BAB III METODE PENELITIAN
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Metode penelitian meliputi pengumpulan sampel, karakterisasi sampel, skrining dan
pengujian aktivitas antioksidan secara spektrofotometri visibel. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat alat gelas, seperangkat alat penetapan kadar air, kertas saring, aluminium foil, neraca kasar Ohaus, neraca
analitis Vibra, oven listrik Stork, Spektrofotometer UV-Visibel Shimadzu, penangas air dan eksikator.
3.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah madu dari hutan Lhoknga, Montasik dan Sare. Bahan-bahan kimia adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DPPH Sigma, Butylated Hydroxytoluen BHT Sigma, metanol, serbuk Mg, amil alkohol, α-naftol, asam nitrat pekat, natrium sitrat, natrium karbonat,
tembaga II sulfat, resrsinol, asam klorida pekat dan air suling.
3.3 Pengumpulan Sampel
Madu yang di gunakan diperoleh dari hutan Lhoknga, hutan Montasik dan
hutan Sare, kabupaten Aceh Besar.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.2 Pereaksi Benedict
Sebanyak 34,6 g natrium sitrat dan 20 g natrium karbonat dilarutkan dalam 180 ml air suling diaduk dan di saring, kemudian di tambahkan 3,46 g tembaga
II sulfat dalam 20 ml kemudian ditambahkan air suling sampai 200 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.3 Pereaksi Benedict
Sebanyak 1 g resorsinol dilarutkan dalam asam klorida pekat, kemudian dicukupkan volumenya sampai 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.4.4 Larutan DPPH 0,5 mM
Sebanyak 20 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol hingga volume 100 ml Molyneux, 2004.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Sampel
Pemeriksaan karakteristik sampel meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar
abu yang tidak larut dalam asam.
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap madu meliputi pemeriksaan bentuk, warna, bau dan rasa.
Universitas Sumatera Utara
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap madu untuk melihat butir butir serbuk sari yaitu dengan cara meneteskan madu di atas objek glass lalu
ditutupi dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Cara kerja:
1. Penjenuhan Toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca skalanya.
2. Penetapan Kadar Air Sampel Ke dalam labu yang berisi toluen jenuh diatas, dimasukkan 5 g madu yang
telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian
besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume
air dibaca. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen SNI, 2010
3.5.4 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g madu ditimbang, dimasukkan ke dalam krus porselen yang
Universitas Sumatera Utara
telah dipijar di dalam oven pada suhu 105ºC selama 30 menit dan ditara, diratakan. Krus dipijarkan perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran
dilakukan pada suhu 500-600ºC sampai bobot tetap. Kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu total dihitung dalam persen SNI, 2010.
3.5.5 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dikeringkan dalam oven pada suhu 105ºC
selama 30 menit lalu dipijar pada suhu 500-600ºC sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung
dalam persen SNI, 2010.
3.6 Skrining Madu 3.6.1 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g madu ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g
serbuk Mg, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika pada lapisan amil alkohol terjadi warna merah
kekuningan atau jingga Farnsworth, 1966.
3.6.2 Pemeriksaan Sukrosa
Sebanyak 5 ml madu di masukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Molish di campur rata, kemudian di tambahkan 3 ml
asam sulfat pekat secara perlahan lahan melalui dinding tabung, cincin ungu yang terbentuk pada batas kedua cairan menunjukkan reaksi positif Gunawan, 2004.
Universitas Sumatera Utara
3.6.3 Pemeriksaan Glukosa
Sebanyak 5 ml pereaksi benedict dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian di tambahkan 8 tetes larutan madu di campur rata dan didihkan selama
5 menit, biarkan samapai dingin kemudian di amati perubahan warnanya, jika terbentuk endapan merah bata menunjukkan reaksi postif Gunawan, 2004.
3.6.4 Pemeriksaan Fruktosa
Masukkan 0,5 mL larutan madu ke dalam tabung reaksi, tambahkan 5 mL pereaksi Seliwanoff, campur dan letakkan tabung di dalam penangas air mendidih
selama 60 detik, jika terbentuk warna merah menunjukkan reaksi positif Gunawan, 2004.
3.7 Pengujian Kemampuan Antioksidan Dengan Spektrofotometri Visibel 3.7.1 Prinsip Metode DPPH
Kemampuan sampel uji dalam meredam proses oksidasi DPPH 1,1-
diphenyl-2-picryl-hydrazil sebagai radikal bebas dalam larutan metanol sehingga terjadi perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning dengan nilai IC50
konsentrasi sampel uji yang mampu meredam radikal bebas 50 digunakan sebagai parameter untuk menentukan aktivitas antioksidan sampel uji.
3.7.2 Pengukuran Larutan DPPH Timbang 20 mg DPPH kemudian dilarutkan dalam metanol hingga
volume 100 ml untuk mendapatkan Larutan DPPH 0,5 mM . Dipipet sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda. Pengukuran dilakukan setelah didiamkan selama 60 menit pada panjang gelombang 516 nm.
Universitas Sumatera Utara
3.7.3 Pembuatan Larutan Induk
Sebanyak 500 mg sampel uji madu ditimbang, dimasukkan ke dalam labu 50 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda konsentrasi 10.000
µ
gml.
3.7.4 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Sampel Uji
Larutan induk dipipet sebanyak 7,5 ml dan 10 ml dan 12,5 ml ke dalam labu tentukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 3000
µ
gml, 4000
µ
gml dan 5000
µ
g ml. Ke dalam masing-masing labu tentukur ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis
tanda. Pengukuran dilakukan setelah didiamkan selama 60 menit pada panjang gelombang 516 nm.
3.7.5 Pengukuran Aktivitas Antioksidan BHT
Sebanyak 25 mg BHT ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai
garis tanda. Dipipet sebanyak 0,5 ml; 1 ml; dan 1,5 ml ke dalam labu tentukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 20
µ
gml, 40
µ
gml dan 60
µ
gml. Ke dalam masing-masing labu tentukur ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM
lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Pengukuran dilakukan setelah didiamkan selama 60 menit pada panjang gelombang 516 nm.
3.7.6 Penentuan Persen Peredaman
Penentuan aktivitas penangkap radikal bebas dari sampel uji menggunakan metode DPPH. Pengukuran dilakukan setelah didiamkan selama 60 menit.
Nilai serapan larutan DPPH sebelum dan sesudah penambahan ekstrak tersebut dihitung sebagai persen inhibisi inhibisi dengan rumus sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
inhibisi =
kontrol sampel
kontrol
A A
A −
X 100 Keterangan : A
kontrol
= Absorbansi tidak mengandung sampel A
sampel
= Absorbansi sampel
Universitas Sumatera Utara
B A B IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Karakterisasi
Hasil pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap ketiga madu hutan Lhoknga, Montasik dan Sare merupakan cairan kental, berwarna coklat
kemerahan, coklat kekuningan, coklat kekuningan tua, mempunyai bau dan rasa yang khas. Hasil pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap madu
menunjukkan adanya butir butir serbuk sari. Hasil penetapan kadar air, kadar abu total dan kadar abu yang tidak larut dalam asam dapat dilihat pada table 4.1.
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi madu
No Karakterisasi madu
Hasil Madu
Lhoknga Madu
Montasik Madu
Sare 1
Kadar air 20,62
22,94 21,91
4 Kadar abu total
0,23 0,24
0,23 5
Kadar abu yang tidak larut dalam asam
0,13 0,10
0,11 Karakteristik madu telah terdapat dalam Standar Nasional Indonesia.
Persyaratan umum pada Standar Nasional Indonesia yaitu kadar air tidak lebih dari 22 dan kadar abu tidak lebih dari 0,5. Hasil penetapan kadar air dan kadar
abu memenuhi persyaratan pada Standar Nasional Indonesia. Kadar abu total dilakukan untuk mengetahui jumlah senyawa anorganik pada madu, sedangkan
kadar abu yang tidak larut dalam asam dilakukan untuk mengetahui senyawa anorganik yang tidak larut dalam asam.
Universitas Sumatera Utara
4.2 Hasil Skrining
Kategori