UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. NB Nutrient Broth
Sebanyak 8 gram serbuk nutrient broth NB ditambahkan dengan 1 liter aquades dipanaskan hingga larut diatas hot plate dan menggunakan magnetik
stirer sampai bening. Media disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 C selama
15 menit Alexander, 2007.
3.3.5.4 Peremajaan Bakteri
Peremajaan bakteri menggunakan agar miring NA, peremajaan bakteri yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas
aeruginosa . Bakteri diambil satu ose menggunakan ose steril selanjutnya
digoreskan pada permukaan agar miring dengan cara silang zig-zag dan di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37
C Nurcahyani dan Timous, 2011
3.3.5.5 Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan teknik pewarnaan Gram yaitu dengan cara sebagai berikut, sebanyak 1 tetes NaCL diteteskan diatas kaca objek,
kemudian disebar setipis mungkin menggunakan ose yang ada bakterinya yang diambil dari bakteri uji. Selanjutnya difiksasi dengan melewatkanya diatas api.
Dan siap diwarnai. Sebanyak 1 tetes larutan karbol kristal ungu diteteskan pada preparat di
atas dan dibiarkan selama 5 menit, kemudian dicuci dengan air. Setelah itu, sebanyak 1 tetes Lugol diteteskan pada preparat dan dibiarkan selama 1 menit,
kemudian dicuci dengan air, kemudian preparat dibilas dengan alkohol 70 dengan cara dicelupkan kedalam bejana berisi alkohol. Selanjutnya dicuci kembali
dengan air, selanjutnya sebanyak 1 tetes larutan air Safranin diteteskan pada preparat dan dibiarkan selama 1 sampai 2 menit setelah itu dicuci dengan air dan
dibiarkan mengering. Bentuk dan warna sel bakteri dalam preparat diamati secara mikroskopik pada perbesaran 1000 x.
3.3.5.6 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri dibiakan dengan cara di inkubasi dengan nutrien agar miring selama 24 jam pada suhu 37
C, kemudian diambil dengan ose dan disuspensikan dengan cara dimasukan kedalam tabung berisi 10 mL NaCl fisiologis 0,9 lalu
divortex sampai homogen dan dilihat kekeruhannya yang menandai bahwa ada pertumbuhan bakteri, kekeruhan disetarakan dengan Mc. Farland no. 3 yaitu
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
setara dengan 10
9
sel bakterimL. Kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis 0,9 steril sampai diperoleh konsentrasi 10
6
sel bakterimL Kuete, 2011. Penggunaan konsentrasi 10
6
sel bakterimL pada suspensi bakteri berdasarkan kerentanan anaerobik yaitu 10
6
- 10
4
pokyni,2010.
3.3.5.7 Pembuatan larutan uji
Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak menggunakan DMSO 5 dimetil sulfoxide. Larutan uji dibuat dengan membuat larutan induk 5000 ppm
yaitu sebanyak 0,25 gram ekstrak etanol 96 kulit batang kayu jawa Lannea coromandelica
dilarutkan dalam 50 ml DMSO 5, kemudian larutan induk tersebut diencerkan menjadi konsentrasi 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm dan 62,5
ppm untuk melakukan uji aktivitas antibakteri.
3.3.5.7 Penentuan Diameter Zona Hambat
Media agar NA yang telah disterilkan dimasukan kedalam cawan petri steril masing-masing sebanyak 20 mL dan dibiarkan memadat pada suhu kamar.
Media tersebut ditetesi dengan 100 μL suspensi bakteri uji dan diratakan dengan
menggunakan batang L sampai rata dan kering. Kertas cakram steril dengan diameter 6 mm diteteskan ekstrak etanol 96 kulit batang kayu jawa Lannea
coromandelica sebanyak 10
μl masing-masing konsentrasi yaitu 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, dan 65,2 ppm, kemudian diletakan pada media agar padat yang
telah ditetesi suspensi bakteri uji, DMSO 5 sebagai kontrol negatif, dan cakram 30
μg kloramfenikol sebagai kontrol positif. Kemudian di inkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam dan setelah di inkubasi diukur zona hambat yang terbentuk yang ditandai dengan adanya zona bening menggunakan jangka sorong Atikah,
2013
3.3.5.8 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum KHM
