BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Metodologi penelitian meliput i pengumpulan dan preparasi bahan, karakterisasi
simplisia, pembuatan ekstrak etanol, fraksi ekstrak n-heksan, etil asetat, dan etanol, skrining fitokimia, dan uji aktivitas antioksidan dengan metode aktivitas
antiradikal bebas DPPH dengan menggunakan alat spektrofotometer visibel.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari: Alat alat gelas laboratorium Erlenmeyer, gelas beaker, gelas ukur, labu tentukur, tabung reaksi, gelas corong,
labu alas bulat, pendingin Liebig, spektofotometer UVVis Shimadzu mini 1240, penguap vakum putar Heidolph VV 2000, freeze dryer
ModulyoEdwards, mikroskop, krus porselin, tanur Gallenkamp, neraca analitis Vibra, penangas air Yenaco, desikator, timbangan, object glass, gelas
penutup, lemari pengering, pisau, krus tang.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah bunga brokoli Brassica oleracea L. var botrytis L., dan air suling. Bahan bahan kimia yang lainnya
adalah berkualitas pro analisis produksi Sigma: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH; produksi E-Merck: metanol, toluen, raksa II klorida, kalium iodida,
bismuth III nitrat, asam nitrat pekat, besi III klorida, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, kloralhidrat, kloroform, isopropanol, benzen, asam
asetat anhidrit, natrium hidroksida, amil alkohol. Bahan kimia berkualitas teknis: etanol 70, n-heksan, etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengambilan bahan tumbuhan,
identifikasi tumbuhan, dan pengolahan bahan tumbuhan. 3.3.1 Pengambilan Bahan Tumbuhan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah
bunga brokoli yang diambil dari daerah Brastagi, Kabupaten Karo, Propinsi Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI.
Hasil dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 31.
3.3.3 Pengolahan Bahan Tumbuhan
Bunga brokoli dikumpulkan, dibersihkan, dicuci, dikukus selama 3 menit, ditiriskan, kemudian diiriskan bagian kecambah bunganya. Bagian kecambah
bunga ditimbang sebagai berat basah. Bahan ini kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering, yaitu jika simplisia tersebut diremas akan hancur,
kemudian ditimbang sebagai berat kering.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1978.
3.4.2 Larutan HCl 2N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1978.
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Timbal II asetat 0,4 M
Timbal II asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling bebas CO
2
hingga 100 ml Depkes RI, 1978. 3.4.4 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu
dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan
air suling hingga diperoleh larutan 100 ml. Depkes RI, 1978. 3.4.5 Pereaksi Mollish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml Depkes RI, 1978.
3.4.6 Pereaksi Dragendorf
Sebanyak 0,8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50
ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml Depkes RI,
1978.
3.4.7 Larutan Kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes, 1979.
3.4.8 Larutan Pereaksi Asam Sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga diperoleh 100 ml Depkes RI, 1978.
Universitas Sumatera Utara
3.4.9 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya kemudian ditambahkan 2 g iodida sedikit demi sedikit cukupkan dengan air suling
Depkes RI, 1978.
3.4.10 Pereaksi Liebermann-Burchard
Campur secara perlahan 5 ml asam asetat anhidrit dengan 5 ml asam sulfat pekat tambahkan etanol hingga 50 ml Merck, 1978.
3.4.10 Larutan Pereaksi DPPH 0,5 mM
Sebanyak 19,7 mg DPPH ditimbang, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga volume 100 ml.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia bunga brokoli.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia bunga brokoli. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan
larutan kloralhidrat dan tutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima.
Universitas Sumatera Utara
a. Penjenuhan Toluen
Sebanyak 200 ml toluena dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan Kadar Air Simplisia
Kemudian kedalam labu tersebut dimasukkan 5 gram serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah
toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.
3.5.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan
sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam
Universitas Sumatera Utara
persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
3.5.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI,
1995.
3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600
o
C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Depkes RI, 1995.
3.5.7 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.6. Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan menurut Depkes 1979 dan Farnsworth 1966 untuk mengetahui golongan senyawa alkaloida, glikosida, glikosida
antrakinon, saponin, tanin, dan steroidatriterpenoida.
3.6.1 Pemeriksaan Alkaloida
Ekstrak diitimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida: diambil tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi : 1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat 3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhkan pada paling sedikit dua hari tiga percobaan diatas Depkes, 1978.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g
serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah atau kuning
atau jingga pada lapisan amil alkohol
Farnsworth, 1966
.
3.6.3 Pemeriksaan Glikosida
Ekstrak ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam,
Universitas Sumatera Utara
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat
disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur
tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukan dalam
tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Mollish. Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml
asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida Depkes, 1978.
3.6.3.1 Pemeriksaan Glikosida antrakinon
Ekstrak ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena,
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan
lapisan benzena tidak berwarna menunjukan adanya antrakinon Depkes, 1978.
3.6.4 Pemeriksaan Saponin
Ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2N
menunjukan adanya saponin Depkes, 1978
Universitas Sumatera Utara
3.6.5 Pemeriksaan Tanin
Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes
peraksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukan adanya tanin Depkes, 1978
3.6.6 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa
tetes pereaksi
Liebermann-Burchard.
Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu
menunjukkan adanya triterpenoida
Harborne, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Bunga Brokoli
Pembuatan ekstrak etanol bunga brokoli dilakukan dengan cara perkolasi. Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 200 g serbuk simplisia dibasahi dengan
etanol 70 dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari etanol sampai semua simplisia terendam
dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan
dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan perkolat diatur 1 ml menit, perkolat ditampung. Perkolasi dihentikan pada saat beberapa tetes perkolat tidak
bereaksi ketika ditambahkan serbuk Mg dan asam klorida pekat, kemudian dipekatkan dengan alat penguap vakum putar setelah itu di freeze dryer hingga
diperoleh ekstrak kental. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada gambar 13 halaman 36 DepKes RI, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.8 Pembuatan Fraksi Ektrak Bunga Brokoli
Kategori