Dalam Larutan NaOCl 1 selama 30 mnt me\menit

26 C.2. Analisis Sifat Fisiko-Kimia Tepung Rumput Laut Rumput Laut Segar Pencucian dengan Air Mengalir Perendaman : 1. Dalam Air Tawar 1 : 3 selama 9 jam 2. Dalam Larutan NaOCl 1 selama 30 mnt me\menit Pengecilan Ukuran Grinder Bubur Rumput Laut Pengeringan Drum Dryer Penggilingan Disc Mill Pengayakan 32 mesh Tepung Rumput Laut TRL Gambar 5 Diagram Alir Pembuatan Tepung Rumput Laut 27 Tepung rumput laut yang dihasilkan kemudian dikemas dengan wadah gelas tertutup dan dilakukan analisis fisiko-kimia. C.2.1. Indeks Penyerapan Air IPA dan Indeks Kelarutan Air IKA Metode Anderson Paton dan Spratt 1984 Sebanyak 2.5 gram tepung dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse kemudian ditambahkan 25 ml aquades, diaduk menggunakan vibrator sampai semua bahan terdispersi. Selanjutnya tabung disentrifusi dengan kecepatan 2000 rpm pada suhu ruang selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh dituangkan secara hati-hati ke dalam wadah lain, sedangkan tabung sentrifuse beserta residunya dipanaskan dalam oven 50 °C selama 25 menit pada posisi miring 25 ° dan ditimbang. Sebanyak 2 ml supernatan dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan pada oven 105 °C selama 1 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sebagai bahan kering yang terlarut dalam supernatan. Indeks penyerapan dan indeks kelarutan dalam air, ditentukan dengan persamaan berikut : C B A g ml IPA − = F D ml g IKA = dimana : A : berat residu dari tepung asumsi berat jenis BJ =1 B : berat sampel C : berat bahan terlarut dalam supernatan faktor koreksi D : berat bahan terlarut dalam 2 ml F : 2 ml larutan C.2.2. Viskositas AOAC 1984 Viskositas tepung rumput laut diukur dengan menggunakan alat viskometer yang mempunyai beberapa spindel dengan ukuran tertentu dan dilengkapi tabel yang memuat faktor pengali konversi untuk masing-masing spindel pada kecepatan rpm tertentu. Sebanyak 5 gram sampel ditambahkan 100 ml air dan kemudian diaduk merata sambil dipanaskan menggunakan plat pemanas pada suhu 60 °C, lalu diukur kekentalannya. Hasil pengukuran diperoleh atau dinyatakan dalam satuan sentripois. 28 C.2.3. Kadar Air AOAC 1984 Cawan aluminium dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C selama 15 menit, kemudian didinginkan lalu ditimbang A. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram B. Setelah itu cawan berisi sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C selama 6 jam kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap C. Kadar air dihitung dengan rumus : [ ] 100 × − − = B A C B wb Air Kadar [ ] 100 × − − − = A C A C B db KadarAir C.2.4. Kadar Abu AOAC 1984 Sampel ditimbang sebanyak 1-5 gram, lalu dimasukkan ke dalam cawan porselen yang sudah diketahui bobot tetapnya. Sampel diarangkan di atas Bunsen dengan nyala api kecil hingga tidak berasap, selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 500-600 C sampai menjadi abu yang berwarna putih. Cawan yang berisi abu didinginkan dalam desikator dan dilakukan penimbangan hingga diperoleh bobot tetap. Kadar abu dapat dihitung dengan rumus : 100 × = g Sampel Berat g Abu Berat Abu Kadar C.2.5. Kadar Protein AOAC 1984 Sampel ditimbang sebanyak 0.5-3 gram lalu dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl dan didestruksi dengan menggunakan 20 ml asam sulfat pekat dengan pemanasan sampai terjadi larutan berwarna jernih. Larutan hasil destruksi diencerkan dan didestilasi dengan penambahan 10 ml NaOH 10. Destilat ditampung dalam 25 ml larutan H 3 BO 3 3. Larutan H 3 BO 3 dititrasi dengan larutan HCl standar dengan menggunakan metil merah sebagai indikator. Dari hasil titrasi ini total nitrogen dapat diketahui. Kadar protein sampel dihitung dengan mengalikan total nitrogen dan faktor koreksi. 100 14 × × × × = mg Sampel Bobot fk HCL N titran ml Nitrogen Total 25 . 6 r × = Nitrogen Total otein P Kadar 29 C.2.6. Kadar Lemak AOAC 1984 Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ektraksi soxhlet dikeringkan dalam oven. Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga bobot tetap. Sebanyak 5 gram sampel dibungkus dengan kertas saring, kemudian ditutup dengan kapas wool yang bebas lemak. Kertas saring yang berisi sampel tersebut dimasukkan dalam alat ektraksi soxhlet, kemudian dipasang alat kondensor di atasnya dan labu lemak di bawahnya. Pelarut dietil eter atau petroleum eter dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran yang digunakan. Selanjutnya dilakukan refluks minimum 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada di dalam labu lemak didestilasi dan ditampung. Kemudian labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 C. Selanjutnya didinginkan dalam desikator dan dilakukan penimbangan hingga diperoleh bobot tetap. 100 × = g Sampel Berat g Lemak Berat Lemak Kadar C.2.7. Kadar Karbohidrat by difference Kadar karbohidrat dihitung dengan menggunakan rumus : Lemak K otein K Abu K bk t Karbohidra Kadar . Pr . . 100 + + − = C.2.8. Kadar Serat Pangan Asp et al. 1983 Sampel kering homogen diekstraksi lemaknya dengan petroleum eter selama 15 menit pada suhu kamar. Kemudian diambil 1 gram dan dimasukkan ke dalam labu erlemeyer dan ditambahkan 25 ml 0,1M buffer Natrium fosfat pH 6.0 serta dicampur secara menyeluruh. Setelah itu ditambahkan 0.1 ml alfa amilase Termamyl 120 L dan labu ditutup dengan alumonium foil, kemudian diinkubasi selama 15 menit dalam penangas air panas 80 C bergoyang. Selanjutnya didinginkan lalu ditambahkan 20 ml air destilata, pH diatur menjadi 1.5 dengan HCl 0.1 N dan elektroda dibersihkan dengan beberapa ml air. Kemudian ditambahkan pepsin 0.1 gram, ditutup dengan alumonium foil dan diinkubasikan dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 C selama 1 jam, lalu ditambahkan 20 ml air destilata dan diatur pHnya menjadi 6.8 dengan NaOH, elektroda 30 dibersihkan dengan 5 ml air. Selanjutnya ditambahkan 0.1 gram pankreatin, kemudian labu ditutup dengan almuminium foil dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 C selama 1 jam, serta pH diatur menjadi 4.5 dengan HCl 0.1 N. Kemudian disaring dengan crucible, dicuci dengan 2 x 10 ml air destilata. Residu serat pangan tidak larut IDF Residu dalam crucible dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 90 dan 2 x 10 ml aseton. Crucible dikeringkan pada suhu 105 C sampai bobot tetap dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator D1. Kemudian diabukan pada suhu 550 C selama kurang lebih 5 jam serta ditimbang setelah pendinginan dalam desikator I1. Filtrat Serat Pangan Larut SDF. Volume filtrat diatur dan dicuci dengan air sampai 100 ml, kemudian ditambahkan 400 ml etanol 95 hangat 60 C dan dibiarkan presipitasi selama 60 menit waktu dapat diperpendek. Lalu disaring dengan crucible yang kering porositas 2 yang mengandung 0.5 gram celite, selanjutnya dicuci berturut-turut dengan 2 x 10 ml etanol 78, 2 x 10 ml etanol 95 dan 2 x 10 ml aseton. Setelah itu filter gelas dikeringkan dalam oven suhu 105 C sampai berat tetap dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator D2, dan terakhir diabukan pada suhu 550 C selama kurang lebih 5 jam serta ditimbang setelah pendinginan dalam desikator I2. Dilakukan pula perhitungan serat blanko dengan menggunakan prosedur seperti diatas tetapi tanpa menggunakan sampel. Nilai blanko ini harus diperiksa secara berkala dan bila enzim yang digunakan berasal dari batch baru. Kadar serat pangan total dapat diperoleh dengan menggunakan rumus : 100 1 1 1 × − − = W B I D IDF 100 2 2 2 × − − = W B I D SDF SDF IDF TDF + = Keterangan : W = berat sample gram 31 D = berat setelah pengeringan gram I = berat setelah pengabuan gram B = berat blanko bebas serat gram C.3. Analisis Biologis Pada tahap ini dilakukan uji biologis pada hewan percobaan yaitu tikus. Tikus-tikus yang akan diberi perlakuan dalam penelitian ini diadaptasi terlebih dahulu dengan ransum standar selama satu minggu, setelah itu mengalami masa peningkatan kolesterol dibuat menjadi kondisi hiperkolesterolemia, kecuali pada grup kontrol negatif. Peningkatan kolesterol dilakukan dengan memberikan ransum yang mengandung kolesterol 1 dengan mengurangi porsi pati sebanyak 1, perlakuan ini dilakukan selama ± 2 bulan, dan pada 14 hari terakhir tikus diberi propil tiourasil PTU 0,01 secara oral atau dicekok. PTU merupakan suatu zat anti tiroid untuk meningkatkan kolesterol darah secara endogen. Pada akhir masa ini kadar kolesterol serum diuji dengan mengambil darah dari 3-4 ekor tikus yang dipilih secara acak. Setelah kadar total kolesterol serum mencapai 130 mgdl atau pada kondisi hiperkolesterolemia, tikus-tikus hiperkolesterolemia dikelompokkan dalam 4 grup perlakuan, yaitu : - Kontrol Positif KP : Kolesterol 1 + 0 TRL - PerlakuanTRL “E” : Kolesterol 1 + 10 TRL Eucheuma cottonii - Perlakuan TRL “G” : Kolesterol 1 + 10 TRL Gelidium sp - Perlakuan TRL “S” : Kolesterol 1 + 10 TRL Sargassum sp Komposisi ransum yang digunakan pada setiap grup perlakuan tertera pada Tabel 4. Ransum perlakuan diberikan secara ad libitum selama ± 4 minggu. Selama percobaan, dilakukan penimbangan jumlah ransum yang dikonsumsi serta penimbangan berat badan setiap 2 hari sekali. Pada akhir masa percobaan, tikus dipingsankan dengan menggunakan metode fisik yaitu dengan mematahkan tengkuk dislokasio cervicalis, kemudian dibedah. Darah diambil melalui jantung dengan menggunakan syringe bervolume 5 ml. Darah yang diperoleh kemudian disentrifuse untuk mendapatkan serumnya, kemudian dilakukan analisis kadar total kolesterol, HDL, LDL, Trigliserida dan Indeks Aterogenik. Sekum diambil dan dilakukan analisa kadar kolesterol digesta, kadar asam propionat dan butirat. Pada organ aorta dan kolon dilakukan pengujian 32 histologi, yang bertujuan untuk melihat penebalan dinding aorta dan inflamasi kolon sebagai indikasi kanker kolon. Tabel 4. Komposisi Ransum Tikus Bahan KN KP TRL E TRL G TRL S Kasein 12.45 12.45 12.45 12.45 12.45 Minyak Jagung 7.94 7.94 7.94 7.94 7.94 Selulosa 0.96 0.96 0.96 0.96 0.96 Mineral mixture 4.56 4.56 4.56 4.56 4.56 Vitamin mixture 1 1 1 1 1 Air 3.61 3.61 3.61 3.61 3.61 Kolesterol Murni - 1 1 1 1 Tepung Rumput Laut - - 10 10 10 Maizena 69.48 68.48 58.48 58.48 58.48 Sumber : Modifikasi dari AOAC 1990 C.3.1. Pengujian Total Kolesterol TK Boehringer Kits Kadar Kolesterol total diukur dengan metode CHOD-PAP Cholesterol Oxidase-p-aminophenozone dengan prinsip pengujian secara enzimatis kalorimetri berdasarkan reaksi : kolesterol esterase Kolesterol ester + H 2 O kolesterol + RCOOH kolesterol oksidase Kolesterol + O 2 4-kolesten-3-one + H 2 O 2 Peroksidase 2H 2 O 2 + Phenol + 4-aminoanthipyrine red quinine + 4H 2 O Prosedur Analisis : Serum darah diambil sebanyak 0.01 ml dan dicampurkan dengan 1 ml reagen kit Komersial kemudian dimasukkan kedalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Setelah campuran homogen kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. Setelah itu dibaca absorbansinya pada λ 546 nm. Perhitungan kadar kolesterol total dilakukan dengan menggunakan rumus : Kadar kolesterol mgdl = [absorbansi sample absorbansi standar] x 200 mgdl C.3.2. Pengujian High Density Lipoprotein HDL Boehringer Kits Pengukuran HDL dilakukan dengan metode CHOD-PAP. Sebelum pengujian kadar HDL, dilakukan persiapan sampel yaitu sebanyak 200 µl serum 33 darah dicampurkan dengan 500 µl reagen presipitasi kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setalah itu dilakukan sentrifuse pada 4000 rpm selama 10 menit sehingga dihasilkan supernatan yang siap untuk dianalisis. Tahapan selanjutnya dilakukan analisis kadar HDL dengan metode CHOD-PAP yaitu diambil 100 µl supernatan kemudian dicampurkan dengan 1000 µl larutan reagen. Setelah tercampur diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. Setelah itu dibaca absorbansinya pada λ 546 nm. Perhitungan kadar HDL dilakukan dengan rumus: [ ] 2 . 219 × = sampel absorbansi dl mg HDL Kadar mgdl C.3.3. Pengujian TrigliseridaTG Boehringer Kits Prinsip pengujian berdasarkan reaksi dibawah ini : lipase Trigliserida + H 2 O glycerol + 3RCOOH Glyserol kinase Glyserol + ATP glycerol-3-fosfat +ADP Glycerol-3-fosfat oksidase glycerol-3-fosfat + O 2 dihidroksiaseton fosfat + H 2 O 2 Peroksidase 2H 2 O 2 + 4-aminofenazon + 4-Klorofenol quinomeimine + HCl + 4H 2 O Prosedur Analisis Diambil 0.01 ml serum darah, lalu dicampurkan dengan 1 ml reagen kit. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit, kemudian dibaca absorbansinya pada λ 546 nm. Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus : 200 Standar Absorbansi Sampel Absorbansi × = dl mg da Trigliseri Kadar mgdl C.3. 4. Pengujian Kadar Low Density LipoproteinLDL Baraas 1994 Kadar LDL dihitung secara langsung menggunakan rumus : + − = 5 TG HDL Kolesterol Total LDL Kadar 34 dimana diasumsikan bahwa TG5 merupakan kadar VLDL very low density lipoprotein . C.3.5. Pengujian Indeks Aterogenik IA Indeks aterogenik dihitung dengan menggunakan rumus : HDL HDL TK IA Aterogenik Indeks − = C.3.6. Pengujian Kadar Kolesterol Digesta Metode Liebermann-Buchards Sebanyak 0.1 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, lalu ditambahkan 10 ml alkohol : eter dengan perbandingan 3:1, kemudian diaduk dengan batang pengaduk sampai homogen. Setelah homogen dilakukan sentrifuse pada 3000 rpm selama 10 menit sehingga menghasilkan supernatan. Supernatan tersebut dituang ke dalam gelas piala lalu diuapkan di penangas air sampai kering. Residu yang didapat kemudian dilarutkan dengan menggunakan kloroform sedikit demi sedikit, setelah selesai dituang ke dalam tabung berskala sampai 5 ml. Setelah itu ditambahkan asam asetat glacial sebanyak 2 ml dan H 2 SO 4 0,02 ml dan dipindah-pindahkan ke tabung lain sampai beberapa kali. Kemudian dibiarkan di tempat gelap selama 15 menit. Tahapan terakhir dibaca absorbansinya pada λ 550 nm. Perhitungan kadar kolesterol digesta dilakukan dengan rumus : Sampel Berat g mg Kolesterol 10 dar Kons.Stan 4 . Standar Absorbansi Sampel Absorbansi × × = C.3.7. Analisis Asam Propionat dan Butirat AOAC 1995 Pengujian asam lemak rantai pendek asam propionat dan butirat dilakukan dengan Gas Kromatografi GC. Preparasi sampel : Sampel di ekstraksi dengan menggunakan metode soxlet untuk mendapatkan minyaknya. Minyak sampel diambil 0.02 – 0.05 gram dan ditambahkan dengan 2 – 5 ml NaOH dalam methanol. Setelah itu dipanaskan pada suhu 80 °C selama 20 menit kemudian didinginkan. Kemudian ditambahkan BF3 sebanyak 2 – 5 ml dan dipanaskan kembali pada suhu 80 °C selama 20 menit. Setelah digin ditambahkan 2 – 5 ml NaCl jenuh dan 2 – 5 ml hexan, dikocok agar 35 merata. Setelah itu diambil lapisan hexan sebanyak 2 – 5 µl untuk diinjekkan ke alat Gas Kromatografi. Kondisi alat GC yang digunakan yaitu kolom DEGS diethyl glikol sukcianat, suhu inisial 150 °C, suhu final 180°C, suhu injeksi 200 °C dan suhu detektor 250°C. Detektor FID flame ionitation detectorI dengan gas pembawa nitrogen dan hidrogen. C.3.8. Analisis Histologi Analisis histologi dilakukan pada aorta dan kolon. Tahapan pertama dalam pengamatan ini adalah pembuatan preparat yang mengacu pada prosedur umum mikrotehnik dengan fiksatif larutan Bouin. Sampel difiksasi dalam larutan Bouin selama 24 jam lalu dipotong dengan ukuran 3 – 5 mm. Potongan jaringan tersebut didehidrasi yaitu dimasukkan kedalam alkohol dengan konsentrasi 70, 80, 90 masing-masing selama ± 24 jam dan alkohol 95 selama 22 jam kemudian dimasukkan dalam alkohol 100 selama satu jam sebanyak 3 kali. Setelah proses dehidrasi, kemudian jaringan tersebut dimasukkan kedalam xylol proses clearing selama satu jam sebanyak 3 kali, pada xylol ketiga dibagi menjadi 2 yaitu 30 menit di suhu kamar dan 30 menit lainnya di inkubasi pada suhu 55°C dan setelah itu dilakukan penanaman jaringan kedalam parapin embedding. Jaringan yang telah ada dalam blok-blok paraffin disayat dengan menggunakan mikrotom. Hasil potongan jaringan dibentangkan dalam waterbath dengan suhu 40 C setebal ± 5 mikron. Sayatan diletakkan di atas gelas obyek, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C dan setelah itu siap untuk diwarnai setelah melekat sempurna pada objek gelas. Tahapan selanjutnya adalah pewarnaan. Untuk aorta dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Verhoff-von Gieson, sedangkan untuk usus di lakukan dengan pewarnaan Haemotoxylin-eosin. Secara rinci prosedur pewarnaan dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2. Tahapan terakhir dilem dengan entelan dan ditutup dengan cover glass mounting, kemudian diamati di bawah mikroskop dan kemudian dilakukan pengambilan gambar dengan mikroskop kamera Nikon E6000.

D. ANALISA DATA