Waktu dan Tempat Penelitian Alat Analisis Data Secara Statistik

16

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakasanakan pada bulan Oktober 2012 sampai Maret 2013, penelitian dilakasanakan di laboratorium penelitian dan laboratorium kimia analisis II kuantitatif Fakultas Farmasi USU.

3.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah spektrofotometer sinar ultra violet Shimadzu, FTIR Shimadzu, KCKT lengkap Shimadzu Prominience series dengan pompa LC 20 AD, degasser DGU 20 A 5 , injektor Rheodyne 7225i, kolom Shim-Pack VP-ODS 4,6 x 250 mm, detektor UVVIS SPD 20 A, neraca analitis Sartorius, Metler Toledo, sentrifuge Hitachi, oven Memmert, Hot plate, tanur Stuart, desikator, blender Kris, kertas saring Whatman No. 1 dan No.42, krus porselen, spatula, termometer dan alat-alat gelas lainnya Pyrex dan Oberol. 3.3 Sampel dan Bahan- bahan 3.3.1 Sampel Metode pengambilan sampel yang digunakan adalah metode purposif dimana sampel yang akan dianalisa dianggap sebagai sampel yang Universitas Sumatera Utara 17 representatif. Sampel merupakan sekam padi yang diambil di daerah Pangkalan Susu, kabupaten Langkat, Sumatera Utara.

3.3.2 Bahan- bahan

Bahan- bahan yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro analisis yaitu asam asetat glasial 96 E. Merck, asam klorida 37 E. Merck, asam sulfat 96 E. Merck, ammonium molibdat E. Merck, etanol 95 E. Merck, hidrogen peroksida 30 E. Merck, metanol grade for HPLC E. Merck, natrium hidroksida E. Merck, natrium fosfat E. Merck, kecuali aquabidest Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU, aquadest CV. Rudang Jaya dan vitamin C baku pabrik CSPS Weisheng Pharmaceutical. 3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pembuatan etanol 70 vv Diencerkan 368,5 ml etanol 95 vv dengan air secukupnya hingga 500 ml Ditjen POM, 1979.

3.4.2 Pembuatan Aquadest Bebas CO

2 Dididihkan Aquadest kuat-kuat dalam beaker glass selama 5 menit atau lebih dan diamkan sampai dingin dan tidak boleh menyerap karbondioksida dari udara Ditjen POM, 1979.

3.4.3 Pembuatan Larutan NaOH 0,03 M dalam etanol 70

Dilarutkan 0,66 gram NaOH dalam etanol 70 secukupnya hingga 500 ml Ditjen POM, 1979. Data dapat dilihat pada Lampiran 1. Universitas Sumatera Utara 18

3.4.4 Pembuatan Larutan NaOH 0,2 M

Dilarutkan 4,4 gram NaOH dalam aquades bebas CO 2 secukupnya hingga 500 ml Ditjen POM, 1979. Data dapat dilihat pada Lampiran 1.

3.4.5 Pembuatan Larutan Hidrogen Peroksida 3 vv

Diencerkan 15 ml H 2 O 2 30 dalam 150 ml air, kemudian dihomogenkan Ditjen POM, 1979.

3.4.6 Pembuatan Asam Asetat 10 vv

Diencerkan 10 ml asam asetat glasial dengan air secukupnya hingga 50 ml Ditjen POM, 1979. 3.4.7 Pembuatan Asam Klorida 2 N Diencerkan 8,33 ml HCl 37 dengan air secukupnya hingga 50 ml Ditjen POM, 1979. Data dapat dilihat pada Lampiran 1. 3.4.8 Pembuatan Asam Klorida 1 vv Diencerkan 0,37 ml HCl 37 dengan air secukupnya hingga 10 ml Ditjen POM, 1979. 3.4.9 Pembuatan Larutan NaOH 1 bv Dilarutkan 0,1 gram NaOH dalam aquades bebas CO 2 secukupnya hingga 10 ml Ditjen POM, 1979. 3.4.10 Pembuatan Larutan Pereaksi Larutan Pereaksi mengandung ammonium molibdat 4 mM, natrium fosfat 28 mM, dan asam sulfat 600 mM. Dilarutkan 2,296 gram natrium fosfat, 2,472 gram ammonium molibdat dan 16,3 ml H 2 SO 4 96 dengan air Universitas Sumatera Utara 19 secukupnya hingga 500 ml Melo, et al., 2012. Data dapat dilihat pada Lampiran 1. 3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Preparasi Sekam Padi Preparasi diawali dengan mengeringkan sekam padi dan dihaluskan dengan cara diblender. Serbuk kemudiaan diayak dengan mesh 40, serbuk halus ini digunakan untuk karakteristik sekam padi.

3.5.2 Karakteristik Sekam Padi Oryza sativa

3.5.2.1 Pemeriksaan Organoleptis

Pemeriksaan organoleptis meliputi bau, warna serta rasa.

3.5.2.2 Penetapan Kadar Abu Total

Ditimbang seksama sebanyak 2 gram serbuk sekam padi , kemudian dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, lalu diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600°C sampai arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh berat konstan. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.5.2.3 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama lima menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai berat Universitas Sumatera Utara 20 konstan, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.5.2.4 Susut Pengeringan

Ditimbang sebanyak 1 gram serbuk sekam padi dan dimasukkan ke dalam krus porselein yang telah ditimbang konstan, lalu dipanaskan pada suhu 105°C selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga berat konstan Ditjen POM, 1979.

3.5.3 Isolasi Hemiselulosa Sekam Padi HSP

Metode yang digunakan untuk isolasi Hemiselulosa dari sekam padi adalah sebagi berikut: ditimbang sebanyak 50 gram serbuk sekam padi, kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass lalu ditambahkan 500 ml NaOH 0,03 M dalam etanol 70 dan dipanaskan pada suhu 60°C dan diaduk selama 2 jam untuk melarutkan lignin. Suspensi tersebut dibiarkan mendingin ke suhu kamar dan disaring dengan kertas saring whatman No.1. Residu ditambahkan 500 ml NaOH 0,2 M, dan diaduk selama 8 jam pada suhu kamar untuk melarutkan hemiselulosa lalu disaring. Filtrat dipanaskan pada suhu 65°C, dan ditambahkan 137 ml H 2 O 2 3 secara bertahap. Setiap penambahan H 2 O 2 3 1 ml ke dalam filtrat dan diaduk secara konstan sampai diperoleh larutan jernih. Ditambahkan larutan asam asetat 10 dalam etanol 96 dengan perbandingan 1: 4 vv dan disimpan selama 1 jam. Filtrat disentrifugasi dengan laju 10.000 rpm selama 15 menit, dan filtrat dibuang, endapan dicuci dengan etanol 96, dan dikeringkan dengan vakum pengering. Hasil ditimbang beratnya Muchlisyam, dkk., 2011 Universitas Sumatera Utara 21 3.5.4 Karakteristik Hemiselulosa Sekam padi HSP 3.5.4.1 Pemeriksaan Organoleptis Pemeriksaan organoleptis meliputi bau, warna serta rasa.

3.5.4.2 Kelarutan

Ditimbang sebanyak 50 mg HSP, kemudian dilarutkan dalam 1 ml aquades, aquades 80°C, HCl 1, dan NaOH 1 dan dibandingkan kelarutannya Ditjen POM, 1979.

3.5.4.3 Pengujian karakeristik dengan Spektofotometri Inframerah

Ditimbang sebanyak 1 mg HSP dan 100 mg kalium bromida. Kemudian dimasukkan ke dalam lumpang,digerus hingga homogen yang selanjutnya dianalisis pada rentang bilangan gelombang 4000–500 cm -1 dan direkam spektrum Inframerahnya Muchlisyam, dkk., 2011.

3.5.4.4 Pengujian karakeristik dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT

Ditimbang sebanyak 50 mg HSP, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan ditambahkan dengan aquabidest sampai garis tanda. Dikocok, lalu disaring beberapa ml filtrat pertama dibuang. Larutan lalu disaring melalui penyaring membran Cellulose nitrate 0,2 µm dan diawanudarakan selama ± 20 menit. Kemudian larutan disuntikkan ke dalam sistem KCKT melalui injektor dengan loop 20 µl, menggunakan sistem elusi isokratik dengan fase gerak aquabidest dengan laju alir 0,8 mlmenit. Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 280 nm. Kromatogram direkam dan analisa kualitatif dilakukan dengan membandingkan tinggi puncak dan waktu retensi Muchlisyam, dkk., 2011. Universitas Sumatera Utara 22 3.5.5 Pengujian Kapasitas Antioksidan Hemiselulosa Sekam Padi HSP 3.5.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Vitamin C Ditimbang setara 50 mg Vitamin C, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dan dilarutkan dengan aquadest sampai garis tanda. Diperoleh konsentrasi Vitamin C pada Larutan Induk Baku LIB I adalah 1000 µgml.

3.5.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Dari LIB I dipipet 1,2 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan volumenya dengan aquadest hingga garis tanda untuk mendapatkan konsentrasi 120 µgml. Dipipet 0,5 ml dan dicampur dengan 5 ml larutan pereaksi sehingga diperoleh konsentrasi 10,909 µgml. Kemudian diinkubasi selama 90 menit pada suhu 95°C-100°C dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansi dari kompleks fosfomolibdenum pada panjang gelombang 400-800 nm.

3.5.5.3 Penentuan Waktu Kerja Operating time

Dari LIB I dipipet 1,2 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan volumenya dengan aquadest hingga garis tanda untuk mendapatkan konsentrasi 120 µgml. Dipipet 0,5 ml dan dicampur dengan 5 ml larutan pereaksi sehingga diperoleh konsentrasi 10,909 µgml. Kemudian diinkubasi selama 90 menit pada suhu 95°C-100°C dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansi dari kompleks fosfomolibdenum pada panjang gelombang maksimum yang didapat dengan selang waktu 1 menit selama 30 menit. Universitas Sumatera Utara 23

3.5.5.4 Pengukuran Kurva Kalibrasi Vitamin C

Dari LIB I dipipet 0,8 ml, 1 ml, 1,2 ml, 1,4 ml dan 1,6 ml ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan volumenya dengan aquadest hingga garis tanda untuk mendapatkan konsentrasi 80 µgml, 100 µgml, 120 µgml, 140 µgml dan 160 µgml. Dipipet 0,5 ml dan dicampur dengan 5 ml larutan pereaksi kemudian diinkubasi selama 90 menit pada suhu 95°C-100°C dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansi dari kompleks fosfomolibdenum pada panjang gelombang maksimum yang didapat. Data perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 10.

3.5.5.5 Penetapan Kapasitas Antioksidan dari Hemiselulosa Sekam Padi HSP

Ditimbang sebanyak 75 mg HSP, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 ml, dan dilarutkan dengan aquadest sampai garis tanda. Dipipet 0,5 ml dan dicampur dengan 5 ml larutan pereaksi kemudian dicukupkan volumenya dengan aquadest dan diinkubasi selama 90 menit pada suhu 95°C- 100°C dan didinginkan pada suhu kamar kemudian diukur absorbansi dari kompleks fosfomolibdenum pada panjang gelombang maksimum yang didapat. Data pengamatan dapat dilihat pada Lampiran 13. 3.6 Uji Validasi Metode 3.6.1 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Batas deteksi atau Limit of Detection LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi atau Limit of Quantitation LOQ Universitas Sumatera Utara 24 merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Menurut Harmita 2004, batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Simpangan Baku = 2 n Yi Y 2 − − ∑ LOD = slope SB x 3 LOQ = slope SB x 10

3.6.2 Uji Presisi

Uji presisi keseksamaan ditentukan dengan parameter relatif standar deviasi RSD. Menurut Harmita 2004, rumus perhitungan standar deviasi SD: SD = 1 - n X - Xi 2 ∑ RSD = x100 X SD Keterangan : RSD = Relatif standar deviasi SD = Standar deviasi X = Kadar rata-rata dalam sampel Xi = Nilai dari setiap pengukuran n-1 = Derajat kebebasan Universitas Sumatera Utara 25

3.6.3 Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali Recovery

Uji perolehan kembali atau recovery dilakukan dengan menambahkan larutan baku Vitamin C 1000 µgml yang jumlahnya telah diketahui kedalam sampel kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada sampel. Menurut Harmita 2004, perolehan kembali atau recovery dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Recovery = A A F C C C − x 100 Keterangan : C F = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan baku C A = konsentrasi sampel awal C A = konsentrasi larutan baku yang ditambahkan

3.7 Analisis Data Secara Statistik

Kadar antioksidan yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing 6 larutan sampel, diuji secara statistik dengan uji Q. Menurut Gandjar dan Rohman 2007, nilai Q merupakan sebagai berikut: | x100 terendah nilai - tertinggi Nilai terdekat yang Nilai - dicurigai yang Nilai | Q = Hasil pengujian atau nilai Q yang diperoleh ditinjau terhadap daftar harga Q kritis pada Tabel 3.1, apabila QQ kritis maka data tersebut ditolak. Tabel 3.1. Nilai Q kritis pada Taraf Kepercayaan 95 Banyak data Nilai Q kritis 4 0,831 5 0,717 6 0,621 7 0,570 Gandjar dan Rohman, 2007 Universitas Sumatera Utara 26 Menurut Sudjana 2005, kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresidan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus: t hitumg = | n SD X Xi − | Menurut Sudjana 2005, dengan dasar penolakan apibila t hitung t tabel . Untuk menentukan kadar antioksidan di dalam sampel dengan interval kepercayaan 95, α = 0,05, dk = n-1, dapat digunakan rumus: μ = X ± t α2, dk x α SD n Keterangan : µ = interval kepercayaan X = kadar rata-rata sampel t = harga t tabel sesuai dengan dk = n-1 α = tingkat kepercayaan SD = standar deviasi n = jumlah perlakuan Universitas Sumatera Utara 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Serbuk Sekam Padi Oryza sativa

Dilakukan karakteristik serbuk sekam padi meliputi organoleptis, penetapan kadar abu, kadar abu total serta susut pengeringan.

4.1.1 Organoleptis Meliputi Bentuk, Warna dan Rasa

Dilakukan karakteristik serbuk sekam padi secara organoleptis yang meliputi bentuk, warna dan rasa. Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.1 Tabel 4.1 Hasil Organoleptis Serbuk Sekam Padi Oryza sativa Dari Tabel 4.1 dapat dilihat bahwa organoleptis serbuk sekam padi mempunyai warna putih kekuningan.

4.1.2 Karakteristik Mutu Serbuk Sekam Padi Oryza sativa

Hasil analisis meliputi penetapan kadar abu total, kadar abu yang tidak larut dalam asam dan susut pengeringan dapat dilihat pada Tabel 4.2 Tabel 4.2 Karakteristik Serbuk Sekam Padi Oryza sativa Karakteristik Rata-rata Kadar Abu Total 4,41 Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam 0,81 Susut Pengeringan 8,13 Dari Tabel 4.2 dapat dilihat bahwa karakteristik serbuk sekam padi mempunyai susut pengeringan sebesar 8,13, kadar abu total 4,41, dan Bentuk Serbuk Warna Putih Kekuningan Rasa - Universitas Sumatera Utara