6. Pengiriman dilakukan secepatnya maksimal dalam waktu 3 jam harus sudah
sampai di laboratorium.
3.5.3. Teknik Penetapan Bakteri E. coli
Prinsip yang dipakai dalam penetapan bakteri E. coli adalah menghitung pertumbuhan bakteri setelah sampel diinkubasi dalam media pembenihan yang cocok
pada suhu ± 37°C dan ± 44 °C selama 24-48 jam. Masukkan 10 ml air es teh, lalu ditambahkan 90 ml aquades atau
menggunakan buffet phospat. Pemeriksaan Most Probable Number MPN atau Angka Paling Mungkin APM dilakukan terhadap bahan pemeriksaan yang telah
disiapkan dengan menggunakan metode tabung ganda: 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml.
Pemeriksaan tabung ganda yang terdiri dari : 1. Test Perkiraan Presumptive Test
2. Test penegasan Confirmative Test
1. Test Perkiraan Presumptive Test
Media yang digunakan adalah Lactose Broth LB. Cara pemeriksaan :
1. Siapkan 7 tabung reaksi yang masing-masing berisi media lactose broth
sebanyak 10 ml. Tabung disusun pada rak tabung reaksi, masing-masing tabung diberi tanda sebagai berikut :
a. Nomor urut
b. Tanggal pemeriksaan
c. Volume
Universitas Sumatera Utara
2. Dengan pipet steril ambil bahan pemeriksaan yang telah disiapkan. Masukkan
ke dalam : a.
Tabung 1 sd 5 masing-masing sebanyak 10 ml. b.
Tabung ke 6 sebanyak 1 ml c.
Tabung ke 7 sebanyak 0,1 ml d.
Masing-masing tabung tersebut digoyang-goyang agar spesimen dan media tercampur.
2. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 jam. Setelah 24 jam diperiksa ada
tidaknya pembentukan gas pada tabung durham. 3.
Catat semua tabung yang menunjukkan peragian lactose pembentukan gas. a.
Bila terbentuk gas pada tabung dinyatakan positif +, dan dilanjutkan dengan test penegasan.
b. Apabila test dalam waktu 24 jam tidak membentuk gas, dimasukkan
ke inkubator kembali pada suhu 37 selama 24 jam. Bila terbentuk
gas pada tabung durham, hasil menunjukkan positif + dan test dilanjutkan dengan test penegasan.
c. Bila test negatif - berarti E. coli negatif - dan tidak perlu dilakukan
test penegasan.
2. Test Penegasan Confirmative Test
Media yang digunakan adalah Brilliant Green Lactose Broth BGLB 2. Test ini untuk menegaskan hasil positif dari test perkiraan.
Universitas Sumatera Utara
Cara pemeriksaan : 1.
Dari tiap-tiap tabung presumptive yang positif, dipindahkan 1-2 ose ke dalam tabung confirmative yang berisi 10 ml BGLB 2. Dari masing-masing tabung
presumptive diinokulasikan ke dalam 2 tabung BGLB 2 . 2.
Satu seri tabung BGLB 2 diinkubasikan pada suhu 35-37°C selama 24-48 jam untuk memastikan adanya coliform dan satu seri yang lain diinkubasikan pada
suhu 44°C selama 24 jam untuk memastikan adanya coliform tinja coli fecal. 3.
Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB 2 yang menunjukkan positif gas.
Pembacaan Hasil Pemeriksaan Laboratorium
Pembacaan hasil dari test penegasan dilakukan dengan menghitung jumlah tabung yang menunjukkan adanya gas baik pada seri tabung yang diinkubasi pada
suhu 37°C maupun pada seri tabung yang diinkubasi pada suhu 44°C. Angka yang diperoleh dicocokkan dengan tabel MPN, maka akan diperoleh
indeks MPN Coliform untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 37°C dan indeks MPN Escherichia coli untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 44°C.
Pemeriksaan Pertumbuhan Koloni
Dengan kawat ose steril diambil bahan secara aseptis dari biakan media BGLB, kemudian ditanamkan dengan cara zigzag pada permukaan media endo agar,
lalu dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37°C selama 48 jam. Setelah masa inkubasi selesai, diamati pertumbuhan koloni ini. Jika koloni berbentuk bulat, licin
berwarna kilap logam, selanjutnya dilakukan pemeriksaan identifikasi E. coli dengan memakai pewarnaan gram.
Universitas Sumatera Utara
Identifikasi Dengan Pewarnaan Gram
1. Koloni dari medio endo agar diambil dengan kawat ose steril lalu diletakkan
pada object glass yang telah ditetesi dengan aquadest. Lalu dikeringkan dengan nyala api bunsen perlahan-lahan.
2. Kemudian ditetesi dengan larutan gentian violet 5 selama 5 menit, lalu cuci
dengan mengalirkan air diatasnya. 3.
Selanjutnya ditetesi dengan larutan lugol 1 selama 1 menit. Kemudian larutan lugol dicuci dengan mengalirkan air diatasnya.
4. Langkah selanjutnya adalh menetesi alkohol 99 hingga tidak berwarna lagi
bersih. 5.
Selanjutnya object glass ditetesi dengan larutan karbon fuchsin selama 3 menit. 6.
Kemudian dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring. 7.
Fiksasi 3 kali. 8.
Lihat dengan mikroskop lensa rendah minyaklensa 100x dan diberi emersil oil. 9.
Bila terlihat kuman berbentuk batang gram - berwarna merah berarti positif E. coli.
10. Hitung APM E. coli per gram sampel dengan menggunakan tabel daftar APM.
3.6. Definisi Operasional
Kategori