Hubungan Tumor Infiltrasi Limfosit (TILS) Terhadap Respon Patologi Pada Kanker Payudara Stadium Lokal Lanjut Dengan Kemoterapi Neoadjuvant Di RSUP H.Adam Malik Medan Chapter III VI
29
BAB III
METODELOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
3.1.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Divisi Ilmu Bedah Onkologi RSUP Haji Adam Malik
bekerjasama dengan Departemen Patologi Anatomi RSUP Haji Adam Malik
Medan.
3.1.2 Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama 5 bulan, Oktober 2015 sampai dengan Maret 2016,
yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, analisa data dan penulisan.
3.2. Metode Rancangan
Rancangan penelitian ini menggunakan ancangan analitik dengan pendekatan
cross sectional. Pada penelitian ini dilakukan penilaian ulang jumlah tumor
infiltrasi limfosit serta respon patologi oleh ahli patologi RSUP H. Adam Malik
pada blok parafin yang sudah ada sebelumnya dan sudah diwarnai dengan
hematoxilin dan eosin, sebelum dan sesudah pemberian terapi kemoterapi
neoadjuvan, sampel diambil dari tahun 2011- 2015.
Universitas Sumatera Utara
3.3 KerangkaTeori
Pemberian kemoterapi neoadjuvan memberikan perubahan dinamika biomarker
dan juga perubahan parameter laboratorium yang menunjukkan adanya
peningkatan kekebalan sistemik, termasuk jumlah T-limfosit. Hal ini memberikan
kesempatan bahwa perubahan tersebut dapat dijadikan faktor prediksi dan
prognostik dalam keberhasilan terapi dan regimen. Jumlah T limfosit yang
signifikan tinggi pada pasien dengan terapi neoadjuvan memiliki respon lengkap
patologi. (Hornychova 2008; Melichar,Loi.S 2013). Dalam teorinya subpopulasi
limfosit T, limfosit, T helper, dan T sitotoksik bersama sama berperan dalam
mengeliminasi antigen tumor.
Sel yang mengandung antigen tumor bersama
MHC kelas 1 membentuk komplek T-Cell Receptor (TCR) mengaktivasi sel T
sitotoksik menghancurkan sel tumor. (Kresno, 2011). Meningkatnya TILs ini juga
berhubungan dengan tipe histology, grade tinggi tidak adanya respon hormon dan
ekspresi tinggi Ki-67 dalam hubungannya dengan respon patologi . ( Yamaguci,
2012).
30
Universitas Sumatera Utara
3.4 Kerangka Konsepsional
Alur penelitian yang akan digunakan adalah sebagai berikut
Evaluasi TILs
High
TILs
Low
TILs
Respon
Patologi
kemoterapi
Tidak
komplit
------------------------------
Komplit
Komplit
Respon
Patologi
kemoterapi
Tidak
komplit
Usia
Grading
Jenis Histologi
31
Universitas Sumatera Utara
3.5. Cara Penilaian TILS
-
-
-
-
-
TILs harus dilaporkan untuk suatu kompartemen stromal (dalam %
Stroma TILs) Penyebut yang digunakan untuk menentukan % stroma
tils adalah areastroma jaringan ( yaitu area yang digunakan oleh sel-sel
inflamasi mononuklear lebih luas stroma intratumoral ) , bukan jumlah
sel stroma ( yaitu fraksi dari jumlah inti stroma yang mewakili
mononuklear inti sel inflamasi) .
Tils harus dievaluasi dalam batas-batas tumor invasif .
Tidak termasuk tils luar perbatasan tumor dan sekitar DCIS dan lobulus
normal.
Tidak termasuk tils di zona tumor dengan artefak , nekrosis ,
hialinisasi regresif
Semua sel mononuclear (termasuk limfosit dan sel plasma harus dinilai
kecuali sel leukosit polimorfonuklear.
Satu bagian ( 4-5 m , pembesaran × 200-400 ) per pasien saat ini
dianggap cukup
Seluruh potongan lebih disenangi bila dibandingankan dengan biops
bila memungkinkan. Core dapat di gunakan pada pengaturan preterapi
neoadjuvan saat ini tidak ada metodelogi yang divalidasi untuk
mencetak nilai TILs sesudah kemoterapi neoadjuvan
Penilaian penuh dari rata rata TILs di dalam area tumor oleh ahli
patologis harus digunakan . tidak boleh focus pada hotspot.
Consensus kelompok kerja mengatakan bahwa TILs dapat
memberikaninformasi yang lebih relevansecarabiologisketika dinilai
sebagaivariabel kontinu, karena denganini memungkinkananalisis
statistikyang lebih akurat, yangnantinya dapatdikategorikan sebagai
nilai ambang batas yang berbeda beda. Namun, dalampraktek seharihari,
kebanyakan
ahli
patologi
jarangakanmelaporkanmisalnya13,5% namun dilaporkan sebagai
berikut misalnya range 5% -10%, dalam contoh inimisalnya 15%.
Patologiharus
melaporkannilai
merekasedetailmungkin
sesuai
kenyamanan mereka dalam melaporkan.
Tils harus dinilai sebagai parameter kontinu. Persentase stroma tils
adalah parameter semikuantitatif untuk penilaian ini, untuk Misalnya,
80% stroma tils berarti bahwa 80% dari area stroma menunjukkan
kepadatan infiltrasi mononuklear. Untuk penilaian nilai-nilai
persentase, Pola pertumbuhan limfosit dipisahkan dan diperhitungkan.
Limfosit biasanya tidak membentuk agregat selular padat ; karena itu,
penunjukan '100% stroma tils' masih akan memungkinkan beberapa
ruang kosong jaringan antara masing -masing limfosit
tidak Ada rekomendasi resmi untuk ambang TIL klinis yang relevan
dapat diberikan pada tahap ini. Konsensus mengatakan bahwa
metodologi yang valid saat ini lebih penting daripada masalah ambang
batas untuk penggunaan klinis. lymphocyte predominant kanker
payudara dapat digunakan sebagai istilah dalam menggambarkan untuk
tumor yang berisi 'lebih sel limfosit dibandingkan sel-sel tumor.
Namun, ambang batas bervariasi antara 50% dan 60% dari stroma
limfosit.
32
Universitas Sumatera Utara
3.6 Alur Pemeriksaan TILS
Penderita Kanker
Payudara
Tinggi
TILs
Blok Parafin Sebelum
Rendah
Kemoterapi Adjuvan
Operasi
Operasi Modified Radikal
Mastektomi (MRM)
Histopatoloi Tumor
Primer dan KGB
Respon Kemoterapi
Lanjut kemoterapi
Tidak
komplit
Komplit
33
Universitas Sumatera Utara
3.7. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian
3.7.1. Populasi
Populasi dalam penelitian adalah preparat histologik pasien penderita
kanker payudara yang diambil dari 2011-2015 di RSUP Haji Adam Malik
Medan yang memenuhi kriteria inklusi.
3.7.2. Sampel
Sampel penelitian adalah preparat histologik pasien penderita kanker
payudara yang diambil dari 2011 - 2015 di RSUP Haji Adam Malik
Medan yang memenuhi kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel
penelitian.
3.7.3. Besar Sampel Penelitian
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan
menggunakan rumus : (Sophyudin 2014)
N=
(Zà + Zß)²
²
+3
0,5In (1+r)/1-r)
Keterangan :
-
N = Jumlahpopulasi
-
Zà= Kesalahan Tipe I1,64
-
Zß = Kesalahan Tipe II 1.28
-
R = Koefisien Korelasi dipilih nilai minimal = 0,4
Hasil Perhitungan :
N=
(1.64+1,28)²
²
+3
0,5In (1+0.4)/1-0,4)
= 50,51 51 Jumlah pasien minimal
34
Universitas Sumatera Utara
3.8 Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.8.1 Kriteria Inklusi
Semua pasien stadium lokal lanjut yang ada blok parafinnya, dan
mendapat kemoterapi neoadjuvan serta telah dilakukan operasi modified
radikal mastektomi (MRM)
3.8.2. Kriteria Eksklusi
•
Data tidak lengkap
•
Preparat histology tidak dapat diperiksa
3.9. Variabel Penelitian dan Defnisi Operasional
3.9.1. Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti adalah :
- Variabel bebas adalah Tumor InfiltrasiLimfosit (TILs)
- Variabel Terikat adalah Respon Patologi.
3.9.2. Defenisi Operasional
•
Kanker payudara adalah karsinoma yang berasal dari duktus atau
lobulus payudara. (Suyatno, Emir .T 2010).
•
Stadium lokal lanjut adalah atau locally advance breast cancer
(LABC) adalah kanker payudara stadium III menurut sistem TNM dari
UICC dan AJCC; yaitu terdiridari stadium IIIA (To-T2 N2 Mo atau
T3 N1-2 Mo) dan stadium IIIB (T4 tiap N oMo). (Suyatno, Emir .T
2010).
•
Kemoterapi Neoadjuvant terapi tambahan sebelum dilakukan terapi
defenitif. (Suyatno, Emir .T 2010).
35
Universitas Sumatera Utara
•
Histopatologi jaringan merupakan teknik pemeriksaan histopatologi
berguna untuk mendeteksi adanya komponen patogen yang bersifat
infektif melalui pengamatan secara mikroanatomi.(Nyoman.B 2010).
•
Tumor InfltrasiLimfosit (TILs) adalah subset daril imfosit yaitu suatu
imun tubuh yang menysusup pada daerah tumor sebagai responi
munbaik pro atau punanti tumor. (Dankert, 2010).
•
Penilaian TILs adalah berdasarkan rekomendasi dari para peneliti
tentang penilaian TILs pada Desember 2013. Sistem penilaian dengan
pewarnaan Hematoksilin dan eosin, kemudian dibacakan stroma TILs
dan Intratumoral TILs oleh ahli patologi dan dipresentasikan dalam
persentase,
TIls dikategorikan menjadi:
1. Tinggi TILs (High TILs) dengan nilai stroma TILs dan
intratumoral TILs ≥50%
2. Rendah TILs ( Low TILs)dengan kategori nilai stroma TILs dan
intra tumoral TILs 1 dan rentang interval kepercayaan tidak melewati angka 1
( confident interval tidak mencakup 1), berarti variabel tersebut
merupakan faktor risiko meningkatnya respon patologi
37
Universitas Sumatera Utara
-
PR
BAB III
METODELOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
3.1.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Divisi Ilmu Bedah Onkologi RSUP Haji Adam Malik
bekerjasama dengan Departemen Patologi Anatomi RSUP Haji Adam Malik
Medan.
3.1.2 Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama 5 bulan, Oktober 2015 sampai dengan Maret 2016,
yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, analisa data dan penulisan.
3.2. Metode Rancangan
Rancangan penelitian ini menggunakan ancangan analitik dengan pendekatan
cross sectional. Pada penelitian ini dilakukan penilaian ulang jumlah tumor
infiltrasi limfosit serta respon patologi oleh ahli patologi RSUP H. Adam Malik
pada blok parafin yang sudah ada sebelumnya dan sudah diwarnai dengan
hematoxilin dan eosin, sebelum dan sesudah pemberian terapi kemoterapi
neoadjuvan, sampel diambil dari tahun 2011- 2015.
Universitas Sumatera Utara
3.3 KerangkaTeori
Pemberian kemoterapi neoadjuvan memberikan perubahan dinamika biomarker
dan juga perubahan parameter laboratorium yang menunjukkan adanya
peningkatan kekebalan sistemik, termasuk jumlah T-limfosit. Hal ini memberikan
kesempatan bahwa perubahan tersebut dapat dijadikan faktor prediksi dan
prognostik dalam keberhasilan terapi dan regimen. Jumlah T limfosit yang
signifikan tinggi pada pasien dengan terapi neoadjuvan memiliki respon lengkap
patologi. (Hornychova 2008; Melichar,Loi.S 2013). Dalam teorinya subpopulasi
limfosit T, limfosit, T helper, dan T sitotoksik bersama sama berperan dalam
mengeliminasi antigen tumor.
Sel yang mengandung antigen tumor bersama
MHC kelas 1 membentuk komplek T-Cell Receptor (TCR) mengaktivasi sel T
sitotoksik menghancurkan sel tumor. (Kresno, 2011). Meningkatnya TILs ini juga
berhubungan dengan tipe histology, grade tinggi tidak adanya respon hormon dan
ekspresi tinggi Ki-67 dalam hubungannya dengan respon patologi . ( Yamaguci,
2012).
30
Universitas Sumatera Utara
3.4 Kerangka Konsepsional
Alur penelitian yang akan digunakan adalah sebagai berikut
Evaluasi TILs
High
TILs
Low
TILs
Respon
Patologi
kemoterapi
Tidak
komplit
------------------------------
Komplit
Komplit
Respon
Patologi
kemoterapi
Tidak
komplit
Usia
Grading
Jenis Histologi
31
Universitas Sumatera Utara
3.5. Cara Penilaian TILS
-
-
-
-
-
TILs harus dilaporkan untuk suatu kompartemen stromal (dalam %
Stroma TILs) Penyebut yang digunakan untuk menentukan % stroma
tils adalah areastroma jaringan ( yaitu area yang digunakan oleh sel-sel
inflamasi mononuklear lebih luas stroma intratumoral ) , bukan jumlah
sel stroma ( yaitu fraksi dari jumlah inti stroma yang mewakili
mononuklear inti sel inflamasi) .
Tils harus dievaluasi dalam batas-batas tumor invasif .
Tidak termasuk tils luar perbatasan tumor dan sekitar DCIS dan lobulus
normal.
Tidak termasuk tils di zona tumor dengan artefak , nekrosis ,
hialinisasi regresif
Semua sel mononuclear (termasuk limfosit dan sel plasma harus dinilai
kecuali sel leukosit polimorfonuklear.
Satu bagian ( 4-5 m , pembesaran × 200-400 ) per pasien saat ini
dianggap cukup
Seluruh potongan lebih disenangi bila dibandingankan dengan biops
bila memungkinkan. Core dapat di gunakan pada pengaturan preterapi
neoadjuvan saat ini tidak ada metodelogi yang divalidasi untuk
mencetak nilai TILs sesudah kemoterapi neoadjuvan
Penilaian penuh dari rata rata TILs di dalam area tumor oleh ahli
patologis harus digunakan . tidak boleh focus pada hotspot.
Consensus kelompok kerja mengatakan bahwa TILs dapat
memberikaninformasi yang lebih relevansecarabiologisketika dinilai
sebagaivariabel kontinu, karena denganini memungkinkananalisis
statistikyang lebih akurat, yangnantinya dapatdikategorikan sebagai
nilai ambang batas yang berbeda beda. Namun, dalampraktek seharihari,
kebanyakan
ahli
patologi
jarangakanmelaporkanmisalnya13,5% namun dilaporkan sebagai
berikut misalnya range 5% -10%, dalam contoh inimisalnya 15%.
Patologiharus
melaporkannilai
merekasedetailmungkin
sesuai
kenyamanan mereka dalam melaporkan.
Tils harus dinilai sebagai parameter kontinu. Persentase stroma tils
adalah parameter semikuantitatif untuk penilaian ini, untuk Misalnya,
80% stroma tils berarti bahwa 80% dari area stroma menunjukkan
kepadatan infiltrasi mononuklear. Untuk penilaian nilai-nilai
persentase, Pola pertumbuhan limfosit dipisahkan dan diperhitungkan.
Limfosit biasanya tidak membentuk agregat selular padat ; karena itu,
penunjukan '100% stroma tils' masih akan memungkinkan beberapa
ruang kosong jaringan antara masing -masing limfosit
tidak Ada rekomendasi resmi untuk ambang TIL klinis yang relevan
dapat diberikan pada tahap ini. Konsensus mengatakan bahwa
metodologi yang valid saat ini lebih penting daripada masalah ambang
batas untuk penggunaan klinis. lymphocyte predominant kanker
payudara dapat digunakan sebagai istilah dalam menggambarkan untuk
tumor yang berisi 'lebih sel limfosit dibandingkan sel-sel tumor.
Namun, ambang batas bervariasi antara 50% dan 60% dari stroma
limfosit.
32
Universitas Sumatera Utara
3.6 Alur Pemeriksaan TILS
Penderita Kanker
Payudara
Tinggi
TILs
Blok Parafin Sebelum
Rendah
Kemoterapi Adjuvan
Operasi
Operasi Modified Radikal
Mastektomi (MRM)
Histopatoloi Tumor
Primer dan KGB
Respon Kemoterapi
Lanjut kemoterapi
Tidak
komplit
Komplit
33
Universitas Sumatera Utara
3.7. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian
3.7.1. Populasi
Populasi dalam penelitian adalah preparat histologik pasien penderita
kanker payudara yang diambil dari 2011-2015 di RSUP Haji Adam Malik
Medan yang memenuhi kriteria inklusi.
3.7.2. Sampel
Sampel penelitian adalah preparat histologik pasien penderita kanker
payudara yang diambil dari 2011 - 2015 di RSUP Haji Adam Malik
Medan yang memenuhi kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel
penelitian.
3.7.3. Besar Sampel Penelitian
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan
menggunakan rumus : (Sophyudin 2014)
N=
(Zà + Zß)²
²
+3
0,5In (1+r)/1-r)
Keterangan :
-
N = Jumlahpopulasi
-
Zà= Kesalahan Tipe I1,64
-
Zß = Kesalahan Tipe II 1.28
-
R = Koefisien Korelasi dipilih nilai minimal = 0,4
Hasil Perhitungan :
N=
(1.64+1,28)²
²
+3
0,5In (1+0.4)/1-0,4)
= 50,51 51 Jumlah pasien minimal
34
Universitas Sumatera Utara
3.8 Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.8.1 Kriteria Inklusi
Semua pasien stadium lokal lanjut yang ada blok parafinnya, dan
mendapat kemoterapi neoadjuvan serta telah dilakukan operasi modified
radikal mastektomi (MRM)
3.8.2. Kriteria Eksklusi
•
Data tidak lengkap
•
Preparat histology tidak dapat diperiksa
3.9. Variabel Penelitian dan Defnisi Operasional
3.9.1. Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti adalah :
- Variabel bebas adalah Tumor InfiltrasiLimfosit (TILs)
- Variabel Terikat adalah Respon Patologi.
3.9.2. Defenisi Operasional
•
Kanker payudara adalah karsinoma yang berasal dari duktus atau
lobulus payudara. (Suyatno, Emir .T 2010).
•
Stadium lokal lanjut adalah atau locally advance breast cancer
(LABC) adalah kanker payudara stadium III menurut sistem TNM dari
UICC dan AJCC; yaitu terdiridari stadium IIIA (To-T2 N2 Mo atau
T3 N1-2 Mo) dan stadium IIIB (T4 tiap N oMo). (Suyatno, Emir .T
2010).
•
Kemoterapi Neoadjuvant terapi tambahan sebelum dilakukan terapi
defenitif. (Suyatno, Emir .T 2010).
35
Universitas Sumatera Utara
•
Histopatologi jaringan merupakan teknik pemeriksaan histopatologi
berguna untuk mendeteksi adanya komponen patogen yang bersifat
infektif melalui pengamatan secara mikroanatomi.(Nyoman.B 2010).
•
Tumor InfltrasiLimfosit (TILs) adalah subset daril imfosit yaitu suatu
imun tubuh yang menysusup pada daerah tumor sebagai responi
munbaik pro atau punanti tumor. (Dankert, 2010).
•
Penilaian TILs adalah berdasarkan rekomendasi dari para peneliti
tentang penilaian TILs pada Desember 2013. Sistem penilaian dengan
pewarnaan Hematoksilin dan eosin, kemudian dibacakan stroma TILs
dan Intratumoral TILs oleh ahli patologi dan dipresentasikan dalam
persentase,
TIls dikategorikan menjadi:
1. Tinggi TILs (High TILs) dengan nilai stroma TILs dan
intratumoral TILs ≥50%
2. Rendah TILs ( Low TILs)dengan kategori nilai stroma TILs dan
intra tumoral TILs 1 dan rentang interval kepercayaan tidak melewati angka 1
( confident interval tidak mencakup 1), berarti variabel tersebut
merupakan faktor risiko meningkatnya respon patologi
37
Universitas Sumatera Utara
-
PR