Untitled Document

MIKROBIOLOGI UMUM

SKS : 3 ( 2 – 3 )

Deskripsi Matakuliah :

Mempelajari sejarah mikrobiologi, struktur mikroorganisme, penggolongan dan karakteristik umum mikroorganisme, nutrisi, metabolisme, genetik dan mikroskopi. Sifat-sifat virus, bakteri , kapang, kamir, protozoa dan parasit. Perkembangan mikrobiologi dalam hubungannya dengan pertanian, lingkungan, kesehatan dan bioteknologi.

OUTLINE PERKULIAHAN

1. Pedahuluan, membahas sejarah dan perkembangan mikrobiologi, kedudukan mikroorganisme di alam, sel dan strukturnya, sel prokariotik dan sel eukariotik, dan mikroskop.

2. Biosintesa makromolekul, metabolisme energi, genetika mikroorganisme dan pertumbuhan mikroorganisme

3. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan, sterilisasi dan desinfeksi 4. Bakteri : Struktur sel bakteri, pewarnaan bakteri, klasifikasi dan identifikasi,dan

pertumbuhan bakteri.

5. Kapang : Sifat-sifat dan fisiologi kapang, klassifikasi kapang, penggunaan kapang dalam industri.

6. Kamir : Morfologi kamir, sistem reproduksi kamir, sifat-safat fisiologi kamir dan penggunaan kamir dalam industri pangan.

7. Virus : Penyebaran dal struktur, virus bakteri ( bakteriofag ), multiplikasi fag virulen ( siklus litik ), perkembangan fag temperenter ( lisogeni ).

PENDAHULUAN

Mikrobiologi adalah suatu ilmu yang mempelajari kehidupan makhluk hidup yang bersifat mikroskopik yang disebut mikroorganisme atau jasad renik, yaitu makhluk yang mempunyai ukuran sangat kecil dimana setiap selnya hanya dapat dilihat dengan pertolongan mikroskop. Mikrobiologi merupakan salah satu cabang ilmu dalam biologi. Banyak cabang ilmu lain yang bersifat terapan yang memerlukan pengetahuan dasar mikrobiologi. Pada saat ini dengan kemajuan yang pesat dalam ilmu dan teknologi, terutama dalam era laju pengetahuan bioteknologi, mikrobiologi yang bersifat dasar sangat diperlukan sebagai ilmu penunjang.

Mikrobiologi seperti juga ilmu pengetahuan lainnya diawali oleh rasa ingin tahu mengenai sifat serta aktivitas mikroorganisme. Pada mulanya mikroorganisme dianggap tidak perlu dipelajari oleh karena ukurannya sangat kecil.

Dalam teknologi pangan, mikrobiologi merupakan ilmu yang sangat penting, misalnya dalam hubungannya dengan kerusakan atau kebusukan makanan, sehingga dapat diketahui tindakan pencegahan atau pengawetan yang paling tepat untuk menghindari terjadinya kerusakan tersebut. Disamping itu mikrobiologi juga penting dalam fermentasi makanan, sanitasi, pengawasan mutu pangan, dan sebagainya. Adanya mikroorganisme dalam makanan mungkin tidak diingikan jika mikroorganisme tersebut dapat menyebabkan keracunan bagi yang mengkonsumsinya. Tetapi dalam fermentasi makanan dan minuman, pertumbuhan mikroorganisme justri dirangsang untuk mengubah komponen-komponen di dalam bahan pangan tersebut menjadi produk-produk yang diinginkan.

Sejarah mikrobiologi dimulai tahun 1674 ketika Anton van Leewenhoek (1632 – 1723 ) menemukan adanya kehidupan dalam setetes air air danau yang diamati dengan menggunakan lensa gelas . Benda-benda yang diamati tersebut disebut dengan

animalculs terlihat dalam berbagai bentuk, ukuran dan warna. Leweenhoek kemudian mengamati adanya makhluk hidup pada berbagai lainnya menggunakan mikroskop sederhana yang diciptakannya, dan menyimpulkan bahwa sel-sel hidup selalu berasal dari benih ( germ ).

Pada mulanya penyakit diperkirakan disebabkan oleh bencana alam seperti banjir atau gempa bumi . Penelitian Pasteur yang melibatkan mikroorganisme dalam proses fermentasi dan pembusukan mengilhami seorang ahli bedah Inggris yaitu Lister. Pengaruh Pasteur terlihat dari tata cara Lister dalam proses pembedahan, yang kemudian dikenal dengan teknik aseptik, yaitu, strelisasi panas dari alat bedah, penggunaan asam karbol ( fenol ) pada bekas luka.

SEL PROKARIOT DAN EUKARIOT

Makhluk hidup dapat dibedakan atas tiga kategori yaitu , tanaman, hewan dan protista. Pada tanaman dan hewan setiap sel tidak dapat berfungsi secara terpisah tetapi merupakan unit terkecil dari suatu organisme multiselluler. Yang termasuk organisme protista adalah semua makhluk hidup yang tidak tergolong hewan dan tumbuhan, yang dapat dibedakan atas dua kelompok yaitu, protista tingkat rendah atau prokariot, dan protista tingkat tinggi atau eukariot. Organisme yang tergolong dalam prokariot dan eukariot adalah sebagai berikut :

1. Protista rendah ( prokariot ) Bakteri

Riickettsia da Chlamydia Mikoplasma

Ganggang biru-hijau 2. Protista tinggi ( eukariotik )

Fungi (kapang, kamir, jamur ) Ganggang

Protozoa

Virus tidak digolongkan ke dalam salah satu kelompok di atas karena tidak mempunyai ciri-ciri yang dapat dikategorikan sebagai sel pada umumnya. Suatu partikel virus merupakan struktur yang bersifat statis, stabil, dan tidak dapat melakukan metabolisme maupun biosintesa. Virus baru dapat digunakan sebagai makhluk hidup jika terdapat di dalam sel organisme inang tersebut yang melakukan proses metabolisme yang diperlukan virus untuk memperbanyak diri. Dalam keadaan ini virus digolongkan dalam kelompok protista.

Mikroorganisme yang penting dalam mikrobiologi pangan adalah yang tergolong dalam bakteri, kapang dan kamir.

Perbedaan sel prokariot dan eukariot

Perbedaan penting antara sel prokariot dan eukariot adalah dalam struktur inti selnya. Kata eukariot berasal dari bahasa Latin eu yang bereti sejati, dan karyo, yaitu keseluruhan inti sel. Oleh karena itu sel yang tergolong eukariot mempunyai inti sel ( nukleus ) yang dikelilingi membran inti dimana di dalamnya terdapat kromosom yang mengandung komponen keturunan. Sbaliknya sel prokariot tidak mempunyai inti sel sejati, dan komponen keturunannya terdapat di dalam molekul DNA tunggal atau kromosom yang letaknya bebas di dalam sitoplasma.

MIKROSKOP

Mikroskop pertama sekali ditemukan oleh Antony van Leewenhoek pada tahun 1675, dan juga merupakan orang yang pertama sekali melihat bakteri dengan menggunakan alat ini. Sebelum penemuan Leeuwenhoek sebenarnya telah ada beberapa ilmuwan yang menemukan sistem pembesaran, diantaranya Rogen Bacon ( 1214 – 1294 ) yang pertama kali membuat lensa sederhana untuk melihat benda-benda yang berukuran kecil, dan juga ada beberapa peneliti lain.

Mikroskop dapat dibedakan atas beberapa jenis, tetapi mekanisme bekerjanya pada prinsipnya sama, yaitu terdiri dari, sistem optik atau sistem perbesaran, dan sistem iluminasi yang menyebabkan terlihatnya suatu objek.

METABOLISME ENERGI

Seperti halnya organisme lain, mikroorganisme memerlukan energi untuk kelangsungan hidupnya. Energi diperlukan oleh mikroorganisme untuk berbagai kegiatan, yaitu: 1. mempertahankan kehidupan sel, 2. pertumbuhan dan perkembang biakan sel, 3. untuk pergerakan pada mikroorganisme yang bersifat motil.

Sumber energi

Berdasarkan sumber energi yang digunakan mikroorganisme dapat dibedakan atas dua grup yaitu :

1. Organisme fototrof, yaitu organisme yang menggunakan sinar matahari untuk menghasilkan energi . Berdasarkan sumber karbon yang digunakan, organisme fototrof dibedakan lagi sebagai berikut :

 Organisme fotoototrof, yaitu mikroorganisme yang sumber energi dari matahari dan sumber karbon dari CO2 , contoh tanaman

 Organisme fotoheterotrof, yaitu mikroorganisme yang sumber energi dari matahari dan sumber karbon dari senyawa-senyawa organik, contoh ganggang hijau biru

2. Organisme kimotrof, yaitu organisme yang menggunakan senyawa kimia untuk menghasilkan energi. Berdasarkan sumber karbon yang digunakan, organisme kimotrof dapat dibedakan lagi sebagai berikut :

 Organisme kimoototrof, yaitu organisme yang menggunakan senyawa kimia sebagai sumber energi dan CO2 sebagai sumber karbon.

 Organisme kimoheterotrof , yaitu organisme yang menggunakan senyawa kimia sebagai sumber energi dan senyawa organik sebagai sumber karbon, contoh hewan, protozoa, fungi, bakteri.

Reaksi respirasi dan fermentasi adalah reaksi yang menunjukkan perbedaan dalam aseptor hidrogen ( penerima elektron ). Respirasi adalah reaksi oksidasi yang menggunakan senyawa anorganik sebagai oksidan ( penerima elektron ), sedangkan fermentasi adalah reaksi oksidasi yang menggunakan senyawa organik baik sebagai oksidan maupun sebagai reduktan ( donor elekteron ). Mikroorganisme yang biasanya tumbuh dalam makanan adalah umumnya bersifat kimoorganotrof, dimana sebagai sumber energi dan sumber karbon digunakan senyawa organik.

Respirasi

Respirasi adalah reaksi yang menggunakan senyawa anorganik dan senyawa organik sebagai donor elektron dan senyawa anorganik sebagai aseptor elektron. Respirasi yang menggunakan oksigen sebagai penerima elektron disebur sebagai respirasi aerobik , sedangkan yang menggunakan senyawa anorganik sebagai penerima elektron disebut respirasi anaerobik.

Fermetasi

Fermentasi sering didefenisikan sebagai proses pemecahan karbohidrat dan asam amino secara anaerobik, yaitu tanpa memerlukan oksigen. Senyawa yang dapat dipecah dalam proses fermentasi terutama adalah karbohidrat, sedangkan asam amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa jenis bakteri tertentu.

Fermentasi karbohidrat

Karbohidrat merupakan substrat utama yang dipecah dalam proses fermentasi. Polisakarida terlebih dahulu dipecah menjadi gula-gula sederhana sebelumdifermentasi, misalnya hidrolisa pati menjadi unit – unit glukosa. Glukosa kemudian dipecah menjadi senyawa lain tergantung dari jenis fermentasinya.

Pada bakteri paling sedikit terdapat tujuh proses fermentasi yang berbeda terhadap glukosa. Masing-masing proses menghasilkan produk-produk yang berbeda, dan masing-masing spesifik terhadap grup bakteri tertentu.

Fermentasi glukosa pada prinsipnya terdiri dari dua tahap yaitu:

1. Pemecahan rantai karbon dari glukosa dan pelepasan paling sedikit dua pasang atom hidrogen, menghasilkan senyawa karbon lainnya yang lebih teroksidasi daripada glukosa.

2. Senyawa yang teroksidasi tersebut direduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan tahap pertama, membentuk senyawa lain sebagai hasil fermentasi. Reaksi oksidasi tidak dapat berlangsung tanpa reaksi reduksi yang seimbang, oleh karena itu jumlah atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama fermentasi selalu seimbang dengan jumlah yang digunakan tahap kedua.

Dalam tahap pertama fermentasi glukosa selalu terbentu asam piruvat. Pada mikroorganisme dikenal paling sedikit empat jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat, yaitu ;

1. Jalur Embden- Meyerhof_Parnas ( EMP ) atau glikolisa, ditemukan pada fungi dan kebanyakan bakteri, serta pada hewan dan manusia.

2. Jalur Entner-Duodoroff ( ED ), hanya ditemukan pada beberapa bakteri. 3. Jalur Heksosamonofosfat ( HMF ) , ditemukan pada berbagai organisme

4. Jalur Fosfoketolase ( FK ) , hanya ditemukan pada bakteri yang tergolong

BIOSINTESA MAKROMOLEKUL

Mikroorganisme yang memegang peranan penting dalam mikrobiologi pangan terutama adalah yang tergolong kimoorganotrof, karena mikroorganisme tersebut menggunakan senyawa organik yang terdapat di dalam bahan pangan. Beberapa bakteri patogen bahkan tidak dapat mensintesa vitamin, purin maupun pirimidin sehingga harus memperoleh unsur-unsur tersebut dari substrat atau bahan pangan tempat tubuhnya. Untuk menumbuhkan bakteri patogen tersebut di dalam medium laboratorium, kedalam medium harus ditambahkan bahan-bahan yang mengandung unsur-unsur tersebut, misalnya darah, ekstrak sapi, atau ekstrak kamir.

Komposisi makromolekul

Sel mikroorganisme mengandung senyawa-senyawa penyusun sel seperti protein, asam nukleat, karbohidrat dan sebagainya. Komponen yang terbanyak jumlahnya adalah air, yaitu mencapai kira-kira 70% pada sel bakteri atau mungkin lebih tinggi. Kira-kira setengah dari bagian padatan sel atau Kira-kira-Kira-kira 15% dari berat sel adalah protein. Sebagian dari protein tersebut merupakan enzim, yaitu biokatalis yang berperan dalam metabolisme energi dan biosintesa.

Senyawa-senyawa makromolekul di dalam sel pada umumnya berupa polimer yang terdiri dari unit-unit yang lebih kecil, dimana unit-unit tersebut terbentuk dari unsur-unsur yang diperoleh dari katabolisme senyawa-senyawa yang terdapat di dalam substrat tempat tumbuhnya

Proses biosintesa makromolekul pada prinsipnya terdiri dari dua tahap utama, yaitu :

1. Biosintesa unit-unit makromolekul seperti asam amino, asam lemak, gula (monosakarida), nukleosida dan nukleotida, menggunakan ATP dan senyawa tereduksi yaitu NADH2 atau NADPH2 yang diproduksi dalam proses

katabolisme.

2. Biosintesa makromolekul dari unit-unit monomer, menghasilkan makromolekul seperti protein, lemak, polisakarida dan asam nukleat. Dalam tahap kedua ini masih dibuthkan energi dalam bentuk ATP dan senyawa tereduksi yaitu NADH2

atau NADPH2.

Genetika mikroorganisme

Sifat-sifat yang terdapat pada mikroorganisme dipengaruhi oleh dua faktor yaitu :

1. Faktor genetika yang dipengaruhi oleh sifat-sifat gennya 2. Faktor lingkungan disekitar tempat hidupnya.

Sifat-sifat mikroorganisme yang disebabkan oleh sifat-sifat gen yang terdapat di dalam kromosom (genom) disebut genotip, sedangkan sifat-sifat yang timbul karena pengaruh lingkungan disebut fenotipe.

Variasi genetika yang timbul di dalam mikroorganisme dapat disebabkan mutasi. Mutasi adalah perubahan di dalam gen yang berakibat perubahan morfologi dan

biokimia di dalam sel. Mutasi pada sel mikroorganisme dapat terjadi secara spontan atau dengan pemberian suatu gen yaitu komponen yang bersifat mutagenik.

Mutasi dapat menyebabkan perubahan sifat-sifat dan morfologi mikroorganisme, misalnya pembentukan kapsul, flagella, ukuran sel, kemampuan untuk membentuk spora, pembentukan pigmen, pergerakan (motilitas), sifat-sifat biokimia, sifat antigenik, kemampuan memproduksi toksin, dan ketahanan terhadap obat dan virus. Pemindahan DNA pada bakteri

Bakteri mempunyai beberapa cara untuk memindahkan DNA yang berakibat terjadinya rekombinasi genetika antara satu sel dengan sel lainnya. Karena mekanisme pemindahan DNA yang unik ini, sel bakteri banyak digunakan dalam penelitian genetika molekuler. Proses pemindahan DNA pada bakteri dapat dilakukan melalui satu atau dua cara daru tiga cara sebagai berikut : transformasi, transduksi, dan konjugasi.

Transformasi

Transformasi adalah pemindahan sifat-sifat dari satu mikroorganisme ke mikroorganisme lainnya melalui bagian-bagian DNA tertentu dari mikroorganisme yang pertama.

Transduksi

Transduksi adalah pemindahan DNA dari satu bakteri ke bakteri lainnya dengan pertolongan virus yang disebut temperate phage. Beberapa sifat biokimia dan antigenik dapat dipindahkan melalui transduksi diantara galur-galur bakteri yang terdekat. Sebagai contoh ketahanan terhadap berbagai obat atau antibiotik pada stapilokoki dapat dipindahkan melalui transduksi.

Konyugasi

Beberapa bakteri termasuk Escherichia coli dan bakteri enterik gram negatif mempunyai struktur genetika yang melakukan replikasi dan berfungsi tanpa tergantung pada kromosoma. Struktur ini disebut plasmid dan dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lainnya melalui konyugasi atau transduksi. Plasmid bukan merupakan struktur yang harus ada di dalam sel, dan kadang-kadang dapat hilang selama pertumbuhan.

Selama konyugasi, plasmid dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lainnya melalui suatu pilus yang disebut pilus seks atau pilus F. Plasmid yang dipindahkan dengan cara ini mempunyai gen yang dapat memulai pembentukan pilus dan terdiri dari beberapa plasmid yang disebut plasmid kesuburan (F), plasmid kolisinokogenik (Kol) dan plasmid pembawa sifat ketahanan terhadap antibiotik (R).

Pertumbuhan bakteri

Pertumbuhan di seringkali dinyatakan secara singkat sebagai kemampuan untuk menghasilkan 2 sel baru dan hidup. Sel dinyatakan hidup bila menghasilkan sel baru.

Bakteri berkembang biak dengan cara pembelahan diri yang disebut pembelahan biner, yaitu perkembangan biak dari 1 sel induk menjadi 2 sel anak. Bakteri

yang tidak memiliki dinding sel seperti Mycoplasma berkembang biak secara aseksual melalui pertunasan (budding).

Siklus Pertumbuhan Sel

Pertumbuhan sel prokariot berjalsn secara geometrik. Ini berarti bahwa pembelahan sel terlihat sebagai berikut :

1----2----4----8----16----32----64----128----256----n 20_---21_---22_---23_---24_----25_---26_---27_---28_---2n

Oleh karena jumlah sel merupakan fungsi dari 2, maka akan lebih baik bila pertumbuhan sel digambarkan dengan sumbu Y dalam skala log. Jika kemudian sumbu X adalah waktu yang diperlukan untuk menghasilkan jumlah sel, maka akan dihasilkan suatu garis lurus.

Kurva pertumbuhan bakteri

Jika bakteri dipindahkan ke dalam biakan kaldu segar maka pertumbuhan bakteri memperlihatkan ciri seperti terlihat pada gambar berikut.

Fase adaptasi

Kurun waktu ini merupakan penyesuaian bakteri ke suatu lingkungan baru. Pada fase ini tidak ada kenaikan jumlah sel, melainkan peningkatan ukuran atau besar sel. Peningkatan juga terlihat pada protein sel, DNA, dan metabolisme.

Peningkatan metabolisme ini penting bagi penyesuaian sel bakteri yang harus menyesuaikan diri dengan pH atau kekeuatan megoksidasi reduksikan media biakan. Lamanya fase ini bervariasi, dapat cepat atau lambat tergantung dari kecepatan penyesuaian diri dengan lingkungan sekitarnya.

Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain: 1. Medium dan lingkungan pertumbuhan

2. Jumlah inokulum. Jumlah sel awal yang semakin tinggi akan mempercepat fase adaptasi

Fase pertumbuhan awal

Setelah mengalami fase adaptasi, sel mulai membelah dengan kecepatan yang masih rendah karena baru selesai tahap penyesuaian diri

Fase pertumbuhan logaritmik

Pada fase ini sel membelah dengan kecepatan yang konstan, dimana pertambahan jumlahnya mengikuti pertumbuhan logaritmik. Pada fase ini pertumbuhan sangat dipengaruhi medium tempat tumbuhnya seperti pH dan kandungan nutrien, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini sel membutuhkan energi lebih banyak dibandingkan dengan fase lainnya, selain itu sel sensitif terhadap keadaan lingkungan.

Fase pertumbuhan lambat

Pada fase ini pertumbuhan populasi mikroorganisme diperlambat karena beberapa sebab, misalnya :

1. zat nutrisi di dalam medium sudah sangat berkurang

2. adanya hasil-hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada fase ini pertumbuhan sel tidak stabil, tetapi jumlah populasi masih naik karena jumlah sel yang tumbuh masih lebih banyak daripada jumlah sel yang mati

Fase pertumbuhan tetap (statis)

Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini menjadi lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah mulai habis. Karena kekurangan zat nutrisi sel kemungkinan mempunyai komposisi yang berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritmik. Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrim seperti panas, dingin, radiasi dan bahan kimia.

Fase menuju kematian dan fase kematian

Pada fase ini sebahagian populasi mikroorganisme mulai mengalami kematian karena beberapa sebab yaitu:

1. nutrien di dalam medium sudah habis 2. energi cadangan di dalam sel habis

Jumlah sel yang mati semakin lama akan semakin banyak, dan kecepatan kematian dipengaruhi kondisi nutrien, lingkungan, dan jenis mikroorganisme.

Nutrien mikroorganisme

Pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari tersedianya air. Bahan-bahan yang terlarut dalam air, yang digunakan mikroorganisme untuk membentuk bahan sel dan memperoleh energi adalah bahan makanan. Tuntutan berbagai mikroorganisme yang menyangkut susunan larutan makanan dan persyaratan lingkungan tertentu sangat berbeda-beda. Oleh karena itu diperkenalkan banyak resep untuk membuat media biak untuk mikroorganisme. Pada dasarnya sesuatu larutan biak sekurang-kurangnya harus tersedia semua unsur yang ikut serta pada pembentukan bahan sel dalam bentuk berbagai senyawa yang dapat diolah.

Kebutuhan nutrien pokok

Melihat susunan kimia sel, unsur-unsur dapat dibedakan dalam dua kelompok, yaitu 10 unsur makro, karbon, oksigen hidrogen, nitrogen, belerang, fosfor, kalium, kalsium, magnesium, besi (C, O, H, N,S, P, K, Ca, Mg, Fe) yang terkandung dalam semua organisme dan unsur-unsur mikro atau unsur-unsur yang dibutuhkan dalam jumlah kecil seperti mangan, molibden, seng, tembaga, kobalt, nikel, vanadium, brom, khlor, natrium, selenium, silika, wolfram dan lain-lain yang tidak diperlukan semua organisme. Sebagian besar unsur ditambahkan ke dalam medium dalam bentuk garam.

Sumber-sumber karbon dan energi

Bila energi berasal dari bahan kimia maka organisme bersifat kemotrofik, sedangkan bila energi berasal dari sinar cahaya disebut fototrofik. Bila CO2 digunakan

sebagai satu-satunya sumber karbon maka organisme disebut ototrofik. Bila sumber karbon adalah senyawa organik disebut heterotrofik

Zat-zat pelengkap

Beberapa organisme membutuhkan zat-zat tertentu disamping mineral-mineral, sumber-sumber karbon dan energi untuk makanannya, yang disebut dengan zat pelengkap atau suplemen. Ini menyangkut zat-zat yang termasuk komponen dasar sel dan yang oleh beberapa mikroorganisme yang tidak dapat disintesa dari komponen-komponen sederhana. Termasuk dalam kelompok ini antara lain adalah : asam-asam amino, senyawa purin, senyawa pirimidin dan vitamin-vitamin. Senyawa purin, senyawa pirimidin dan asam amino merupakan bahagian dari protein dan asam nukleat dan oleh sel diperlukan dalam jumlah yang sesuai, sebaliknya vitamin-vitamin merupakan bagian dari koenzim-koenzim dan gugus prostetik, jadi merupakan bagian dari fungsi enzimatik katalitik dan digunakan dalam jumlah kecil.

Pembiakan bakteri dalam laboratorium

Bila suatu media diketahui komposisi medianya secara terinci, maka media tersebut disebut media sintetik. Mikroorganisme ototrof dapat tumbuh dalam medium sederhana, oleh karena mikroba ini mempunyai kemampuan untuk mensintesis bahan anorganik menjadi, protein, asam nukleat, lipidadan lipida dan vitamin, serta kompleks organik lainnya.

Untuk bakteri heterotrof, biasanya digunakan media non sintetik. Seringkali digunakan bahan mentah seperti pepton, ekstrak daging, ekstrak ragi, sehingga media tersebut dapat digunakan oleh berbagai bakteri. Sebagai bahan pemadat agar ditambahkan. Media non sintetik menggunakan bahan kaya akan zat hara yang tidak diketahui kandungannya dengan pasti.

 Ekstrak daging : Mengandung karbohidrat, senyawa organik nitrogen dan vitamin

 Ekstrak ragi : sumber vitamin B, senyawa organik nitrogen dan karbon

 Pepton : Sumber utama senyawa organik nitrogen, vitamin, karbohidrat. Perlakuan digesti protein adalah dengan asam atau enzim

 Agar : kompleks karbohidrat yang diperoleh dari ganggang laut. Digunakan sebagai bahan pemadat, mengeras pada suhu 450_{C. Agar bukan merupakan sumber hara.}

Jenis Media

1. Media diferensial

Merupakan media yang menunjang kehidupan beberapa bakteri dan juga dapat membedakan berbagai kelompok bakteri. Sebagai contoh agar darah merupakan media difrensial untuk mengetahui sifat lisis dari eritrosit. Media ini menunjang pertumbuhan berbagai bakteri. Lisis eritrosit ini merupakan ciri bakteri tertentu. Pola lisis eritrosi juga digunakan untuk difrensiasi bakteri.

Selain darah digunakan, digunakan berbagai petunjuk pH (pH indikator) sebagai pembeda, contoh biru bromtimol, merah fenol, merah netral.

2. Media selektif

Media ini menghambat pertumbuhan bakteri tertentu dan juga memungkinkan pertumbuhan bakteri tertentu. Sebagai bahan penghambat digunakan :

 Kristal violet, eosin Y, biru metilen dan brilliant green yang akan menghambat bakteri Gram positip

 Garam empedu

 pH : Sabraud agar dengan pH5.6 khusus digunakan untuk fungi

 penambahan antibiotik, sikloheksimida, kanamisin, neomisin. 3. Media selektif dan diferensial

Media ini bersifat selektif dan diffrensial, biasanya digunakan untuk identifikasi.

4. Media untuk bakteri Anaerob

Seberapa bahan kimia dapat ditambahkan ke dalam media untuk mengurangi kandungan oksigen dengan cara pengikatan secara kimia, bahan tersebut adalah :

 Na thioglikolat

 Cystein

 Asam askorbat

Salah satu indikator anaerobik adalah resazurin. Bila terjadi oksidasi (aerob) maka akan terjadi warna merah.

5. Media penyubur

Media ini akan mempercepat pertumbuhan organisme tertentu. Cara ini digunakan bila diinginkan salah satu organisme tertentu dari suatu biakan campuran bakteri. Pada umumnya media ini menggunakan bahan/zat hara yang serupa dengan habitat mengisolasi bakteri tersebut.

Bila sewaktu mengisolasi diberi peluang yang lebih besar bagi organisme tersebut oleh karena hanyalah keperluan bakteri tersebut yang dipenuhi, maka diharapkan bahwa dakam biakan tersebut akan tumbuh mikroorganisme tertentu tersebut Cara pembiakan seperti ini disebut selective enrichment. Selain menghambat zat hara tertentu sering kali ditambahkan zat penghambat tertentu. Bahan ini tidak mengganggu pertumbuhan mikroorganisme yang ingin diisolasi, akan tetapi menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain yang tidak diinginkan.

Selain menambahkan bahan penghambat ditambahkan pula indikator sehingga dapat dibedakan kelompok bakteri yang mempunyai sifat-sifat tertentu, misalnya membedakan bakteri yang memfermentasikan laktosa dan yang tidak menfermentasikan laktosa, Dengan menggunakan indikator akan terlihat ada atau tidaknya fermentasi suatu gula tertentu.

Zat-zat hara yang ditambahkan ke dalam media

Beberapa zat hara yang ditambahkan ke dalam media adalah : Nitrogen

Pada umumny bakteri tidak dapat langsung menggunakan nitrogen (N2₎

bebas dari udara, sehingga keperluannya diberikan dalam bentuk garam. Nitrogen diperlukan sebagai bahan dasar untuk protein, asam nuleat dan vitamin. Dalam media bahan yang mengandung N ini berupa :

 NH4Cl – N anorganik

 NaNO3

 Pepton – N organik Karbon

Sebagai sumber karbon digunakan berbagai gula , pati, glikogen. Gula yang dipakai berupa 5C, 6C atau disakarida (laktosa, sukrosa dan maltosa). Untuk dapat menggunakan sumber karbon ini bakteri menguraikannya menjadi molekul yang lebih kecil yang kemudian digunakannya untuk bahan dasar pembuatan protein, polisakarida, lipida dan asam nukleat.

Vitamin dan faktor pertumbuhan

Berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah thiamin, riboflavin, asam nikotinat, asam pantotenat, biotin. Vitamin ini berfungsi sebagai koenzim atau bahan lain dari bahan dasar sel. Koenzim adalh bagian aktif dari enzim dan berkaitan dengan bagian protein dari enzim tersebut. Selain vitamin, bakteri juga memerlukan faktor pertumbuhan seperti pemula (precussor) protein atau bahan lainnya. Termasuk dalam faktor pertumbuhan adalah bahan kimiawi yang diperlukan untuk pertumbuham, tetapi tidak dapat disintesa sendiri oleh bakteri, contoh asam pimelat pemula biotin, beta alanin, pemula asam pantotenat, purin dan pirimidin untuk sintesis asam nukleat. Beberapa bakteri memerlukan faktor pertumbuhan yang khusus, Hemophilus influenzae, memerlukan bahan tertentu dari Hb untuk pertumbuhannya, selain NAD (Nikotin Adenin Dinukleotida). Laktobacillus memerlukan vitamin B12, untuk pertumbuhannya, sehingga kemudian sifat ini digunakan untuk menentukan konsentrasi vitamin dalam suatu sampel. Cara ini disebut essai mikrobiologik. Ini berarti bahwa kecepatan pertumbuhan bakteri akan sebanding dengan konsentrasi vitamin dalam sampel.

Garam dan mineral

Beberapa garam inorganik merupakan kebutuhan esensial. Termasuk ke dalam kelompok ini adalah, Sulfur diberikan dalam bentuk NH4SO4, S ini diperlukan sebagai koenzim, asam amino dan komponen sel lainnya.

Posfor ditemukan dalam asam nukleat dan fosfolipida dan juga ATP. P diberikan dalam bentuk K2HPO4 dan KH2PO4.

K, Mg, Mn, Fe, dan Ca berfungsi sebagai kofaktor dalam berbagai enzim selain juga diperlukan dalam pertumbuhan.

Ada beberapa bahan inorganik yang diperlukan dalam jumlah kecil, unsur sekelumit (trace element), yaitu kobalt, molibdenum, Zn dan Cu. Bahan inorganik ini merupakan bagian dari enzim tertentu yang diperlukan dalam kehidupan.

Air

Bakteri terdiri dari air sebanyak 80% sehingga air diperlukan untuk pertumbuhan dan pembiakan bakteri. Air yang digunakan dalam pembuatan media adalah aquadestilata oleh karena dalam air kran/leding terkandung bahan inorganik atau organik. Selain itu bahan organik dan inorganik ini tidak selalu sama, sehingga pembuatan media sebaiknya menggunakan aquadestilata.

Berbagai faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri

Secara umum ada dua faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri yaitu faktor lingkungan dan zat hara. Termasuk dalan faktor lingkungan adalah, suhu, pH, oksigen, dan tekanan osmotik.

Suhu

Pada umumnya bakteri tumbuh pada suhu di atas 350_{C, untuk setiap spesies}

ada batasan suhu maksimum dan minimum untuk pertumbuhannya. Suhu optimum lebih mendekati suhu maksimum sedangkan pada suhu minimum pertumbuhan lebih lambat. Jika suhu lebuh tinggi daripada suhu maksimum maka pertumbuhan bakteri akan menurun dengan cepat.

Hal ini sebenarnya menggambarkan bahwa suhu terutama mempengaruhi enzim, makin tinggi suhu maka aktivitas enzim juga makin cepat. Apabila suhu terlalu tinggi maka enzim akan terdenaturasikan sehingga sel kemudian akan mati.

Bakteri dibagi atas beberapa kelompok menurut suhu optimum pertumbuhan yaitu:

1. Psikrofil: 50 _{– 30}0_{C, Kelompok bakteri ini menimbulkan kesulitan untuk makanan}

yang disimpan dalam lemari es, oleh karena kelompok ini dapat tumbuh pada

suhu 40_C.

2. Mesofil: 150 _{– 50}0_{C, Bakteri pada umumnya termasuk ke dalam kelompok ini.}

Bakteri patogen pada umumnya mempunyai suhu optimum sekitar 35 – 400_C.

3. Termofil : 500 _{– 60}0_{C, dalam kelompok ini termasuk juga bakteri dalam sumber}

air panas yang dapat tumbuh pada suhu 900_C

Selain suhu faktor lingkungan lainnya dapat berpengaruh pada pertumbuhan bakteri. Dalam keadaan asam kemampuan bakteri untuk dapat tumbuh pada suhu yang tinggi akan berkurang. Pada sumber air panas yang bersifat asam , maka suhu tertinggi bakteri yang dapat tumbuh adalah 800_{C. Sebaliknya pada keadaan basa, suhu tertinggi}

dapat melebihi 900_C.

Meskipun bukan suhu optimumnya beberapa bakteri tahan terhadap suhu dingin, kelompok ini disebut psikodurik atau kriodurik. Sedangkan yang tahan pada suhu panas disebut thermodurik.

Pertumbuhan pada suhu berbeda dapat memberikan karakteristik berbeda. Jika Seratia marcescens diinkubasikan pada suhu 250_{C terlihat warna merah orange,}

Lactobacillus plantarum tidak memerlukan fenilalanin bila ditumbuhkan pada suhu 250_{C, tetapi bila ditumbuhkan pada suhu 37}0_{C asam amino ini harus}

ditambahkan ke dalam media. pH

Nilai pH medium sangat mempengaruhi jenis jasad renik yang dapat tumbuh. Jasad renik pada umumnya dapat tumbuh pada kisaran pH 3 – 6 unit. Kebanyakan bakteri mempunyai pH optimum, yaitu pH dimana pertumbuhannya maksimum, sekitar ph 6.5 – 7.5. Pada pH dibawah 5 dan di atas 8,5 bakteri tidak dapat tumbuh dengan baik, kecuali bakteri asam asetat (Acetobacter suboxydans) dan bakteri oksidasi sulfur. Sebaliknya kamir mempunyai pH 4 – 5 dan dapat tumbuh pada kisaran pH 2.5 – 8.5. Olek karena itu kamir dapat tumbuh pada pH rendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat, Kapang mempunyai pH optimum 5 - &, tetapi seperti halnya khamir, kamir masih dapat hidup pada pH sekitar 3 – 8.5.

Makanan yang mempunyai pH rendah ( di bawah 4.5) biasanya tidak dapat ditumbuhi bakteri, tetapi rusak karena pertumbuhan khamir dan kapang. Oleh karena itu makanan yang mempunyai pH rendah relatif lebih tahan dibandingkan dengan makanan yang mempunyai pH netral atau mendekati netral.

Dalam pengolahan pangan makanan dapat dibedakan atas beberapa grup berdasarkan pHnya. Pembagian makanan atas beberapa grup ini bertujuan untuk mengetahui daya awet suatu makanan, dengan demikian memudahkan mencari perlakuan yang harus diberikan untuk mengawetkan makanan tersebut. Semakin rendah pH makanan, semakin berkurang perkakuan pengawetan yang harus diberikan kepada makanan tersebut. Penggolongan makanan berdasarkan pHnya adalah sebagai berikut: 1. Makanan berasam rendah, yaitu makanan yang mempunyai pH di atas 5.3, misalnya jagung, daging ikan dan susu.

2. Makanan berasam sedang, yaitu makanan yang mempunyai pH 5.3 sampai di atas 4.5, misalnya bayam, asparagus, bit, dan waluh kuning.

3. Makanan asam, yaitu makanan yang mempunyai pH 4.5 sampai di atas 3.7, misalnya tomat pear dan nanas.

4. Makanan berasam tinggi, yaitu makanan yang mempunyai pH 3.7 atau kurang, misalnya buah-buahan yang tergolong asam (misalnya beries) dan acar-acaran (termasuk sayur asin dan sauerkraut).

Oksigen

Bakteri dibagi 3 kelompok berdasarkan keperluannya atas oksigen:

1. Aerob obligat; Kelompok ini selalu memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya. Bakteri ditumbuhkan dalam bejana yang diletakkan pada shaker, sehingga oksigen selalu tersedia.

2. Anaerob obligat : kelompok ini dapat tumbuh bila oksigen tidak ada. adanya oksigen akan mematikan kelompok bakteri ini. Hal ini disebabkan oleh karena kelompok bakteri ini tidak memiliki enzim yang dapat menguraikan hasil oksidasi dalam metabolisme yang bersifat toksik. Beberapa bakteri memerlukan oksigen yang sangat rendah untuk pertumbuhannya, oksigen di atmosfir tidak ditolerasi oleh kelompok bakteri ini . Kelompok ini disebut mikroaerofilik. Aerotoleran anaerobik dapat tumbuh bila ada oksigen meskipun oksigen ini tidak digunakan untuk metabolismenya ( Steptococcus). Kepekaan terhadap oksigen disebabkan oleh pembentukan hidrogen peroksida H2O2

sewaktu metabolisme. Bahan ini merupakan racun dan dapat diuraikan menjadi H2O dan

O2 melalui enzim katalase. Obligat anaerob ini tidak memiliki enzim sehingga oksigen

dalam jumlah kecil saja akan mematikan bakteri ini. Fakultatif anaerob

Kelompok bakteri ini dapat tumbuh dalam keadaan dengan atau tanpa oksigen, meskipun pertumbuhannya jauh lebih cepat dibandingkan adanya oksigen

Pembiakan bakteri anaerob

Lingkungan anaerob dicapai dengan;

1. Media dengan bahan reduktor. Sewaktu disiapkan media direbus untuk mengusir oksigen yang terlarut. Bahan yang memiliki kemampuan untuk mereduksi seperti sistin ditambahkan untuk menurunkan kadar oksigen. N2 yang bersifat bebas-oksigen

ditambahkan ke dalam media dan kemudian disterilisasikan.

2. Ruang anaerobik yang merupakan plastik anaerobic glove box yang mengandung H2,

CO2 dan N2. Katalis yang digunakan adalah paladium. Di laboratorium digunakan

ANALISIS KUANTITATIF MIKROBIOLOGI PADA BAHAN PANGAN Analisis kuantitatif pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Beberapa cara dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelopmok yaitu,

A. Perhitungan jumlah sel

1. Hitungan mikroskopik 2. Hitungan cawan

3. MPN ( Most Probable Number) B. Perhitungan massa sel secara langsung

1. Volumetrik 2. Gravimetrik

3. Kekeruhan (Turbidity)

C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung

1. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP dan sebagainya)

2. Analisis produk katabolisme ( metabolit primer, atau sekunder, panas ) 3. Analisis konsumsi nutrien ( karbon, nitrogenh, oksegen, asam amino, mineral, dll ).

Perhitungan massa sel secara langsung maupun tidak langsung jarang dilakukan dalam uji mikrobiologi bahan pangan, tetapi sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung, jumlah sel mikroba dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak mengganggu pengukuran. Sebagai contoh, dalam metode volumetrik dan gravimetrik, pengukuran volume dan berat sel dilakukan dengan terlebih dahulu menyaring sel-sel mikroorganisme. Oleh karena itu jika substrat tempat tumbuhnya banyak mengandung padatan, misalnya bahan pangan, sel jasad renik tidak dapat diukur menggunakan volumetrik, gravimetrik maupun turbidimetri. Pertumbuhan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komposisi sunstrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti.

Hitungan cawan

Prinsip metode hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakamn mkroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba karena beberapa hal, yaitu :

1. Hanya sel yang masih hidup yang dapat dihitung 2. Beberapa mikroba dapat sekaligus dihitung

3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.

Selain keuntungan tersebut metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan sebagai berikut:

1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni.

2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.

3. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.

4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Dalam hitungan cawan, bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel jasad renik per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dala cawan petri. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik di antara 30 – 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1 : 10, 1: 100, 1: 1000 dan seterunnya, atau 1: 100, 1 : 10000, 1 : 1000 000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat, 0.85% NaCl, atau larutan ringer.

Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (pour plate ) dan metode permukaan ( surface plate/spread plate methode ). Dalam metode tuang sejumlah contoh ( 1 ml atau 0.1 ml ) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan agar sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya contoh menyebar rata. Pada pemupukan dengan metode permukaan terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian sebanyak 0.1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, dan diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril. Jumlah koloni dalam contoh dapat dihitung sebagai berikut :

Koloni per ml atau pe gram = Jumlah koloni percawan x 1 faktor pengenceran Metode MPN ( Most Probable Number )

Metode MPN menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan dengan berdasarkan jumlah tabung yang positip yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positip dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil ( Durham ) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk mikroba pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan lebih banyak.

Dalam metode MPN pengenceran harus dilakukan lebih tinggi dari pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel jasad renik, sedangkan tabung lain tidak mengandung sel. Dengan demikia, setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positip, sedankan lainnya tabung negatif.

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah sel jasad renik di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh yang berbentu padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari contoh tersebut.

Dalam metode MPN , dari setiap pengenceran dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 seri tabung atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu dihitung jumlah tabung yang positip yaitu tabung yang ditumbuhi jasad renik yang dapat ditandai dengan timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pengenceran pertama ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positip, pada pengenceran kedua kedua tabung menghasilkan dua tabung positip, pada pengenceran ketiga satu tabung positip dan pada pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positip. Kombinasinya menjadi 3, 2, 1, 0 dan jika yang diambil tiga pengenceran pertama maka kombinasinya akan menjadi 3, 2, 1. Angka ini kemudian dicocokkan dengan Tabel MPN, dan nilai MPN contoh dapat dihitung sebagai berikut:

MPN contoh = Nilai MPN Tabel x 1/pengenceran tabung tengah

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari tiga seri tabung berbeda dengan untuk lima seri tabung. kombinasi yang dipilih dimulai daqri pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung yang masih positip, sedangkan pada pengenceran yang berikitnya ada tabung yang negatif. Kombinasi yang diambil terdiri dari tiga pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat atau seterusnya masih ditemukan tabung yang hasilnya positip, maka jumlah tabung yang positip tersebut harus ditambahkan pada angka kombinasi yang ketiga sampai mencapai jumlah maksimum.

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme tertentu yang terdapat diantara campuran mikroorganisme lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan Lactosa Broth maka adanya bakteri yang dapat menfermentasi laktosa ditunjukkan dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasa digunakan untuk menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform termasuk bakteri yang dapaqt menfermentasi laktosa.

Metode hitungan tidak langsung

Salah satu cara untuk menghitung jumlah sel di dalam suatu bahan secara tidak langsung adalah dengan uji biru metilen. Uji biru metilen (BM) biasanya dilakukan terhadap susu, dan dapat memberi perkiraan jumlah bakteri di dalam susu. Dalam uji ini ditambahkan sejumlah biru metilen kedalam susu, kemudian diamati kemampuaqn

bakteri di dalam susu untuk tumbuh dan menggunakan oksigen yang terlarut, sehingga menyebabkan penurunan kekuatan oksidasi reduksi dari campuran tersebut. Akibatnya biru metilen yang ditambahkan akan tereduksi menjadi putih metilen. Waktu reduksi yaitu perubahan warna biru menjadi putih, dianggap selesai jika kira-kira empat perlima dari contoh susu yang terdapat dalam tabung ( sebanyak 10 ml ) telah berwarna putih. beberapa penelitian melaporkan perkiraan jumlah koloni yang diperoleh dengan metode hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan metode hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan metode biru metilen dapat dilihat pada tabel berikut. Semakin tinggi jumlah bakteri dalam susu, semakin cepat terjadinya perubahan warna dari biru menjadi putih.

Tabel. Hubungan antara jumlah koloni menggunakan metode cawan dengan waktu reduksi dalam uji biru metilen

Waktu reduksi biru metilen (jam) Perkiraan jumlah koloni (x 104₎

0.5 – 3.5 4

4.5 5 5.5 6 6.5 – 8 8

80 atau lebih 40

25 15 10 6 2.5 1

Metode biru metilen merupakan cara yang lebih cepat dibandingkan dengan metode hitungan cawan, dan lebih teliti karena bakteri yang terdapat dalam keadaan berkelompok dimana dalam metode hitungan cawa dihitung sebagai satu koloni, dalam metode BM hal ini tidak terpengaruh terhadap perhitungan jumlah bakteri.

Kelemahan metode BM adalah cara ini tridak proktis dilakukan terhadap susu yang mengandung bakteri hidup dalam jumlah sedikit, misalnya susu yang mengalami pasteurisasi, dimana dibutuhkan waktu lama sekali untuk mereduiksi biru metilen. Kelemahan lain adalah karena dalam uji biru metilen diperlukan waktu pengamatan yang terus menerus, yaitu paling sedikit selama 6 jam. Dengan metode ini juga tidak dapat dibedakan jenis bakteri yang terdapat di dalam susu, misalnya bakteri gram positip atau negatif, pembentuk spora, khamir dan sebagainya.

Lactobacillus plantarum tidak memerlukan fenilalanin bila ditumbuhkan pada suhu 250_{C, tetapi bila ditumbuhkan pada suhu 37}0_{C asam amino ini harus}

ditambahkan ke dalam media. pH

Nilai pH medium sangat mempengaruhi jenis jasad renik yang dapat tumbuh. Jasad renik pada umumnya dapat tumbuh pada kisaran pH 3 – 6 unit. Kebanyakan bakteri mempunyai pH optimum, yaitu pH dimana pertumbuhannya maksimum, sekitar ph 6.5 – 7.5. Pada pH dibawah 5 dan di atas 8,5 bakteri tidak dapat tumbuh dengan baik, kecuali bakteri asam asetat (Acetobacter suboxydans) dan bakteri oksidasi sulfur. Sebaliknya kamir mempunyai pH 4 – 5 dan dapat tumbuh pada kisaran pH 2.5 – 8.5. Olek karena itu kamir dapat tumbuh pada pH rendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat, Kapang mempunyai pH optimum 5 - &, tetapi seperti halnya khamir, kamir masih dapat hidup pada pH sekitar 3 – 8.5.

Makanan yang mempunyai pH rendah ( di bawah 4.5) biasanya tidak dapat ditumbuhi bakteri, tetapi rusak karena pertumbuhan khamir dan kapang. Oleh karena itu makanan yang mempunyai pH rendah relatif lebih tahan dibandingkan dengan makanan yang mempunyai pH netral atau mendekati netral.

Dalam pengolahan pangan makanan dapat dibedakan atas beberapa grup berdasarkan pHnya. Pembagian makanan atas beberapa grup ini bertujuan untuk mengetahui daya awet suatu makanan, dengan demikian memudahkan mencari perlakuan yang harus diberikan untuk mengawetkan makanan tersebut. Semakin rendah pH makanan, semakin berkurang perkakuan pengawetan yang harus diberikan kepada makanan tersebut. Penggolongan makanan berdasarkan pHnya adalah sebagai berikut: 1. Makanan berasam rendah, yaitu makanan yang mempunyai pH di atas 5.3, misalnya jagung, daging ikan dan susu.

2. Makanan berasam sedang, yaitu makanan yang mempunyai pH 5.3 sampai di atas 4.5, misalnya bayam, asparagus, bit, dan waluh kuning.

3. Makanan asam, yaitu makanan yang mempunyai pH 4.5 sampai di atas 3.7, misalnya tomat pear dan nanas.

4. Makanan berasam tinggi, yaitu makanan yang mempunyai pH 3.7 atau kurang, misalnya buah-buahan yang tergolong asam (misalnya beries) dan acar-acaran (termasuk sayur asin dan sauerkraut).

Oksigen

Bakteri dibagi 3 kelompok berdasarkan keperluannya atas oksigen:

1. Aerob obligat; Kelompok ini selalu memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya. Bakteri ditumbuhkan dalam bejana yang diletakkan pada shaker, sehingga oksigen selalu tersedia.

2. Anaerob obligat : kelompok ini dapat tumbuh bila oksigen tidak ada. adanya oksigen akan mematikan kelompok bakteri ini. Hal ini disebabkan oleh karena kelompok bakteri ini tidak memiliki enzim yang dapat menguraikan hasil oksidasi dalam metabolisme yang bersifat toksik. Beberapa bakteri memerlukan oksigen yang sangat rendah untuk pertumbuhannya, oksigen di atmosfir tidak ditolerasi oleh kelompok bakteri ini . Kelompok ini disebut mikroaerofilik. Aerotoleran anaerobik dapat tumbuh bila ada oksigen meskipun oksigen ini tidak digunakan untuk metabolismenya ( Steptococcus). Kepekaan terhadap oksigen disebabkan oleh pembentukan hidrogen peroksida H2O2

sewaktu metabolisme. Bahan ini merupakan racun dan dapat diuraikan menjadi H2O dan

O2 melalui enzim katalase. Obligat anaerob ini tidak memiliki enzim sehingga oksigen

dalam jumlah kecil saja akan mematikan bakteri ini. Fakultatif anaerob

Kelompok bakteri ini dapat tumbuh dalam keadaan dengan atau tanpa oksigen, meskipun pertumbuhannya jauh lebih cepat dibandingkan adanya oksigen

Pembiakan bakteri anaerob

Lingkungan anaerob dicapai dengan;

1. Media dengan bahan reduktor. Sewaktu disiapkan media direbus untuk mengusir oksigen yang terlarut. Bahan yang memiliki kemampuan untuk mereduksi seperti sistin ditambahkan untuk menurunkan kadar oksigen. N2 yang bersifat bebas-oksigen

ditambahkan ke dalam media dan kemudian disterilisasikan.

2. Ruang anaerobik yang merupakan plastik anaerobic glove box yang mengandung H2,

CO2 dan N2. Katalis yang digunakan adalah paladium. Di laboratorium digunakan

ANALISIS KUANTITATIF MIKROBIOLOGI PADA BAHAN PANGAN Analisis kuantitatif pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Beberapa cara dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelopmok yaitu,

A. Perhitungan jumlah sel

1. Hitungan mikroskopik 2. Hitungan cawan

3. MPN ( Most Probable Number) B. Perhitungan massa sel secara langsung

1. Volumetrik 2. Gravimetrik

3. Kekeruhan (Turbidity)

C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung

1. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP dan sebagainya)

2. Analisis produk katabolisme ( metabolit primer, atau sekunder, panas ) 3. Analisis konsumsi nutrien ( karbon, nitrogenh, oksegen, asam amino, mineral, dll ).

Perhitungan massa sel secara langsung maupun tidak langsung jarang dilakukan dalam uji mikrobiologi bahan pangan, tetapi sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung, jumlah sel mikroba dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak mengganggu pengukuran. Sebagai contoh, dalam metode volumetrik dan gravimetrik, pengukuran volume dan berat sel dilakukan dengan terlebih dahulu menyaring sel-sel mikroorganisme. Oleh karena itu jika substrat tempat tumbuhnya banyak mengandung padatan, misalnya bahan pangan, sel jasad renik tidak dapat diukur menggunakan volumetrik, gravimetrik maupun turbidimetri. Pertumbuhan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komposisi sunstrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti.

Hitungan cawan

Prinsip metode hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakamn mkroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba karena beberapa hal, yaitu :

1. Hanya sel yang masih hidup yang dapat dihitung 2. Beberapa mikroba dapat sekaligus dihitung

3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.

Selain keuntungan tersebut metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan sebagai berikut:

1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni.

2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.

3. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.

4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Dalam hitungan cawan, bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel jasad renik per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dala cawan petri. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik di antara 30 – 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1 : 10, 1: 100, 1: 1000 dan seterunnya, atau 1: 100, 1 : 10000, 1 : 1000 000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat, 0.85% NaCl, atau larutan ringer.

Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (pour plate ) dan metode permukaan ( surface plate/spread plate methode ). Dalam metode tuang sejumlah contoh ( 1 ml atau 0.1 ml ) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan agar sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya contoh menyebar rata. Pada pemupukan dengan metode permukaan terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian sebanyak 0.1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, dan diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril. Jumlah koloni dalam contoh dapat dihitung sebagai berikut :

Koloni per ml atau pe gram = Jumlah koloni percawan x 1 faktor pengenceran Metode MPN ( Most Probable Number )

Metode MPN menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan dengan berdasarkan jumlah tabung yang positip yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positip dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil ( Durham ) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk mikroba pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan lebih banyak.

Dalam metode MPN pengenceran harus dilakukan lebih tinggi dari pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel jasad renik, sedangkan tabung lain tidak mengandung sel. Dengan demikia, setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positip, sedankan lainnya tabung negatif.

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah sel jasad renik di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh yang berbentu padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari contoh tersebut.

Dalam metode MPN , dari setiap pengenceran dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 seri tabung atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu dihitung jumlah tabung yang positip yaitu tabung yang ditumbuhi jasad renik yang dapat ditandai dengan timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pengenceran pertama ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positip, pada pengenceran kedua kedua tabung menghasilkan dua tabung positip, pada pengenceran ketiga satu tabung positip dan pada pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positip. Kombinasinya menjadi 3, 2, 1, 0 dan jika yang diambil tiga pengenceran pertama maka kombinasinya akan menjadi 3, 2, 1. Angka ini kemudian dicocokkan dengan Tabel MPN, dan nilai MPN contoh dapat dihitung sebagai berikut:

MPN contoh = Nilai MPN Tabel x 1/pengenceran tabung tengah

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari tiga seri tabung berbeda dengan untuk lima seri tabung. kombinasi yang dipilih dimulai daqri pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung yang masih positip, sedangkan pada pengenceran yang berikitnya ada tabung yang negatif. Kombinasi yang diambil terdiri dari tiga pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat atau seterusnya masih ditemukan tabung yang hasilnya positip, maka jumlah tabung yang positip tersebut harus ditambahkan pada angka kombinasi yang ketiga sampai mencapai jumlah maksimum.

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme tertentu yang terdapat diantara campuran mikroorganisme lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan Lactosa Broth maka adanya bakteri yang dapat menfermentasi laktosa ditunjukkan dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasa digunakan untuk menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform termasuk bakteri yang dapaqt menfermentasi laktosa.

Metode hitungan tidak langsung

Salah satu cara untuk menghitung jumlah sel di dalam suatu bahan secara tidak langsung adalah dengan uji biru metilen. Uji biru metilen (BM) biasanya dilakukan terhadap susu, dan dapat memberi perkiraan jumlah bakteri di dalam susu. Dalam uji ini ditambahkan sejumlah biru metilen kedalam susu, kemudian diamati kemampuaqn

bakteri di dalam susu untuk tumbuh dan menggunakan oksigen yang terlarut, sehingga menyebabkan penurunan kekuatan oksidasi reduksi dari campuran tersebut. Akibatnya biru metilen yang ditambahkan akan tereduksi menjadi putih metilen. Waktu reduksi yaitu perubahan warna biru menjadi putih, dianggap selesai jika kira-kira empat perlima dari contoh susu yang terdapat dalam tabung ( sebanyak 10 ml ) telah berwarna putih. beberapa penelitian melaporkan perkiraan jumlah koloni yang diperoleh dengan metode hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan metode hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan metode biru metilen dapat dilihat pada tabel berikut. Semakin tinggi jumlah bakteri dalam susu, semakin cepat terjadinya perubahan warna dari biru menjadi putih.

Tabel. Hubungan antara jumlah koloni menggunakan metode cawan dengan waktu reduksi dalam uji biru metilen

Waktu reduksi biru metilen (jam) Perkiraan jumlah koloni (x 104₎

0.5 – 3.5 4

4.5 5 5.5 6 6.5 – 8 8

80 atau lebih 40

25 15 10 6 2.5 1

Metode biru metilen merupakan cara yang lebih cepat dibandingkan dengan metode hitungan cawan, dan lebih teliti karena bakteri yang terdapat dalam keadaan berkelompok dimana dalam metode hitungan cawa dihitung sebagai satu koloni, dalam metode BM hal ini tidak terpengaruh terhadap perhitungan jumlah bakteri.

Kelemahan metode BM adalah cara ini tridak proktis dilakukan terhadap susu yang mengandung bakteri hidup dalam jumlah sedikit, misalnya susu yang mengalami pasteurisasi, dimana dibutuhkan waktu lama sekali untuk mereduiksi biru metilen. Kelemahan lain adalah karena dalam uji biru metilen diperlukan waktu pengamatan yang terus menerus, yaitu paling sedikit selama 6 jam. Dengan metode ini juga tidak dapat dibedakan jenis bakteri yang terdapat di dalam susu, misalnya bakteri gram positip atau negatif, pembentuk spora, khamir dan sebagainya.