Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura
KERAGAMAN GEN BRANCHED CHAIN KETOACID
DEHYDROGENASE E1-α POLYPEPTIDE (BCKDHA) EKSON 2
DAN 3 PADA SAPI MADURA
DELLA YUNIAR WINDI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Gen
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2
dan 3 pada Sapi Madura adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Della Yuniar Windi
NIM G34090107
ABSTRAK
DELLA YUNIAR WINDI. Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid
Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura.
Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI.
Kompleks enzim Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase (BCKD)
berperan dalam metabolisme Branched Chain Amino Acids (BCAA) yang ada
dalam mitokondria. Subunit pertama (E1-α) dari kompleks enzim BCKD
disandikan oleh gen BCKDHA. Mutasi pada gen BCKDHA dapat menyebabkan
defisiensi pada kompleks enzim BCKD dan akhirnya dapat menyebabkan Maple
Syrup Urine Disease (MSUD). Tujuan penelitian ini adalah mendeteksi
keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura dengan metode
Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism (PCRSSCP). Berdasarkan pola migrasi utas tunggal, ditemukan empat tipe gen
BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura, yaitu A, B, C dan D. Pada sapi
madura yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C,
sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat, yaitu A, B, C dan D.
Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di Bangkalan
sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
Kata kunci: BCKDHA, ekson 2, ekson 3, gen, sapi madura, SSCP, tipe gen
ABSTRACT
DELLA YUNIAR WINDI. Variability of Exon 2 and 3 Branched Chain Ketoacid
Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) gene in Madura Cattle. Supervised
by ACHMAD FARAJALLAH and DYAH PERWITASARI.
Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) enzyme complex
have a role in metabolism of Branched Chain Amino Acid (BCAA). BCKDHA
gene encoding the first subunit of these enzyme complex within mithochondrion.
Mutation in BCKDHA gene caused deficiency of BCKD complex that caused
Maple Syrup Urine Disease (MSUD). The aim of this research is to detect
variability of BCKDHA gene in madura cattle using Polymerase Chain ReactionSingle Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) method. According to
migration pattern of single strand in PAGE 9%, there was four types found in
exon 2 and 3 BCKDHA gene in madura cattle, that is A, B, C and D. There was
two types of gene found in cattle that its origin from Bangkalan, which is A and C,
whereas type that found in Sampang was four, which is A, B, C and D. The
highest frequency in two locations is type A, in Bangkalan (83%) and in Sampang
(50%).
Keywords: BCKDHA, exon 2, exon 3, gene, madura cattle, SSCP, gene type.
KERAGAMAN GEN BRANCHED CHAIN KETOACID
DEHYDROGENASE E1-α POLYPEPTIDE (BCKDHA) EKSON 2
DAN 3 PADA SAPI MADURA
DELLA YUNIAR WINDI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α
Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura
Nama
: Della Yuniar Windi
NIM
: G34090107
Disetujui oleh
Dr Achmad Farajallah
Pembimbing I
Dr Dyah Perwitasari
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari sampai bulan Juli
2013 ialah Keragaman, dengan judul Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid
Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Achmad Farajallah dan Ibu
Dr Dyah Perwitasari selaku dosen pembimbing, serta Prof Dr Ir Alex Hartana
selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam penyusunan
skripsi ini. Ungkapan terima kasih disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Kak Wildan, Kak Yanti, Kak Vendi, Kak Lora, Kak
Bulan dan segenap penghuni Lab. Molekuler, teman-teman tercinta Nadia, Ines,
Lina, Shelly, Ruth, Gloria, Agus, Dhyah, Hendri, Yovita, Abduh, Olii, Zahra,
Manda, Noyara dan sejawat BIO46 lainnya serta Penghuni Zoo Corner yang saya
hormati. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Della Yuniar Windi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE PENELITIAN
2
Waktu dan Tempat
2
Metode
2
Ekstraksi DNA
2
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
2
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode SSCP
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Hasil
3
Pembahasan
5
SIMPULAN
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
8
RIWAYAT HIDUP
9
DAFTAR TABEL
1 Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura
4
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi gen BCKDHA menggunakan metode PCR pada
gel poliakrilamida 6%
2 Hasil pendeteksian keragaman gen BCKDHA menggunakan
metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 9% (A)
Diagram elektroforesis (zymogram) (B)
3
4
4
DAFTAR LAMPIRAN
1 Posisi penempelan primer AF318 dan AF319 pada peta gen BCKDHA
ekson 2 dan 3 sapi Bos taurus (NW001493616)
8
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi merupakan hewan dengan keanekaragaman tinggi dan ditemukan
hampir di semua negara termasuk Indonesia. Beberapa bangsa sapi lokal di
Indonesia antara lain sapi bali, madura, aceh, pesisir dan peranakan ongole. Sapi
madura merupakan hasil persilangan sapi zebu yang berpunuk (Bos indicus)
dengan banteng (Bos javanicus). Sapi madura berkembang di pulau Madura serta
pulau-pulau sekitarnya dan merupakan sapi tipe dwiguna (pedaging dan pekerja).
Sapi madura memiliki kemampuan adaptasi yang baik dan toleran terhadap iklim
panas/tropik, ternak sapi madura yang berada di pulau Madura dikelola dengan
baik dan dalam jangka waktu yang panjang (Mohamad et al. 2009)
Ada tiga kompleks enzim yang berkaitan dengan fungsi normal
mitokondria pada mamalia dan berperan penting dalam metabolisme intermediet
karbohidrat dan asam amino. Kompleks enzim tersebut adalah Pyruvat
Dehydrogenase Complex (PDC), α-Ketoglutaratate Dehydrogenase Complex (αKGDC) dan Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase Complex (BCKDC)
(Patel dan Harris 1995). Kompleks enzim BCKD pada sel eukariot sangat
terpelihara. BCKD kompleks terdiri atas empat subunit polipeptida enzim, yaitu
E1-α, E1-β, E2 dan E3. Subunit E1-α disandikan oleh gen Branched Chain
Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) yang berada pada
kromosom no. 19, panjang gen sekitar 55 kb dan terdiri atas 9 ekson (King 2013).
Kompleks enzim BCKAD berperan dalam metabolisme tiga asam amino esensial,
yaitu isoleusina, leusina dan valina. Tiga asam amino ini disebut juga Branched
Chain Amino Acid (BCAA) atau asam amino bercabang. Pada keadaan normal,
BCAA akan dihancurkan oleh kompleks enzim BCKD. Jika enzim ini mengalami
defisiensi maka BCAA tidak bisa masuk kedalam rangkaian metabolisme
mitokondria sehingga terjadi akumulasi yang tinggi dalam darah dan jaringan. Hal
ini disebut dengan kondisi Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Ada tiga
penyebab defisiensi kompleks enzim BCKD yaitu autoantigen, anti-mitochondrial
antibodies (Strauss et al. 2009) dan mutasi genetik (Zhang et al. 1990).
Penyebab yang umum dari defisiensi kompleks BCKD adalah mutasi pada
gen BCKDHA. Mutasi gen BCKDHA ekson 2 pada anak sapi polled hereford
merupakan mutasi titik yang terjadi karena substitusi 248C/T pada kodon 6 dan
menyebabkan stop kodon prematur (Zhang et al. 1990). Dennis dan Healy (1999)
juga menemukan mutasi gen BCKDHA pada sapi polled shorthorn tetapi
mutasinya terjadi pada 1380C/T. Mutasi pada ekson selain di ekson 2 pada sapi
belum pernah ditemukan, dan mutasi pada sapi selain polled hereford dan polled
shorthorn juga belum pernah ditemukan.
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah Single Strand
Conformation Polymorphism (SSCP). Metode ini merupakan salah satu analisis
kejadian mutasi pada tingkat nukleotida dari fragmen DNA pendek menggunakan
produk dari Polymerase Chain Reaction (PCR) secara cepat. Mutasi dideteksi
berdasarkan perbedaan pola migrasi pita utas tunggal DNA pada gel
poliakrilamida (Hayashi 1991).
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keragaman gen BCKDHA ekson
2 dan 3 pada sapi madura dengan metode Single Strand Conformation
Polymorphism.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Juli 2013 di Bagian Fungsi
Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Metode
Ekstraksi DNA
Sampel darah sapi madura koleksi Dr. Dyah Perwitasari digunakan untuk
ekstraksi DNA. Sampel yang digunakan berjumlah 16 sampel yang berasal dari
Kabupaten Sampang (N=9) dan Kabupaten Bangkalan (N=7), Madura. Ekstraksi
DNA menggunakan cara manual mengikuti Sambrook et al. (1989) dengan sedikit
modifikasi. Urutan ekstraksi DNA yang dilakukan yaitu pelisisan sel, pemisahan
DNA, dan pengendapan (pemurnian) DNA. Pelisisan sel menggunakan larutan
bufer lisis 1x STE (NaCl 1M, Tris HCL 10-1 M, EDTA 10-2 M, pH 8.0), air
destilata, 10% Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan Proteinase K. Pemisahan DNA
menggunakan larutan NaCl 5M, fenol, dan Chloroform Isoamilakohol (CIAA)
dengan perbandingan 24:1. Pengendapan (pemurnian) DNA menggunakan larutan
NaCl 5M, alkohol absolut, dan alkohol 70%. Endapan DNA yang diperoleh
kemudian disuspensikan dalam 100 µl bufer TE (Tris HCl 10-1 M, EDTA 10-2 M,
pH 8.0) dan disimpan dalam freezer.
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
Amplifikasi gen BCKDHA ruas ekson 2 dan 3 dilakukan secara in vitro
menggunakan mesin PCR ESCO Swift Maxi Thermal Cycler. Bahan pereaksi
PCR yang digunakan untuk volume reaksi 25 µl adalah sampel DNA 1 µl (sekitar
50 ng), GoTaq® Green Master Mix 2X (Promega) sebanyak 12,5 µl (pH 8.5, 400
mM dNTP, 3mM MgCl2), primer forward AF318 5’-agcacccccacaggtggcag dan
primer reverse AF319 5’-cctgtcttgtggtccttagacc (Lampiran 1) dengan konsentrasi
0,1 µM masing-masing sebanyak 1 µl dan nuclease-free water (Promega)
sebanyak 9,5 µl. Kondisi PCR yang digunakan predenaturasi 95 °C dua menit,
denaturasi 95 °C 45 detik, suhu penempelan primer 60 °C satu menit,
pemanjangan DNA pada suhu 72 °C satu menit, dan pemanjangan DNA akhir
pada suhu 72 °C lima menit sebanyak 30 siklus. Visualisasi produk PCR dengan
menggunakan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE) 6% dalam bufer 1x
3
TBE (Tris HCl 10 mM, asam borat 1M, EDTA 0,1 mM). Elektroforesis dijalankan
pada gel vertikal pada kondisi tegangan 200 volt selama 40 menit. Proses
dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009) dengan sedikit modifikasi.
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan teknik pengendapan alkohol kemudian
dicampurkan dengan formamide dye (95% formamida, 0.2N NaOH, 0.1M EDTA).
Utas ganda DNA didenaturasi pada suhu 95 °C selama 10 menit kemudian
seketika dipindahkan ke icebath, lalu sebanyak 2 µl di-loading ke PAGE 9%.
PAGE 9% dibuat dengan rasio akrilamid:bisakrilamid = 59:1 untuk memperoleh
pori-pori yang memanjang sehingga bisa membedakan bentuk molekul. Setelah
itu elektroforesis dilakukan di lemari pendingin dengan suhu 4 °C pada tegangan
150 volt selama 6 jam. Kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et
al. 2009).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Amplifikasi Gen BCKDHA Ekson 2 dan 3
Gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura berhasil diamplifikasi
menggunakan metode PCR. Pasangan primer yang digunakan adalah AF318
sebagai primer forward dan AF319 sebagai primer reverse. Dari 16 sampel sapi
madura, yang berhasil diamplifikasi sebanyak 14 sampel dengan panjang fragmen
gen BCKDHA adalah sekitar 531 pb berdasarkan desain primer (Gambar 1). Oleh
karena itu persentase keberhasilan PCR yang dilakukan sebesar 85%.
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen BCKDHA menggunakan metode PCR pada
gel poliakrilamida 6%.
Keterangan: M = penanda DNA 100 pb; Nomor di bagian atas gambar adalah
nomor sampel sapi madura.
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode PCR-SSCP
Pendeteksian keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 dilakukan dengan
metode SSCP. Pada penelitian ini didapat 4 tipe gen, yaitu A, B, C dan D
(Gambar 2A). Perbedaan pola migrasi utas tunggal DNA dalam gel poliakrilamida
9% dapat dilihat lebih jelas pada diagram elektroforesis (zymogram) (Gambar 2B).
4
(-)
(+)
(A)
(B)
Gambar 2 (A) Hasil pendeteksian keragaman gen BCKDHA menggunakan
metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 9%.
(B) Diagram elektroforesis (zymogram).
Keterangan: A, B, C dan D = tipe gen BCKDHA; 40, 30, 7 dan 14 = nomor
sampel sapi madura yang mewakili tipe gen BCKDHA.
Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang
berasal dari dua lokasi (Kabupaten Bangkalan dan Kabupaten Sampang, Madura)
dapat dilihat pada Tabel 1. Pada sapi yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua
tipe gen, yaitu A dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada
empat yaitu A, B, C dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut
adalah tipe A, di Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
Persentase frekuensi diketahui dengan cara membagi jumlah sampel yang
memiliki tipe tertentu dengan jumlah sampel total yang terdapat pada masingmasing lokasi.
Tabel 1 Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura
Tipe gen
BCKDHA
A
B
C
D
Total
Lokasi (% frekuensi)
Bangkalan
5 (83%)
0 (0%)
1 (16.7%)
0 (0%)
6
Sampang
4 (50%)
2 (25%)
1 (12.5%)
1 (12.5%)
8
5
Pembahasan
Sebanyak 14 sampel DNA sapi madura berhasil diamplifikasi dari 16
sampel darah yang diekstraksi. Dua sampel yang tidak teramplifikasi dapat
disebabkan DNA sudah rusak sehingga primer tidak menempel pada fragmen
DNA target. Kisaran suhu yang membuat primer menempel dengan
komplemennya pada fragmen DNA target saat PCR dilakukan disebut suhu
penempelan primer. Pada penelitian ini suhu penempelan primer yang digunakan
60 °C, umumnya suhu yang digunakan agar primer dapat menempel pada fragmen
DNA target berkisar antara 50-65 °C. Persentase keberhasilan amplifikasi sebesar
85%, oleh karena itu primer yang digunakan spesifik. Panjang fragmen hasil
amplifikasi sekitar 531 pb sesuai dengan desain penempelan primer pada sekuen
gen BCKDHA ekson 2 dan 3 (Genbank No. Acc. NW001493616). Menurut
Yuwono (2006), keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, (1)
deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), (2) oligonukleotida primer, (3) DNA
cetakan, (4) komposisi larutan bufer, (5) jumlah siklus reaksi, (6) enzim taq
polimerase yang digunakan, dan (7) faktor teknis dan non teknis lainnya, seperti
kontaminasi.
Keragaman genetik dapat diketahui dengan analisis SSCP, teknik ini telah
banyak digunakan untuk mendeteksi mutasi yang menyebabkan penyakit.
Keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang dideteksi dari
penelitian ini ada empat tipe, yaitu A, B, C dan D. Teori yang mendasari metode
SSCP adalah perubahan yang terjadi pada fragmen DNA walau hanya satu
nukleotida saja, akan mempengaruhi konformasi dari DNA utas tunggalnya dan
dapat dideteksi dengan melihat perbedaan pola migrasi pita pada gel poliakrilamid
dengan elektroforesis yang dilakukan pada kondisi non denaturasi (Orita et al.
1989). Pita utas tunggal yang ditemukan pada penelitian ini berjumlah 3-4, sesuai
dengan Barosso et al. (1998) yang menyatakan bahwa biasanya jumlah pita utas
tunggal DNA dengan metode SSCP adalah empat untuk sampel DNA yang
berasal dari individu heterozigot.
Penyebaran gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang berasal
dari dua lokasi di Madura, yaitu Kabupaten Sampang dan Kabupaten Bangkalan
menunjukkan di Sampang terdapat empat tipe gen, yaitu A, B, C dan D.
sedangkan di Bangkalan hanya ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C.
Keragaman tipe gen yang lebih tinggi di Sampang mungkin disebabkan karena
pola persebaran sapi madura berkaitan dengan proses tata niaga di pulau Madura
yang umumnya bergerak dari wilayah Timur ke Barat (Harmadji 1993).
Kabupaten Sampang berada di sebelah Timur dari Kabupaten Bangkalan yang
menyebabkan keanekaragaman jenis sapi madura lebih tinggi.
Hasil pendeteksian keragaman gen dengan metode SSCP sangat
bergantung pada perubahan bentuk utas tunggal DNA. Bentuk dari utas tunggal
DNA dalam gel dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah
komposisi gel, ukuran fragmen DNA, komposisi bufer, ada tidaknya bufer aditif
seperti gliserol, suhu pada saat elektroforesis, konsentrasi DNA, kandungan basa
G+C dalam fragmen DNA (Nataraj et al. 1999). Gel yang digunakan untuk
metode ini adalah PAGE 9% dengan perbandingan akrilamid:bisakrilamid = 59:1,
bisakrilamid berfungsi sebagai cross-linking akrilamid dalam pembentukan
6
poliakrilamida. Utas tunggal DNA lebih dapat terpisah dalam gel dengan crosslinking yang rendah, oleh karena itu rasio akrilamid dan bisakrilamid yang besar
efektif digunakan. Sensitivitas metode SSCP adalah 99% untuk fragmen DNA
yang memiliki panjang 100-300 pb dan 89% untuk fragmen DNA yang memiliki
panjang 300–450 pb (Hayashi 1991). Pada penelitian ini fragmen DNA target
memiliki panjang 531 pb, maka sensitivitasnya hanya sekitar 79%. Suhu yang
rendah dan konstan diperlukan untuk metode SSCP karena mobilitas utas tunggal
DNA dan perubahan bentuknya yang disebabkan oleh mutasi dapat berubah
secara drastis jika suhu elektroforesis tidak konstan. Elektroforesis pada penelitian
ini dilakukan dalam lemari pendingin dengan suhu yang konstan yaitu 4 °C.
Penambahan bufer aditif seperti gliserol dalam gel dapat meningkatkan pemisahan
sekuens yang bermutasi, tetapi gliserol dapat mengurangi mobilitas utas tunggal
DNA.
Identifikasi keragaman genetik pada gen BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi
madura dengan metode SSCP merupakan penelitian pendahuluan yang dapat
menuntun pada penemuan penanda genetik sehingga dapat digunakan untuk
seleksi ternak. Penelitian yang lebih signifikan dari SSCP telah dilakukan oleh
Neibergs et al. (1993) untuk menganalisis kekerabatan dari Bovinae berdasarkan
polimorfisme yang ditemukan pada 5 gen, yaitu ARVP (arginine vasopressin),
COXP (cytochrome oxydase c subunit IV pseudogene), CYM (prochymosin),
LDLR (low density lipoprotein receptor), dan OXT (oxytocin). Penelitian lainnya
yang menggunakan metode SSCP dilakukan oleh Lagziel et al. (1996) untuk
menganalisis haplotipe gen bGH (bovine Growth Hormone) pada populasi sapi
holstein Israel dan asosiasinya dengan protein dalam susu.
SIMPULAN
Gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura berhasil diamplifikasi
dengan panjang fragmen DNA sebesar 531 pb sesuai desain primer. Ditemukan
empat tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura, yaitu A, B, C dan D.
Pada sapi madura yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A
dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat yaitu A, B, C
dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di
Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
DAFTAR PUSTAKA
Barroso A, Dunner S, Canon J. 1998. Technical note: use PCR-single strand
conformation polymorphism analysis for detection of Bovine-casein
variants A1, A2, A3 and B. J. Anim. Sci. 76:1535-1538.
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver
staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem.
385:174-175.
7
Dennis JA, Healy PJ. 1999. Definition of the mutation responsible for maple
syrup urine disease in poll shorthorns and genotyping poll shorthorns and
poll herefords for maple syrup urine disease alleles. Res. Vet. Sci. 67:1-6.
Harmadji. 1993. Prospek Pengembangan Sapi Madura. Di dalam: Prosiding
Pertemuan Ilmiah Hasil Penelitian dan Pengembangan Sapi Madura.
(1992 Oktober 11-12). Sumenep (ID).
Hayashi K. 1991. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of
mutations in the genomic DNA. PCR Method. Appl. 1:34-38.
King MW. 2013. Introduction to Maple Syrup Urine Disease: MSUD. [Internet].
[(2013 Februari 1, [diunduh 2013 Agustus 18]). Tersedia pada:
http://themedicalbiochemistrypage.org/msud.php.
Mohamad K, Olsson M, van Tol HTA, Mikko S, Vlamings BH, Andersson G,
Rodriguez-Martinez H, Purwantara B, Paling W, Colenbrander B et al.
2009. On the origin of Indonesian cattle. PLoS ONE. 4:e5490.
Lagziel A, Lipkin E, Soller M. 1996. Association between SSCP haplotypes at the
bovine growth hormone gene and milk protein percentage. Genetics.
142:945-951.
Nataraj AJ, Glander IO, Kusukawa N, Highsmith WE. 1999. Single strand
conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based
mutation detection. Electrophoresis. 20:1177-1185.
Neibergs HL, Dietz AB, Womack JE. 1993. Single strand conformation detected
in five bovine genes. Anim. Genet. 24:81-84.
Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detection of
polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single-strand
conformation polymorphism. Genetics. 86:2766-2770.
Patel MS, Harris RA. 1995. Mammalian α-keto acid dehydrogenase complexes:
gene regulation and genetic defects [review]. FASEB J. 9:1164-1172.
Sambrook J, Fritsch EF, Miniatis T. 1989. Molecular Clooning: A Laboratory
Manual. Ed ke-8. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Strauss KA, Puffenberger EG, Morton DH. 2009. Maple Syrup Urine Disease.
Gene Review, Bookshelf ID: NBK131, PMID: 20301495 (online review
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta
(IN): Penerbit ANDI.
Zhang B, Healy PJ. Zhao Y, Ciabb DW, Hams RA. 1990. Premature translation
termination of the pre-Ela subunit of the branched chain a-ketoacid
dehydrogenase as a cause of maple syrup urine desease in polled hereford
calves. J. Biol. Chem. 265:2425-2427.
8
LAMPIRAN
Lampiran 1 Posisi penempelan primer AF318 dan AF319 pada peta gen
BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi Bos taurus (NW001493616).
1
cacccccaca ggtggcagca acagcagcac ttctcgtccc tggatgacaa
AF318-primer forward
51
101
151
201
251
301
351
401
451
gccgcagttc ccaggggcct cagcggagtt catagacaag ctcgaattca
501
tggtccttag acc
primer reverse
tccagcccaa tgtcatctct gggatcccca tctaccgggt catggaccgg
cagggccaga tcatcaaccc cagcgaggat ccccacgtaa gaggccacct
ccccccgacc ctgtgcctcc catgcccaag ccccttgccc atctcctctc
tggccccagc tggcccacgt ctgtctgtgc ctctgtctgc agctgcccca
ggagaaggtg ctcaaattct acaagagcat gaccctgctc aacaccatgg
accgcatcct ctatgaatcc cagaggcagg tgcgtgggga caggctaggg
agggggcctg ggattacctg aggtcctgcc caccctacct gtgtctgggc
caaaagacag cgcccaaaga agagggagtg gaatggagat ccctgtcttg
AF319-
9
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 26 Juni 1992 dari Bapak Endin
Jaenudin dan Ibu Wina Daswinah (Alm). Penulis merupakan anak pertama dari
empat bersaudara. Penulis menyelasaikan pendidikan sekolah menengah atas di
SMA Negeri 1 Cileungsi pada tahun 2009, dan pada tahun yang sama melanjutkan
pendidikan di Institut Pertanian Bogor (IPB), Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Departemen Biologi melalui jalur Ujian Talenta Mandiri
(UTM).
Selama mengikuti masa perkuliahan di IPB, penulis aktif di berbagai
organisasi kepanitiaan, BIONIC (Biology on Action) divisi publikasi dekorasi dan
dokumentasi (PDD), panitia masa perkenalan departemen (MPD) divisi konsumsi,
panitia masa perkenalan fakultas (MPF) divisi komisi disiplin (Komdis). Penulis
pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama tahun
2013 dan Struktur Hewan tahun 2013. Penulis melakukan Studi Lapangan pada
tahun 2011 di hutan pendidikan gunung walat (HPGW) Sukabumi dengan judul
“Status Simbiosis Mikoriza Arbuskula dan Keragaman Cendawannya di Hutan
Pendidikan Gunung Walat” di bawah bimbingan Dr Nampiah Soekarno, Msi.
Selain itu, penulis melakukan kegiatan Praktik Lapangan pada tahun 2012 di
PTPN VIII Gunung Mas, Cisarua Bogor dengan judul “Budidaya Tanaman Teh di
PTPN VIII kebun Gunung Mas” di bawah bimbingan Dr Nisa Rachmania, Msi.
DEHYDROGENASE E1-α POLYPEPTIDE (BCKDHA) EKSON 2
DAN 3 PADA SAPI MADURA
DELLA YUNIAR WINDI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Keragaman Gen
Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2
dan 3 pada Sapi Madura adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Della Yuniar Windi
NIM G34090107
ABSTRAK
DELLA YUNIAR WINDI. Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid
Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura.
Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan DYAH PERWITASARI.
Kompleks enzim Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase (BCKD)
berperan dalam metabolisme Branched Chain Amino Acids (BCAA) yang ada
dalam mitokondria. Subunit pertama (E1-α) dari kompleks enzim BCKD
disandikan oleh gen BCKDHA. Mutasi pada gen BCKDHA dapat menyebabkan
defisiensi pada kompleks enzim BCKD dan akhirnya dapat menyebabkan Maple
Syrup Urine Disease (MSUD). Tujuan penelitian ini adalah mendeteksi
keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura dengan metode
Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism (PCRSSCP). Berdasarkan pola migrasi utas tunggal, ditemukan empat tipe gen
BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura, yaitu A, B, C dan D. Pada sapi
madura yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C,
sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat, yaitu A, B, C dan D.
Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di Bangkalan
sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
Kata kunci: BCKDHA, ekson 2, ekson 3, gen, sapi madura, SSCP, tipe gen
ABSTRACT
DELLA YUNIAR WINDI. Variability of Exon 2 and 3 Branched Chain Ketoacid
Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) gene in Madura Cattle. Supervised
by ACHMAD FARAJALLAH and DYAH PERWITASARI.
Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase (BCKD) enzyme complex
have a role in metabolism of Branched Chain Amino Acid (BCAA). BCKDHA
gene encoding the first subunit of these enzyme complex within mithochondrion.
Mutation in BCKDHA gene caused deficiency of BCKD complex that caused
Maple Syrup Urine Disease (MSUD). The aim of this research is to detect
variability of BCKDHA gene in madura cattle using Polymerase Chain ReactionSingle Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) method. According to
migration pattern of single strand in PAGE 9%, there was four types found in
exon 2 and 3 BCKDHA gene in madura cattle, that is A, B, C and D. There was
two types of gene found in cattle that its origin from Bangkalan, which is A and C,
whereas type that found in Sampang was four, which is A, B, C and D. The
highest frequency in two locations is type A, in Bangkalan (83%) and in Sampang
(50%).
Keywords: BCKDHA, exon 2, exon 3, gene, madura cattle, SSCP, gene type.
KERAGAMAN GEN BRANCHED CHAIN KETOACID
DEHYDROGENASE E1-α POLYPEPTIDE (BCKDHA) EKSON 2
DAN 3 PADA SAPI MADURA
DELLA YUNIAR WINDI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid Dehydrogenase E1-α
Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura
Nama
: Della Yuniar Windi
NIM
: G34090107
Disetujui oleh
Dr Achmad Farajallah
Pembimbing I
Dr Dyah Perwitasari
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari sampai bulan Juli
2013 ialah Keragaman, dengan judul Keragaman Gen Branched Chain Ketoacid
Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) Ekson 2 dan 3 pada Sapi Madura.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Achmad Farajallah dan Ibu
Dr Dyah Perwitasari selaku dosen pembimbing, serta Prof Dr Ir Alex Hartana
selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik dalam penyusunan
skripsi ini. Ungkapan terima kasih disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Kak Wildan, Kak Yanti, Kak Vendi, Kak Lora, Kak
Bulan dan segenap penghuni Lab. Molekuler, teman-teman tercinta Nadia, Ines,
Lina, Shelly, Ruth, Gloria, Agus, Dhyah, Hendri, Yovita, Abduh, Olii, Zahra,
Manda, Noyara dan sejawat BIO46 lainnya serta Penghuni Zoo Corner yang saya
hormati. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Della Yuniar Windi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE PENELITIAN
2
Waktu dan Tempat
2
Metode
2
Ekstraksi DNA
2
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
2
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode SSCP
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3
Hasil
3
Pembahasan
5
SIMPULAN
6
DAFTAR PUSTAKA
6
LAMPIRAN
8
RIWAYAT HIDUP
9
DAFTAR TABEL
1 Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura
4
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi gen BCKDHA menggunakan metode PCR pada
gel poliakrilamida 6%
2 Hasil pendeteksian keragaman gen BCKDHA menggunakan
metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 9% (A)
Diagram elektroforesis (zymogram) (B)
3
4
4
DAFTAR LAMPIRAN
1 Posisi penempelan primer AF318 dan AF319 pada peta gen BCKDHA
ekson 2 dan 3 sapi Bos taurus (NW001493616)
8
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi merupakan hewan dengan keanekaragaman tinggi dan ditemukan
hampir di semua negara termasuk Indonesia. Beberapa bangsa sapi lokal di
Indonesia antara lain sapi bali, madura, aceh, pesisir dan peranakan ongole. Sapi
madura merupakan hasil persilangan sapi zebu yang berpunuk (Bos indicus)
dengan banteng (Bos javanicus). Sapi madura berkembang di pulau Madura serta
pulau-pulau sekitarnya dan merupakan sapi tipe dwiguna (pedaging dan pekerja).
Sapi madura memiliki kemampuan adaptasi yang baik dan toleran terhadap iklim
panas/tropik, ternak sapi madura yang berada di pulau Madura dikelola dengan
baik dan dalam jangka waktu yang panjang (Mohamad et al. 2009)
Ada tiga kompleks enzim yang berkaitan dengan fungsi normal
mitokondria pada mamalia dan berperan penting dalam metabolisme intermediet
karbohidrat dan asam amino. Kompleks enzim tersebut adalah Pyruvat
Dehydrogenase Complex (PDC), α-Ketoglutaratate Dehydrogenase Complex (αKGDC) dan Branched Chain α-Ketoacid Dehydrogenase Complex (BCKDC)
(Patel dan Harris 1995). Kompleks enzim BCKD pada sel eukariot sangat
terpelihara. BCKD kompleks terdiri atas empat subunit polipeptida enzim, yaitu
E1-α, E1-β, E2 dan E3. Subunit E1-α disandikan oleh gen Branched Chain
Ketoacid Dehydrogenase E1-α Polypeptide (BCKDHA) yang berada pada
kromosom no. 19, panjang gen sekitar 55 kb dan terdiri atas 9 ekson (King 2013).
Kompleks enzim BCKAD berperan dalam metabolisme tiga asam amino esensial,
yaitu isoleusina, leusina dan valina. Tiga asam amino ini disebut juga Branched
Chain Amino Acid (BCAA) atau asam amino bercabang. Pada keadaan normal,
BCAA akan dihancurkan oleh kompleks enzim BCKD. Jika enzim ini mengalami
defisiensi maka BCAA tidak bisa masuk kedalam rangkaian metabolisme
mitokondria sehingga terjadi akumulasi yang tinggi dalam darah dan jaringan. Hal
ini disebut dengan kondisi Maple Syrup Urine Disease (MSUD). Ada tiga
penyebab defisiensi kompleks enzim BCKD yaitu autoantigen, anti-mitochondrial
antibodies (Strauss et al. 2009) dan mutasi genetik (Zhang et al. 1990).
Penyebab yang umum dari defisiensi kompleks BCKD adalah mutasi pada
gen BCKDHA. Mutasi gen BCKDHA ekson 2 pada anak sapi polled hereford
merupakan mutasi titik yang terjadi karena substitusi 248C/T pada kodon 6 dan
menyebabkan stop kodon prematur (Zhang et al. 1990). Dennis dan Healy (1999)
juga menemukan mutasi gen BCKDHA pada sapi polled shorthorn tetapi
mutasinya terjadi pada 1380C/T. Mutasi pada ekson selain di ekson 2 pada sapi
belum pernah ditemukan, dan mutasi pada sapi selain polled hereford dan polled
shorthorn juga belum pernah ditemukan.
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah Single Strand
Conformation Polymorphism (SSCP). Metode ini merupakan salah satu analisis
kejadian mutasi pada tingkat nukleotida dari fragmen DNA pendek menggunakan
produk dari Polymerase Chain Reaction (PCR) secara cepat. Mutasi dideteksi
berdasarkan perbedaan pola migrasi pita utas tunggal DNA pada gel
poliakrilamida (Hayashi 1991).
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keragaman gen BCKDHA ekson
2 dan 3 pada sapi madura dengan metode Single Strand Conformation
Polymorphism.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Juli 2013 di Bagian Fungsi
Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Metode
Ekstraksi DNA
Sampel darah sapi madura koleksi Dr. Dyah Perwitasari digunakan untuk
ekstraksi DNA. Sampel yang digunakan berjumlah 16 sampel yang berasal dari
Kabupaten Sampang (N=9) dan Kabupaten Bangkalan (N=7), Madura. Ekstraksi
DNA menggunakan cara manual mengikuti Sambrook et al. (1989) dengan sedikit
modifikasi. Urutan ekstraksi DNA yang dilakukan yaitu pelisisan sel, pemisahan
DNA, dan pengendapan (pemurnian) DNA. Pelisisan sel menggunakan larutan
bufer lisis 1x STE (NaCl 1M, Tris HCL 10-1 M, EDTA 10-2 M, pH 8.0), air
destilata, 10% Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan Proteinase K. Pemisahan DNA
menggunakan larutan NaCl 5M, fenol, dan Chloroform Isoamilakohol (CIAA)
dengan perbandingan 24:1. Pengendapan (pemurnian) DNA menggunakan larutan
NaCl 5M, alkohol absolut, dan alkohol 70%. Endapan DNA yang diperoleh
kemudian disuspensikan dalam 100 µl bufer TE (Tris HCl 10-1 M, EDTA 10-2 M,
pH 8.0) dan disimpan dalam freezer.
Amplifikasi dan Visualisasi DNA
Amplifikasi gen BCKDHA ruas ekson 2 dan 3 dilakukan secara in vitro
menggunakan mesin PCR ESCO Swift Maxi Thermal Cycler. Bahan pereaksi
PCR yang digunakan untuk volume reaksi 25 µl adalah sampel DNA 1 µl (sekitar
50 ng), GoTaq® Green Master Mix 2X (Promega) sebanyak 12,5 µl (pH 8.5, 400
mM dNTP, 3mM MgCl2), primer forward AF318 5’-agcacccccacaggtggcag dan
primer reverse AF319 5’-cctgtcttgtggtccttagacc (Lampiran 1) dengan konsentrasi
0,1 µM masing-masing sebanyak 1 µl dan nuclease-free water (Promega)
sebanyak 9,5 µl. Kondisi PCR yang digunakan predenaturasi 95 °C dua menit,
denaturasi 95 °C 45 detik, suhu penempelan primer 60 °C satu menit,
pemanjangan DNA pada suhu 72 °C satu menit, dan pemanjangan DNA akhir
pada suhu 72 °C lima menit sebanyak 30 siklus. Visualisasi produk PCR dengan
menggunakan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE) 6% dalam bufer 1x
3
TBE (Tris HCl 10 mM, asam borat 1M, EDTA 0,1 mM). Elektroforesis dijalankan
pada gel vertikal pada kondisi tegangan 200 volt selama 40 menit. Proses
dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009) dengan sedikit modifikasi.
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan teknik pengendapan alkohol kemudian
dicampurkan dengan formamide dye (95% formamida, 0.2N NaOH, 0.1M EDTA).
Utas ganda DNA didenaturasi pada suhu 95 °C selama 10 menit kemudian
seketika dipindahkan ke icebath, lalu sebanyak 2 µl di-loading ke PAGE 9%.
PAGE 9% dibuat dengan rasio akrilamid:bisakrilamid = 59:1 untuk memperoleh
pori-pori yang memanjang sehingga bisa membedakan bentuk molekul. Setelah
itu elektroforesis dilakukan di lemari pendingin dengan suhu 4 °C pada tegangan
150 volt selama 6 jam. Kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et
al. 2009).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Amplifikasi Gen BCKDHA Ekson 2 dan 3
Gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura berhasil diamplifikasi
menggunakan metode PCR. Pasangan primer yang digunakan adalah AF318
sebagai primer forward dan AF319 sebagai primer reverse. Dari 16 sampel sapi
madura, yang berhasil diamplifikasi sebanyak 14 sampel dengan panjang fragmen
gen BCKDHA adalah sekitar 531 pb berdasarkan desain primer (Gambar 1). Oleh
karena itu persentase keberhasilan PCR yang dilakukan sebesar 85%.
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen BCKDHA menggunakan metode PCR pada
gel poliakrilamida 6%.
Keterangan: M = penanda DNA 100 pb; Nomor di bagian atas gambar adalah
nomor sampel sapi madura.
Pendeteksian Keragaman Gen BCKDHA dengan Metode PCR-SSCP
Pendeteksian keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 dilakukan dengan
metode SSCP. Pada penelitian ini didapat 4 tipe gen, yaitu A, B, C dan D
(Gambar 2A). Perbedaan pola migrasi utas tunggal DNA dalam gel poliakrilamida
9% dapat dilihat lebih jelas pada diagram elektroforesis (zymogram) (Gambar 2B).
4
(-)
(+)
(A)
(B)
Gambar 2 (A) Hasil pendeteksian keragaman gen BCKDHA menggunakan
metode PCR-SSCP pada gel poliakrilamida 9%.
(B) Diagram elektroforesis (zymogram).
Keterangan: A, B, C dan D = tipe gen BCKDHA; 40, 30, 7 dan 14 = nomor
sampel sapi madura yang mewakili tipe gen BCKDHA.
Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang
berasal dari dua lokasi (Kabupaten Bangkalan dan Kabupaten Sampang, Madura)
dapat dilihat pada Tabel 1. Pada sapi yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua
tipe gen, yaitu A dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada
empat yaitu A, B, C dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut
adalah tipe A, di Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
Persentase frekuensi diketahui dengan cara membagi jumlah sampel yang
memiliki tipe tertentu dengan jumlah sampel total yang terdapat pada masingmasing lokasi.
Tabel 1 Penyebaran tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura
Tipe gen
BCKDHA
A
B
C
D
Total
Lokasi (% frekuensi)
Bangkalan
5 (83%)
0 (0%)
1 (16.7%)
0 (0%)
6
Sampang
4 (50%)
2 (25%)
1 (12.5%)
1 (12.5%)
8
5
Pembahasan
Sebanyak 14 sampel DNA sapi madura berhasil diamplifikasi dari 16
sampel darah yang diekstraksi. Dua sampel yang tidak teramplifikasi dapat
disebabkan DNA sudah rusak sehingga primer tidak menempel pada fragmen
DNA target. Kisaran suhu yang membuat primer menempel dengan
komplemennya pada fragmen DNA target saat PCR dilakukan disebut suhu
penempelan primer. Pada penelitian ini suhu penempelan primer yang digunakan
60 °C, umumnya suhu yang digunakan agar primer dapat menempel pada fragmen
DNA target berkisar antara 50-65 °C. Persentase keberhasilan amplifikasi sebesar
85%, oleh karena itu primer yang digunakan spesifik. Panjang fragmen hasil
amplifikasi sekitar 531 pb sesuai dengan desain penempelan primer pada sekuen
gen BCKDHA ekson 2 dan 3 (Genbank No. Acc. NW001493616). Menurut
Yuwono (2006), keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, (1)
deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), (2) oligonukleotida primer, (3) DNA
cetakan, (4) komposisi larutan bufer, (5) jumlah siklus reaksi, (6) enzim taq
polimerase yang digunakan, dan (7) faktor teknis dan non teknis lainnya, seperti
kontaminasi.
Keragaman genetik dapat diketahui dengan analisis SSCP, teknik ini telah
banyak digunakan untuk mendeteksi mutasi yang menyebabkan penyakit.
Keragaman gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang dideteksi dari
penelitian ini ada empat tipe, yaitu A, B, C dan D. Teori yang mendasari metode
SSCP adalah perubahan yang terjadi pada fragmen DNA walau hanya satu
nukleotida saja, akan mempengaruhi konformasi dari DNA utas tunggalnya dan
dapat dideteksi dengan melihat perbedaan pola migrasi pita pada gel poliakrilamid
dengan elektroforesis yang dilakukan pada kondisi non denaturasi (Orita et al.
1989). Pita utas tunggal yang ditemukan pada penelitian ini berjumlah 3-4, sesuai
dengan Barosso et al. (1998) yang menyatakan bahwa biasanya jumlah pita utas
tunggal DNA dengan metode SSCP adalah empat untuk sampel DNA yang
berasal dari individu heterozigot.
Penyebaran gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura yang berasal
dari dua lokasi di Madura, yaitu Kabupaten Sampang dan Kabupaten Bangkalan
menunjukkan di Sampang terdapat empat tipe gen, yaitu A, B, C dan D.
sedangkan di Bangkalan hanya ditemukan dua tipe gen, yaitu A dan C.
Keragaman tipe gen yang lebih tinggi di Sampang mungkin disebabkan karena
pola persebaran sapi madura berkaitan dengan proses tata niaga di pulau Madura
yang umumnya bergerak dari wilayah Timur ke Barat (Harmadji 1993).
Kabupaten Sampang berada di sebelah Timur dari Kabupaten Bangkalan yang
menyebabkan keanekaragaman jenis sapi madura lebih tinggi.
Hasil pendeteksian keragaman gen dengan metode SSCP sangat
bergantung pada perubahan bentuk utas tunggal DNA. Bentuk dari utas tunggal
DNA dalam gel dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah
komposisi gel, ukuran fragmen DNA, komposisi bufer, ada tidaknya bufer aditif
seperti gliserol, suhu pada saat elektroforesis, konsentrasi DNA, kandungan basa
G+C dalam fragmen DNA (Nataraj et al. 1999). Gel yang digunakan untuk
metode ini adalah PAGE 9% dengan perbandingan akrilamid:bisakrilamid = 59:1,
bisakrilamid berfungsi sebagai cross-linking akrilamid dalam pembentukan
6
poliakrilamida. Utas tunggal DNA lebih dapat terpisah dalam gel dengan crosslinking yang rendah, oleh karena itu rasio akrilamid dan bisakrilamid yang besar
efektif digunakan. Sensitivitas metode SSCP adalah 99% untuk fragmen DNA
yang memiliki panjang 100-300 pb dan 89% untuk fragmen DNA yang memiliki
panjang 300–450 pb (Hayashi 1991). Pada penelitian ini fragmen DNA target
memiliki panjang 531 pb, maka sensitivitasnya hanya sekitar 79%. Suhu yang
rendah dan konstan diperlukan untuk metode SSCP karena mobilitas utas tunggal
DNA dan perubahan bentuknya yang disebabkan oleh mutasi dapat berubah
secara drastis jika suhu elektroforesis tidak konstan. Elektroforesis pada penelitian
ini dilakukan dalam lemari pendingin dengan suhu yang konstan yaitu 4 °C.
Penambahan bufer aditif seperti gliserol dalam gel dapat meningkatkan pemisahan
sekuens yang bermutasi, tetapi gliserol dapat mengurangi mobilitas utas tunggal
DNA.
Identifikasi keragaman genetik pada gen BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi
madura dengan metode SSCP merupakan penelitian pendahuluan yang dapat
menuntun pada penemuan penanda genetik sehingga dapat digunakan untuk
seleksi ternak. Penelitian yang lebih signifikan dari SSCP telah dilakukan oleh
Neibergs et al. (1993) untuk menganalisis kekerabatan dari Bovinae berdasarkan
polimorfisme yang ditemukan pada 5 gen, yaitu ARVP (arginine vasopressin),
COXP (cytochrome oxydase c subunit IV pseudogene), CYM (prochymosin),
LDLR (low density lipoprotein receptor), dan OXT (oxytocin). Penelitian lainnya
yang menggunakan metode SSCP dilakukan oleh Lagziel et al. (1996) untuk
menganalisis haplotipe gen bGH (bovine Growth Hormone) pada populasi sapi
holstein Israel dan asosiasinya dengan protein dalam susu.
SIMPULAN
Gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura berhasil diamplifikasi
dengan panjang fragmen DNA sebesar 531 pb sesuai desain primer. Ditemukan
empat tipe gen BCKDHA ekson 2 dan 3 pada sapi madura, yaitu A, B, C dan D.
Pada sapi madura yang berasal dari Bangkalan ditemukan dua tipe gen, yaitu A
dan C, sedangkan tipe gen yang ditemukan di Sampang ada empat yaitu A, B, C
dan D. Frekuensi tipe terbesar dari kedua lokasi tersebut adalah tipe A, di
Bangkalan sebesar 83% sedangkan di Sampang sebesar 50%.
DAFTAR PUSTAKA
Barroso A, Dunner S, Canon J. 1998. Technical note: use PCR-single strand
conformation polymorphism analysis for detection of Bovine-casein
variants A1, A2, A3 and B. J. Anim. Sci. 76:1535-1538.
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver
staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem.
385:174-175.
7
Dennis JA, Healy PJ. 1999. Definition of the mutation responsible for maple
syrup urine disease in poll shorthorns and genotyping poll shorthorns and
poll herefords for maple syrup urine disease alleles. Res. Vet. Sci. 67:1-6.
Harmadji. 1993. Prospek Pengembangan Sapi Madura. Di dalam: Prosiding
Pertemuan Ilmiah Hasil Penelitian dan Pengembangan Sapi Madura.
(1992 Oktober 11-12). Sumenep (ID).
Hayashi K. 1991. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of
mutations in the genomic DNA. PCR Method. Appl. 1:34-38.
King MW. 2013. Introduction to Maple Syrup Urine Disease: MSUD. [Internet].
[(2013 Februari 1, [diunduh 2013 Agustus 18]). Tersedia pada:
http://themedicalbiochemistrypage.org/msud.php.
Mohamad K, Olsson M, van Tol HTA, Mikko S, Vlamings BH, Andersson G,
Rodriguez-Martinez H, Purwantara B, Paling W, Colenbrander B et al.
2009. On the origin of Indonesian cattle. PLoS ONE. 4:e5490.
Lagziel A, Lipkin E, Soller M. 1996. Association between SSCP haplotypes at the
bovine growth hormone gene and milk protein percentage. Genetics.
142:945-951.
Nataraj AJ, Glander IO, Kusukawa N, Highsmith WE. 1999. Single strand
conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based
mutation detection. Electrophoresis. 20:1177-1185.
Neibergs HL, Dietz AB, Womack JE. 1993. Single strand conformation detected
in five bovine genes. Anim. Genet. 24:81-84.
Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. 1989. Detection of
polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single-strand
conformation polymorphism. Genetics. 86:2766-2770.
Patel MS, Harris RA. 1995. Mammalian α-keto acid dehydrogenase complexes:
gene regulation and genetic defects [review]. FASEB J. 9:1164-1172.
Sambrook J, Fritsch EF, Miniatis T. 1989. Molecular Clooning: A Laboratory
Manual. Ed ke-8. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Strauss KA, Puffenberger EG, Morton DH. 2009. Maple Syrup Urine Disease.
Gene Review, Bookshelf ID: NBK131, PMID: 20301495 (online review
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta
(IN): Penerbit ANDI.
Zhang B, Healy PJ. Zhao Y, Ciabb DW, Hams RA. 1990. Premature translation
termination of the pre-Ela subunit of the branched chain a-ketoacid
dehydrogenase as a cause of maple syrup urine desease in polled hereford
calves. J. Biol. Chem. 265:2425-2427.
8
LAMPIRAN
Lampiran 1 Posisi penempelan primer AF318 dan AF319 pada peta gen
BCKDHA ekson 2 dan 3 sapi Bos taurus (NW001493616).
1
cacccccaca ggtggcagca acagcagcac ttctcgtccc tggatgacaa
AF318-primer forward
51
101
151
201
251
301
351
401
451
gccgcagttc ccaggggcct cagcggagtt catagacaag ctcgaattca
501
tggtccttag acc
primer reverse
tccagcccaa tgtcatctct gggatcccca tctaccgggt catggaccgg
cagggccaga tcatcaaccc cagcgaggat ccccacgtaa gaggccacct
ccccccgacc ctgtgcctcc catgcccaag ccccttgccc atctcctctc
tggccccagc tggcccacgt ctgtctgtgc ctctgtctgc agctgcccca
ggagaaggtg ctcaaattct acaagagcat gaccctgctc aacaccatgg
accgcatcct ctatgaatcc cagaggcagg tgcgtgggga caggctaggg
agggggcctg ggattacctg aggtcctgcc caccctacct gtgtctgggc
caaaagacag cgcccaaaga agagggagtg gaatggagat ccctgtcttg
AF319-
9
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 26 Juni 1992 dari Bapak Endin
Jaenudin dan Ibu Wina Daswinah (Alm). Penulis merupakan anak pertama dari
empat bersaudara. Penulis menyelasaikan pendidikan sekolah menengah atas di
SMA Negeri 1 Cileungsi pada tahun 2009, dan pada tahun yang sama melanjutkan
pendidikan di Institut Pertanian Bogor (IPB), Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Departemen Biologi melalui jalur Ujian Talenta Mandiri
(UTM).
Selama mengikuti masa perkuliahan di IPB, penulis aktif di berbagai
organisasi kepanitiaan, BIONIC (Biology on Action) divisi publikasi dekorasi dan
dokumentasi (PDD), panitia masa perkenalan departemen (MPD) divisi konsumsi,
panitia masa perkenalan fakultas (MPF) divisi komisi disiplin (Komdis). Penulis
pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama tahun
2013 dan Struktur Hewan tahun 2013. Penulis melakukan Studi Lapangan pada
tahun 2011 di hutan pendidikan gunung walat (HPGW) Sukabumi dengan judul
“Status Simbiosis Mikoriza Arbuskula dan Keragaman Cendawannya di Hutan
Pendidikan Gunung Walat” di bawah bimbingan Dr Nampiah Soekarno, Msi.
Selain itu, penulis melakukan kegiatan Praktik Lapangan pada tahun 2012 di
PTPN VIII Gunung Mas, Cisarua Bogor dengan judul “Budidaya Tanaman Teh di
PTPN VIII kebun Gunung Mas” di bawah bimbingan Dr Nisa Rachmania, Msi.