40
Gambar 12. Simplisia di dalam perkolator. Gambar 13. Vaccum rotavapor.
4.7.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak lerak dalam pelarut etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara
dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth. Ekstrak lerak dalam pelarut etanol dimulai dari konsentrasi 100 karena
belum diketahui konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat pertumbuhan E.faecalis, jadi pengujian dimulai pada konsentrasi terbesar. Kemudian dilakukan
pengenceran berganda, diperoleh konsentrasi 50 , 25 dan 12,5 . Masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label.
4.7.3 Pembuatan media bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media MHA Gambar 14. Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades untuk 40 petri 20
mlpetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Setelah masak, media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan
Universitas Sumatera Utara
41
suhu 121 C, lalu simpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan, media
dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituang ke dalam petri.
Gambar 14. Media Mueller Hinton Agar Difco, USA
4.7.4 Pembiakan spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E.faecalis ATCC 29212 yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga
didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakeri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni bakteri lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9 hingga
konsentrasi 10
8
CFUml CFU: Colony Forming Unit atau setara dengan 0,5 Mc Farland Standard.
4.7.5 Penentuan MIC bahan coba
Konsentrasi ekstrak lerak dalam pelarut etanol yang diuji dalam penelitian ini adalah 100 , 50 , 25 dan 12,5 . Dari masing-masing konsentrasi tersebut
diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba
Universitas Sumatera Utara
42
tersebut kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam pada
inkubator CO
2
. Kemudian amati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai MIC. Tabung dengan
kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan MIC yaitu konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan
E.faecalis dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri dalam media tersebut.
4.7.6 Penentuan MBC bahan coba
Dari semua konsentrasi bahan coba yang diuji ternyata pada larutan ekstrak lerak tidak dapat terlihat larutan yang mulai tampak jernih dan tidak representatif
untuk diukur sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni bakteri. Dari hasil prosedur penentuan nilai MIC diperoleh 4 kelompok
yang dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra, yaitu ekstrak lerak dalam pelarut etanol 100, 50, 25 dan
12,5. Dengan metode ini dapat dihitung jumlah bakteri hidup yang telah disuspensikan dalam bahan coba, sehingga dapat ditentukan penyebab kekeruhan
dalam media uji, apakah karena bahan coba, pertumbuhan kuman yg cepat, atau karena tumpukan sel bakteri mati.
Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan MIC, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas divorteks dan diambil 50 µl untuk tiap konsentrasi lalu
diteteskan ke dalam media padat Mueller Hinton Agar, direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai kering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
C selama 24 jam. Kemudian jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip
Universitas Sumatera Utara
43
satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila
bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dibuat
rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri
merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat
sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk
mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml. 4.8 Analisa Data
Data hasil penelitian ini tidak dilakukan uji secara statistik karena data yang diperoleh adalah jumlah bakteri yang mati seluruhnya sehingga hasilnya 0, artinya
tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media perbenihan atau bakteri yang berkontak dengan bahan coba 100 mengalami kematian.
Universitas Sumatera Utara
44
BAB 5 HASIL PENELITIAN
5.1 Ekstrak kental Lerak
Daging buah lerak yang telah dikeringkan dan dihaluskan 520 gram diekstraksi, diperoleh ekstrak kental berwarna coklat kehitaman Gambar 15,
disimpan dalam wadah kaca tertutup dan diletakkan di tempat yang sejuk.
Gambar 15. Ekstrak kental lerak
5.2 Uji Efektifitas Antibakteri
Setelah dilakukan prosedur pengujian efek antibakteri, pada bahan coba ekstrak kental lerak 25 tidak dijumpai pertumbuhan bakteri dalam media
perbenihan yang berarti bahwa semua bakteri Enterococcus faecalis mati. Sedangkan pada penentuan MIC, kekeruhan tabung tidak berubah sehingga dianggap tidak
representatif untuk mengukur nilai MIC. Oleh karena itu, nilai MIC tidak dapat diketahui.
Universitas Sumatera Utara
Kategori