METODE PENELITIAN Perbandingan kadar sitokin interleukin-17 dalam serum antara penderita dengan bukan penderita psoriasis vulgaris

BAB III METODE PENELITIAN

III.1 Desain Penelitian Penelitian ini merupakan studi analitik dengan pendekatan potong lintang cross sectional. III.2 Waktu dan Tempat Penelitian 1. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juli 2012 sampai Januari 2014, bertempat di Poliklinik DepartemenSMF Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Alergi dan Imunologi RSUP. H. Adam Malik Medan. 2. Pengambilan sampel darah dilakukan di Laboratorium klinik Prodia cabang Medan. Sampel darah kemudian dikirim ke Laboratorium klinik Prodia Pusat di Jakarta untuk pemeriksaan kadar sitokin IL-17 dalam serum. III.3 Populasi Penelitian 1. Populasi target: Pasien-pasien yang menderita psoriasis vulgaris. Universitas Sumatera Utara 2. Populasi terjangkau: Pasien-pasien usia 15-65 tahun yang menderita psoriasis vulgaris yang berobat ke Poliklinik DepartemenSMF Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Alergi dan Imunologi RSUP. H. Adam Malik Medan sejak bulan Februari 2013 sampai Desember 2013. 3. Sampel: Populasi terjangkau yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi dan bersedia ikut serta dalam penelitian. 4. Kontrol: Kontrol adalah individu bukan penderita psoriasis vulgaris yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi kelompok kontrol dan bersedia ikut serta dalam penelitian. Universitas Sumatera Utara III.4 Besar Sampel Untuk menghitung besar sampel penelitian, maka digunakan rumus berikut : Jumlah sampel = n1=n2 ≥ 2 σ 2 {Z1- α2+ Z 1-β} 2 µ 1 -µ a 2 σ = standar deviasi IL-17 = 24,57 diambil dari kepustakaan 38 Z1- α2 = deviat baku alfa untuk α=0,05 = 1,96 Z 1- β = deviat baku beta untuk β = 0,10 = 1,282 µ 1 -µ a = beda rerata IL-17 yang bermakna, ditetapkan sebesar 25 pgml. Maka n1=n2 ≥ 2 x 24,57 2 { 1,96+ 1,282} 2 25 2 n1 = n2 = 20,303 ≈ 21 Jumlah sampel minimal penderita psoriasis vulgaris dan kontrol dalam penelitian ini adalah masing-masing sebanyak 21 orang. Pada penelitian ini diikut sertakan 25 orang penderita psoriasis vulgaris sebagai kelompok sampel dan 25 orang bukan penderita psoriasis vulgaris sebagai kelompok kontrol. Universitas Sumatera Utara III.5 Cara Pengambilan Sampel Penelitian Cara pengambilan sampel penelitian dilakukan menggunakan metode consecutive sampling. III.6 Identifikasi Variabel III.6.1 Variabel bebas : kadar sitokin IL-17 dalam serum III.6.2 Variabel terikat : psoriasis vulgaris III.7 Kriteria Inklusi dan Eksklusi III.7.1 Kelompok sampel: Kriteria inklusi : 1. Penderita yang didiagnosis secara klinis sebagai penderita psoriasis vulgaris. 2. Berusia 15-65 tahun. 3. Bersedia ikut serta dalam penelitian dan menandatangani informed consent. Kriteria eksklusi : 1. Penderita psoriasis vulgaris yang sedang hamil dan menyusui. 2. Penderita psoriasis vulgaris yang sedang menggunakan obat- obatan topikal untuk mengobati psoriasis vulgaris kortikosteroid topikal, kalsipotriol, tazarotene, tar minimal 2 minggu sebelum dilakukan penelitian dan sistemik Universitas Sumatera Utara metotreksat, asitretin, siklosporin, kortikosteroid minimal 6 minggu sebelum dilakukan penelitian. 3. Penderita psoriasis vulgaris yang menderita penyakit autoimun lainnya: lupus eritematosus sistemik, sklerosis sistemik, sklerosis multipel, penyakit Graves dan penyakit Addisons. III.7.2 Kelompok kontrol: Kriteria inklusi : 1. Individu bukan penderita psoriasis vulgaris yang tidak mempunyai riwayat keluarga psoriasis vulgaris. 2. Berusia 15-65 tahun. 3. Bersedia ikut serta dalam penelitian dan menandatangani informed consent. Kriteria eksklusi : 1. Wanita yang sedang dalam keadaan hamil dan menyusui. 2. Individu yang sedang mengkonsumsi obat-obatan yang bersifat imunosupresi dalam kurun waktu 6 minggu terakhir sebelum penelitian seperti : metotreksat, kortikosteroid. 3. Individu yang menggunakan obat kortikosteroid topikal atau imunomodulator topikal takrolimus, pimekrolimus dalam kurun waktu 2 minggu terakhir sebelum penelitian. Universitas Sumatera Utara 4. Individu yang menderita penyakit autoimun lainnya: lupus eritematosus sistemik, sklerosis sistemik, sklerosis multipel, penyakit Graves dan penyakit Addisons. III.8 Alat, Bahan dan Cara Kerja III.8.1 Alat dan bahan : a. Untuk pengambilan masing-masing sampel darah : 1. Satu pasang sarung tangan. 2. Satu buah alat ikat pembendungan torniquet. 3. Satu buah spuit disposable 3 ml. 4. Satu buah vacutainer tabung pengumpul darah steril 5 ml. 5. Satu buah plester luka. b. Satu unit alat sentrifuge alat pemusing untuk memisahkan serum. c. Microtube tabung mikro 1 ml untuk menampungmenyimpan serum. d. Satu buah freezer yang digunakan untuk menyimpan sampel sebelum pemeriksaan kadar IL-17. e. 1 unit alat Elisa reader. f. 1 unit kit Quantikine human IL-17 immunoassay, RD systems Inc, America Universitas Sumatera Utara III.8.2 Cara kerja 1. Pencatatan data dasar dilakukan oleh peneliti di Poliklinik DepartemenSMF Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin RSUP H. Adam Malik Medan. Pencatatan data dasar meliputi identitas penderita, anamnesis, pemeriksaan dermatologis yang meliputi pemeriksaan fenomena tetesan lilin dan tanda Auspitz . 2. Diagnosis klinis ditegakkan oleh peneliti bersama dengan pembimbing di Poliklinik DepartemenSMF Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin RSUP H. Adam Malik Medan. 3. Pengambilan sampel darah dilakukan oleh petugas Laboratorium Klinik Prodia cabang Medan. Cara pengambilan sampel darah adalah sebagai berikut : dengan menggunakan sarung tangan, kulit di atas lokasi tusuk dibersihkan dengan kapas yang dibasahi dengan alkohol 70 dan dibiarkan sampai kering. Lokasi penusukan harus bebas dari luka dan bekas lukasikatrik. Darah diambil dari vena mediana cubiti pada lipat siku. Ikatan pembendungan torniquet pada lengan atas dan pasien diminta untuk mengepal dan membuka telapak tangan berulang kali agar vena jelas terlihat. Lokasi penusukan didesinfeksi dengan kapas alkohol 70 dengan cara berputar dari dalam keluar. Spuit disiapkan dengan memeriksa jarum dan penutupnya. Setelah itu vena mediana cubiti ditusuk dengan posisi sudut Universitas Sumatera Utara 45 derajat dengan jarum menghadap keatas. Darah dibiarkan mengalir kedalam jarum kemudian jarum diputar menghadap kebawah. Agar aliran darah bebas, pasien diminta untuk membuka kepalan tangannya. Kemudian darah dihisap sebanyak 3 cc. Torniquet dilepas, lalu jarum ditarik dengan tetap menekan lubang penusukan dengan kapas alkohol. Selanjutnya tempat bekas penusukan ditekan dengan kapas alkohol sampai tidak keluar darah lagi. Setelah itu bekas tusukan ditutup dengan plester. Darah kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi, dan diputar 300 g selama 5 menit untuk mendapatkan serum. Selanjutnya serum dimasukkan kedalam microtube 1cc dan disimpan dalam freezer pada temperatur -20 C sampai saat pengiriman sampel ke laboratorium klinik pusat di Jakarta. Sampel selanjutnya dikirim ke Laboratorium Klinik Prodia Pusat di Jakarta untuk pemeriksaan kadar IL-17. Pengiriman sampel dari Laboratorium Klinik Medan ke Laboratorium Klinik Pusat di Jakarta dilakukan satu kali per minggu yaitu setiap hari Senin. Sampel kemudian disimpan pada suhu -70 C sampai saat pemeriksaan kadar IL- 17. Pemeriksaan kadar IL-17 dilakukan bersamaan setelah semua sampel terkumpul. 4. Pengukuran kadar sitokin IL-17 serum. Pengukuran kadar sitokin IL-17 serum dilakukan di Laboratorium klinik Prodia pusat di Jakarta menggunakan kit Quantikine human IL-17 immunoassay RD systems Inc. America RDI-36 dengan metode Universitas Sumatera Utara ELISA. Semua reagensia dan sampel serum dipersiapkan. Sumuran 96 dengan volume maksimal 300 µl dikeluarkan dari kemasan. Ke dalam tiap sumuran ditambahkan 100 µl larutan RDI-36. Ditambahkan 100 µl larutan serum sampel yang akan diperiksa, sehingga total larutan dalam sumuran berjumlah 200 µl. Penambahan larutan serum harus selesai dalam waktu 15 menit. Sumuran ditutup dengan selotip steril lalu diinkubasi selama 3 jam pada temperatur ruangan. Kemudian larutan dalam setiap sumuran diaspirasi dan dilakukan proses pencucian sebanyak 3 kali dengan larutan buffer. Selanjutnya kedalam tiap sumuran ditambahkan 200 µl konjugat IL-17, lalu sumuran ditutup dengan selotip steril dan diinkubasi selama 1 jam pada temperatur ruangan. Dilakukan kembali pencucian dengan larutan buffer sebanyak 3 kali. Kemudian kedalam tiap sumuran ditambahkan 200 µl larutan substrat, lalu diinkubasi selama 30 menit pada temperatur ruangan. Kemudian kedalam tiap sumuran ditambahkan larutan penghenti reaksi. Diamati perubahan warna yang terjadi yaitu dari biru menjadi kuning. Kemudian dilakukan penilaian kepadatan optik dengan alat pembaca Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA pada panjang gelombang 450 nm dalam waktu 30 menit. Kadar IL-17 dalam serum diukur dalam satuan pgml. Universitas Sumatera Utara III.9 Definisi Operasional 1. Umur : Umur subjek penelitian adalah 15-65 tahun. Umur dihitung berdasarkan tanggal lahir, apabila lebih besar dari 6 bulan dilakukan pembulatan keatas dan apabila lebih kecil dari 6 bulan dilakukan pembulatan kebawah. 2. Psoriasis vulgaris : Psoriasis vulgaris adalah penyakit peradangan kulit kronis dengan gejala klinis plak eritem berbatas tegas ditutupi sisik tebal berwarna keperakan. Diagnosis psoriasis vulgaris ditegakkan berdasarkan pemeriksaan klinis oleh dokter spesialis kulit dan kelamin. Diagnosis klinis psoriasis : plak eritematosa yang ditutupi skuama tebal berwarna putih keperakan dengan predileksi pada daerah kulit kepala, garis perbatasan kepala dan rambut, ekstremitas ekstensor, batang tubuh dan lumbosakral disertai hasil pemeriksaan fenomena tetesan lilin atau tanda Auspitz yang menunjukkan hasil positif. Fenomena tetesan lilin : gambaran garis putih seperti tetesan lilin yang tampak ketika sisik utuh pada lesi psoriasis vulgaris digores dengan pinggir gelas objek. Universitas Sumatera Utara Tanda Auspitz : bintik-bintik perdarahan yang tampak ketika sisik pada lesi psoriasis vulgaris diangkat dengan menggunakan ujung gelas objek. 3. Sitokin IL-17 dalam serum : Kadar sitokin IL-17 dalam serum yang diukur dengan pemeriksaan laboratorium dengan metode Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA menggunakan kit Quantikine human IL-17 immunoassay RD systems Inc. America RDI-36. 4. ELISA : Singkatan dari Enzyme Linked Immunosorbent Assay yaitu suatu metode yang bertujuan untuk mengestimasi material di dalam larutan seperti serum. Prinsip dasarnya ialah menggunakan antibodi monoklonal untuk mendeteksi adanya ikatan antigen dan antibodi. 5. ELISA reader : Adalah suatu alat yang berguna untuk membaca kepadatan optik dari sampel uji pada panjang gelombang 450 nm. Pada penelitian ini menggunakan produk Bio-rad Laboratories, Inc., Hercules dengan nomor registrasi CA 94547, Amerika serikat. Universitas Sumatera Utara 6. Lupus eritematosus sistemik : Merupakan suatu penyakit autoimun sistemik yang dapat mengenai seluruh bagian tubuh. Secara klinis dapat dijumpai ruam malar butterfly rash, ruam diskoid, serositis, ulkus oral, arthritis, fotosensitivitas. Diagnosis ditegakkan oleh dokter spesialis penyakit dalam. 7. Sklerosis sistemik : Merupakan suatu penyakit jaringan ikat sistemik yang ditandai dengan adanya gangguan vasomotor, atrofi kulit, jaringan subkutan, otot, dan organ dalam paru-paru, jantung, jantung, ginjal dan susunan syaraf pusat serta ganguan imunologik. Diagnosis ditegakkan oleh dokter spesialis penyakit dalam. 8. Sklerosis multipel : Merupakan penyakit inflamasi akibat demielinisasi susunan syaraf pusat yang ditandai dengan kelemahan satu atau lebih anggota gerak, optik neuritis serta gejala sensoris. Diagnosis ditegakkan oleh dokter spesialis penyakit dalam atau dokter spesialis saraf. 9. Penyakit Graves : Merupakan suatu jenis penyakit hipertiroid yang ditandai dengan iritabilitas, kelemahan otot, intoleransi terhadap panas, gangguan Universitas Sumatera Utara tidur, tremor, diare, denyut jantung yang cepat dan ireguler, penurunan berat badan serta pembesaran kelenjar tiroid. Diagnosis ditegakkan oleh dokter spesialis penyakit dalam. 10. Penyakit Addisons : Merupakan kelainan endokrin kronis akibat gangguan pada kelenjar adrenal yang jarang terjadi. Ditandai dengan kelemahan otot, demam, penurunan berat badan, mual, muntah, diare, nyeri otot dan sendi, hipotensi ortostatik. Sebagian besar penderita akan mengalami hiperpigmentasi kulit meskipun pada daerah yang tidak terpapar sinar ultraviolet. Diagnosis ditegakkan oleh dokter spesialis penyakit dalam. 11. Kelompok kontrol: Kontrol adalah individu berusia 15 - 65 tahun yang bukan penderita psoriasis vulgaris dan tidak mempunyai riwayat keluarga menderita psoriasis vulgaris serta memenuhi kriteria inklusi dan ekskusi kelompok kontrol. 12. Durasi penyakit: Durasi penyakit adalah rentang waktu yang dihitung dari mulai awal timbulnya penyakit hingga saat pemeriksaan, dibagi menjadi 5 tahun, 5-10 tahun, 10 tahun. Universitas Sumatera Utara 13. Hamil: Hamil adalah rangkaian peristiwa yang terjadi bila ovum dibuahi dan pembuahan ovum akhirnya berkembang sampai menjadi fetus yang aterm. Diagnosis ditegakkan oleh bidan atau dokter spesialis kebidanan dan kandungan. 14. Menyusui: Wanita yang melakukan proses pemberian air susu ibu kepada bayi. Informasi berdasarkan anamnesis. III.10 Pengolahan dan Analisis Data Data-data yang terkumpul dianalisis secara statistik dan disajikan dalam bentuk tabel frekuensi. Untuk mengetahui normalitas distribusi data, digunakan uji Kolmogorov-Smirnov. Untuk menilai perbandingan kadar sitokin IL-17 serum antara kelompok penderita psoriasis vulgaris dengan kelompok kontrol digunakan uji T independent. Batas uji kemaknaan p yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0,05. Dikatakan bermakna jika nilai p ≤ 0,05 dan tidak bermakna jika nilai p 0,05. III.11 Ethical clearance Penelitian ini dilakukan setelah memperoleh ethical clearance dari komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Universitas Sumatera Utara III.12 Kerangka Operasional Pasien psoriasis vulgaris Sitokin IL-17 dalam serum Kontrol Sitokin IL-17 dalam serum Perbandingan Kriteria inklusi dan eksklusi kelompok sampel Kriteria inklusi dan eksklusi kelompok kontrol Sampel Individu tanpa psoriasis vulgaris Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN