
cagcagccct
ggtacgtcgg
gtctccgtgg
tctacattag
atgaccaact
ggacgacaca
aggtcagcca
agacaggtca
atggcgaaga
gacctggtgt
ggccctatga
ggctcagtcc
ggggacacac
ttggccagta
agtggggccc
cgcctgctca
Keterangan: urutan nukleotida yang digarisbawahi merupakan primer AF320 pada
posisi nukleotida ke 1-20 dan primer AF321 pada posisi nukleotida
ke 201-220
10
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Januari 1992. Penulis
merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Bambang Sartono
dan Masita Damanik
Penulis lulus dari SMAN 2 Ciputat (SMAN 4 Kota Tangerang Selatan)
pada tahun 2009 dan melanjutkan pendidikan di Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
Selama masa studi di IPB penulis aktif di berbagai organisasi mahasiswa.
Tahun 2010 sebagai ketua divisi kesejahteraan UKM PSM IPB Agria Swara dan
sekretaris divisi Pengembangan Sumberdaya Manusia (PSDM) Himpunan
Mahasiswa Biologi (HIMABIO) IPB, tahun 2011 sebagai bendahara divisi
kesejahteraan UKM PSM IPB Agria Swara dan anggota divisi Informasi dan
Komunikasi (INFOKOM) Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) IPB, tahun
2012 sebagai sekretaris sekaligus delegasi Institut Pertanian Bogor dalam Festival
Luar Negeri “The 4th International Mission in Art and Culture” di Finlandia,
tahun 2013 sebagai ketua divisi sponsorship sekaligus delegasi Institut Pertanian
Bogor dalam Festival Luar Negeri “The 5th International Mission in Art and
Culture” serta terlibat dalam beberapa kepanitiaan kegiatan kampus seperti
Konser Tahunan 2011 PSM IPB Agria Swara “Harmony and Cacaphony”, Grand
Biodiversity, Masa Orientasi dan Informasi Biologi (MORFOLOGI) Angkatan 47,
Pesta Sains Nasional 2011, Konser Tahunan 2012 PSM IPB Agria Swara
“Chantelier Charms II”, dan Konser Tahunan 2013 PSM IPB Agria Swara
“Vocamorphosa”. Penulis pernah meraih penghargaan juara II lomba Paduan
Suara Lagu Perjuangan di Universitas Tarumanegara bersama PSM IPB Agria
Swara tahun 2010 dan 2011, juara III dan juara favorit lomba akustik SPIRIT
FMIPA 2011, juara 3 lomba akustik “The 3rd FORTEX 2011”, Himpunan
Mahasiswa Hasil Hutan IPB, juara III lomba lari esrafet putri SPIRIT FMIPA
2012, juara I lomba akustik “The 4th FORTEX 2012” Himpunan Mahasiswa Hasil
Hutan IPB. Penulis pernah menjadi pengisi acara di beberapa kegiatan kampus
dan luar kampus, baik bersama PSM IPB Agria Swara maupun Akustik Biologi
46 (Accoulogy).
Penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar Tingkat Persiapan
Bersama tahun 2011, 2012, dan 2013, Struktur Hewan, Ilmu Lingkungan, dan
Vertebrata tahun 2013. Penulis telah melakukan praktik lapangan pada bulan Juli
2012 di CV. Bening Jati Anugerah, Jawa Barat. Selama studi penulis juga
menerima beasiswa Paguyuban Orangtua Mahasiswa (POM) dan Peningkatan
Prestasi Akademik (PPA).