Jenis dan Rancangan Penelitian Alat dan Instrumen Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

18

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

Variabel-variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variasi dosis pemberian infusa kulit Persea americana tikus jantan galur wistar terinduksi karbon tetraklorida. b. Variabel tergantung. Penurunan aktivitas enzim alkali fosfatase tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida setelah pemberian infusa kulit Persea americana selama 6 hari.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi hewan uji yang digunakan, yaitu tikus jantan galur Wistar yang berumur 2-3 bulan, dengan berat badan antara 150-250 gram; cara pemberian hepatotoksin secara intraperitoneal; cara pemberian infusa kulit Persea americana secara per oral; frekuensi waktu pemberian infusa kulit Persea americana Mill. satu kali sehari selama 6 hari berturut-turut dengan waktu pemberian yang sama; dan bahan uji berupa kulit Persea americana Mill . b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi patologis dari tikus jantan galur Wistar yang digunakan sebagai hewan uji.

3. Definisi operasional

a. Infusa kulit Persea americana Mill. Infusa serbuk kering kulit Persea americana Mill. didapatkan dengan cara menginfundasi 8 gram serbuk kering kulit Persea americana Mill. dalam 100,0 ml air pada suhu 90°C selama 15 menit. b. Pemberian jangka panjang. Didefinisikan sebagai pemberian infusa kulit Persea americana Mill. satu kali sehari selama enam hari berturut-turut dalam waktu pemberian yang sama. c. Penurunan aktivitas ALP. Didefinisikan sebagai penurunan aktivitas ALP serum tikus dosis perlakuan yang dibandingkan dengan aktivitas ALP serum tikus kontrol hepatotoksin.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galur Wistar yang berumur 2-3 bulan dengan berat badan 150-250 gram yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah kulit Persea americana Mill. yang diperoleh dari salah satu depot es di Yogyakarta selama bulan Juni-Juli 2014.

2. Bahan kimia

a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Pelarut hepatotoksin digunakan larutan olive oil Bertoli® yang diperoleh dari Supermarket Mirota Kampus, Yogyakarta. c. Kontrol negatif yang digunakan adalah olive oil Bertoli®. d. Pelarut untuk infusa digunakan aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. e. Reagen serum ALP Komposisi dan konsentrasi dari reagen ALP Abbott yang digunakan adalah sebagai berikut. Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen ALP Abbott Komposisi Konsentrasi Reagen 1 2-Amino-2-methylpropanol 1.2 molL Magnesium 7.2 mmolL Zinc Sulfate 3.6 mmolL HEDTA 7.2 mmolL Reagen 2 4-Nitrophenyl Phospate 171.6 mmolL

D. Alat dan Instrumen Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain oven, mesin penyerbuk, ayakan, panci enamel, termometer, stopwatch , beaker glass, gelas ukur, cawan porselen, penangas air, kain flannel, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk Pyrex Iwaki Glass®, timbangan analitik Mettler Toledo®, sentrifuge Centurion Scientific®, vortex Genie Wilten®, spuit injeksi per oral dan syringe 3 cc Terumo®, pipa kapiler, tabung Eppendorf, dan moisture balance .

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi

Persea americana Mill. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan Persea americana Mill. yang diperoleh dari salah satu depot es di Yogyakarta dengan buku acuan. 2. Pengumpulan bahan uji Bahan uji yang digunakan adalah kulit Persea americana Mill. yang masih segar dan tidak busuk selama bulan Juni-Juli 2014. 3. Pembuatan serbuk kulit Persea americana Mill. Kulit Persea americana Mill. dicuci bersih dan dipisahkan dari kulitnya. Setelah itu, kulit dipotong-potong lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 50 °C selama 24 jam. Setelah kulit benar-benar kering, kulit dihaluskan dan diayak dengan ayakan nomor 40 agar kandungan fitokimia dalam kulit Persea americana Mill. lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk lebih besar. 4. Penetapan kadar air pada serbuk kering kulit Persea americana Mill. Serbuk kering kulit Persea americana Mill. yang sudah diayak, dimasukkan ke dalam alat moisture balance sebanyak ± 5 g kemudian diratakan. Bobot serbuk kering kulit tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 110 °C. Serbuk kering kulit Persea americana Mill. yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A terhadap bobot B yang merupakan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill. 5. Pembuatan infusa serbuk kulit Persea americana Mill. Serbuk kering kulit Persea americana Mill. ditimbang 8,0 g dan dimasukkan ke dalam 16,0 ml pelarut aquadest dan kemudian ditambahkan lagi aquadest sebanyak 100,0 ml, kemudian dipanaskan pada suhu 90°C dan dijaga tetap dalam suhu tersebut selama 15 menit. Waktu 15 menit dihitung ketika suhu campuran mencapai 90°C. Setelah 15 menit, campuran tersebut diambil dan diperas menggunakan kain flanel kemudian tambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infusa kulit Persea americana Mill. yang dikehendaki.

6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida

Larutan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50, dengan cara melarutkan 50 ml karbon tetraklorida ke dalam olive oil sebanyak 50 ml berdasarkan hasil penelitian Janakat dan Al-Merie 2002.

7. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida. Pemilihan dosis ini dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa karbon tetraklorida mampu menyebabkan kerusakan hati tikus yang ditandai dengan peningkatan ALT- AST dalam serum darah paling tinggi. Dosis hepatotoksik ini mengacu pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 dan orientasi melalui induksi hewan uji dengan karbon tetraklorida dosis 2 mLkgBB secara i.p. b. Penetapan dosis infusa kulit Persea americana Mill. Berdasar penelitian yang dilakukan Putri 2013, konsentrasi infusa biji Persea americana Mill. yang mampu memberikan efek hepatoprotektif adalah 8 g100 mL. Selain itu, mengacu pada penelitian Vinha, et al. 2013, kandungan flavonoid pada kulit dan biji Persea americana Mill. relatif sama. Maka penelitian ini menggunakan dosis seperti pada penelitian yang dilakukan Putri. Peringkat dosis didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan pada masyarakat yaitu ± 2 sendok makan 4 g serbuk kulit Persea americana Mill. yang direbus dengan 250 ml air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g70 kgBB manusia. Konversi dosis tikus manusia 70 kg ke tikus 200g = 0,018. Dosis untuk 200 g tikus = 0,018 x 4g = 0,72 g200 g BB = 360 mgkgBB sebagai dosis rendah. Konsentrasi maksimal infusa kulit Persea americana Mill. yang dapat dibuat adalah 8 g 100 ml, dengan asumsi berat badan hewan uji maksimal adalah 250 g, dan volume maksimal pemberian infusa secara p.o = 5 ml. Berdasarkan perhitungan, D x 250 g = 8 g 100ml x 5 ml D = 1600 mgkgBB, dosis ini disebut dosis tinggi perlakuan. Untuk mendapatkan dosis tengah perlakuan, terlebih dahulu dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi yang sudah diperoleh. Perhitungan faktor kelipatan adalah sebagai berikut : � � ��� � �ℎ −1 N = Jumlah peringkat dosis yang digunakan. Penelitian ini menggunakan 3 peringkat dosis maka n = 3, sehingga perhitungannya sebagai berikut : 1600 360 3 −1 = 2,1 faktor kelipatan Berdasarkan faktor kelipatan yang diperoleh maka dosis tengah dan dosis rendah perlakuan ditentukan sebagai berikut, D = 1600 mg kgBB : 2,1 = 761,90 mg kgBB dosis tengah D = 761,90 mg kgBB : 2,1 = 362,81 mg kgBB dosis rendah c. Penetapan waktu pencuplikan darah Berdasarkan penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, waktu optimum kenaikan serum ALT-AST akibat pemejanan karbon tetraklorida 2 mlkgBB adalah pada jam ke-24. Penetapan waktu pencuplikan ini ditentukan dengan orientasi tiga kelompok perlakuan waktu, yaitu pada jam ke –0, 24, dan 48 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 hewan uji yang pengambilan darahnya dilakukan melalui pembuluh sinus orbitalis mata kemudian diukur aktivitas ALT-AST.

8. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji

Digunakan 30 ekor tikus jantan galur Wistar sebagai hewan uji yang dibagi secara acak dalam 6 kelompok perlakuan masing-masing sejumlah lima ekor tikus. a. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi larutan karbon tetraklorida : olive oil

1:1 dosis 2 mlkgBB secara i.p.

b. Kelompok II kontrol negatif diberi olive oil dosis 2 mlkgBB secara i.p. c. Kelompok III kontrol IKPA diberi infusa kulit P. americana Mill. dosis 1600 mgkgBB secara p.o. selama 6 hari berturut-turut. d. Kelompok IV IKPA dosis 362,81 mgkgBB diberi infusa kulit P. americana Mill. secara p.o. sekali sehari selama 6 hari berturut-turut. e. Kelompok V IKPA dosis 761,90 mgkgBB diberi infusa kulit P. americana Mill. secara p.o. sekali sehari selama 6 hari berturut-turut. f. Kelompok VI IKPA dosis 1600 mgkgBB diberi infusa kulit P. americana Mill. secara p.o. sekali sehari selama 6 hari berturut-turut. Pada hari ketujuh kelompok IV-VI diberi larutan karbon tetraklorida dosis 2 mlkgBB secara intraperitonial. Setelah 24 jam paska induksi karbon tetraklorida, tikus diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, kemudian diukur aktivitas ALP.

9. Pembuatan serum

Darah diambil melalui sinus orbitalis mata hewan uji dan ditampung dalam tabung Eppendorf dan didiamkan selama 15 menit, lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm, lalu dipisahkan bagian supernatannya.

10. Pengukuran aktivitas ALP

Penetapan aktivitas ALP ditetapkan berdasarkan reaksi enzimatik menggunakan reagen kit Abbott® ALP yang terdiri dari reagen 1 2-Amino-2- methylpropanol 1.2 molL, Magnesium 7.2 mmolL, Zinc Sulfate 3.6 mmolL, dan HEDTA 7.2 mmolL dan reagen 2 4-Nitrophenyl Phosphate 171.6 mmolL. Prosedur penetapan aktivitas ALP berdasarkan prosedur kerja dari Abbott®. Pengukuran aktivitas ALP ini dilakukan di Laboratorium Parahita, Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas ALP diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui distribusi data tiap kelompok hewan uji. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat perbedaan masing-masing antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Namun bila didapatkan distribusi tidak normal, maka dilakukan analisis dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas ALP antar kelompok. Setelah itu dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui kebermaknaan perbedaan tiap kelompok. 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian jangka panjang infusa kulit Persea americana Mill. terhadap aktivitas ALP serum dan mengetahui kekerabatan antara dosis pemberian infusa kulit Persea americana Mill. dengan penurunan aktivitas ALP yang dihasilkan pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida. Hasil penelitian yang akan dibahas adalah determinasi Persea americana Mill., penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill., dan pemeriksaan aktivitas ALP serum.

A. Determinasi

Persea americana Mill. Determinasi bertujuan untuk memastikan bahwa bahan yang digunakan untuk penelitian memang benar bahan yang dimaksud, di mana pada penelitian ini bahan yang digunakan adalah kulit Persea americana Mill. Determinasi dilakukan secara makroskopis dengan mencocokkan Persea americana Mill. yang diperoleh dari salah satu depot es di Yogyakarta dengan buku acuan. Hasil determinasi yang diperoleh adalah kulit yang digunakan benar kulit Persea americana Mill.

B. Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dari serbuk kulit Persea americana Mill. bertujuan untuk mengetahui serbuk tersebut telah memenuhi persyaratan serbuk yang baik,