Efek antiinflamasi benzoil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan Galur Swiss - USD Repository
EFEK ANTIINFLAMASI BENZOIL EUGENOL SECARA TOPIKAL
TERHADAP EDEMA KAKI YANG DIINDUKSI FORMALIN 0,5% PADA
MENCIT JANTAN GALUR SWISS
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh:
Paulina Maya Octasari NIM : 078114126
PRAKATA
Penulis mengucapkan puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat, rahmat dan cinta-Nya yang diberikan, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul ”Efek Antiinflamasi Benzoil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss”.
Dalam proses pelaksanaan dan penyusunan skripsi yang merupakan tugas akhir untuk memenuhi salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Strata satu Farmasi (S. Farm.), program Studi Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, penulis ingin. Maka ucapan terima kasih yang tulus khususnya penulis tujukan kepada :
1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas dukungan yang diberikan.
2. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing dan penguji yang telah mengarahkan, mendampingi, dan meluangkan waktu untuk berdiskusi bersama penulis selama proses penelitian, penyusunan, hingga selesainya skripsi ini.
3. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan waktu, saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.
6. Staf laboratorium, Bapak Kayatno dan Bapak Yohanes Ratijo yang telah banyak membantu selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Imono.
7. Yustinus Bambang Suliestyo dan Yuliana Dwi Lestari atas doa, kesabaran, nasehat dan dukungannya yang tidak pernah terlewatkan sehingga penulis dapat semangat dalam menyelesaikan skripsi ini.
8. Adikku Sebastianus Harya Anggana, Valentina Yunita Lestiani, dan Yohanes Guntur Sutirto yang memberikan semangat dan doa.
9. Pius Perwita Setyo Hadi terima kasih atas doa, kesabaran, kasih sayang, pendapat, perhatian dan dukungannya.
10. Temanku Dani, Devi, Dika, Yosephine dan Yudi untuk kerjasama selama melakukan dan menyelesaikan skripsi.
11. Dita, Olive, dan Frissa yang telah memberikan semangat dan dukungan.
12. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan yang ada dalam penyusunan skripsi ini. Maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Akhir kata, semoga penelitian skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca terutama bagi perkembangan
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................. v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. vi PRAKATA .......................................................................................................... vii DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xvi
INTISARI .......................................................................................................... xix
ABSTRACT ........................................................................................................ xx
BAB I. PENGANTAR ...................................................................................... 1 A. Latar Belakang ......................................................................................
1 1. Permasalahan ...............................................................................
3 2. Keaslian penelitian .......................................................................
3 3. Manfaat penelitian .......................................................................
4
2. Mekanisme ...................................................................................
7 3. Siklooksigenase-1 dan siklooksigenase-2 ....................................
9 4. Gejala ...........................................................................................
12 B. Antiinflamasi .........................................................................................
13 C. Formalin ................................................................................................
14 D. Etil Asetat ..............................................................................................
15 R E. HealthyCo Virgin Coconut Oil (VCO) ................................................
15 F. Eugenol ..................................................................................................
16 G. Benzoil Eugenol ..................................................................................... 17
H. Penghantaran Obat secara Topikal ........................................................ 18 I. Metode Pengujian Antiinflamasi ...........................................................
19 J. Landasan Teori ......................................................................................
19 K. Hipotesis ................................................................................................
21 BAB III. METODE PENELITIAN .................................................................... 22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................. 22
B. Variabel Penelitian .................................................................................. 22
C. Definisi Operasional ……....................................................................... 23
D. Bahan dan Alat Penelitian ...................................................................... 23
1. Bahan ............................................................................................... 23
3. Orientasi pelarut benzoil eugenol ...................................................
26 4. Penentuan peringkat konsentrasi benzoil eugenol ..........................
26 5. Pengelompokan hewan uji ..............................................................
26 6. Pengamatan .....................................................................................
28 F. Tata Cara Analisis Hasil ......................................................................... 28
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 30 A. Hasil Orientasi Rentang Waktu Pengolesan Senyawa pada Edema Kaki Mencit, Konsentrasi Kontrol Positif, dan Pelarut Benzoil Eugenol ................................................................................................... 30
1. Hasil orientasi rentang waktu pengolesan senyawa pada edema kaki mencit yang diinduksi formalin 0,5% ...................................... 30
2. Hasil orientasi konsentrasi kontrol positif eugenol secara topikal .. 34
3. Hasil orientasi pelarut benzoil eugenol dan peringkat konsentrasinya ................................................................................. 37 B. Hasil Daya Antiinflamasi Benzoil Eugenol secara Topikal terhadap
Edema Kaki Mencit yang Diinduksi Formalin 0,5% ............................. 40
C. Hasil Uji Hubungan Linieritas antara Konsentrasi Benzoil Eugenol
terhadap Daya Antiinflamasi .............. ..................................................
50 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................. 52
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 98
DAFTAR TABEL
Tabel I. Komposisi VCO (Virgin Coconut Oil) ............................................ 16 Tabel II. Hasil analisis paired T-test orientasi rentang waktu pengolesan setiap jam selama 5 jam pengamatan ............................................... 32 Tabel III. Hasil analisis paired T-test orientasi rentang waktu pengolesan setiap 10 menit selama 1 jam pengamatan ....................................... 33 Tabel IV. Hasil analisis AUC total ketiga konsentrasi eugenol menggunakan
One-Way ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% ....................... 35
Tabel V. Hasil orientasi pelarut dan konsentrasi tertinggi yang didapatkan dari masing-masing pelarut non polar yang diuji ............................ 38 Tabel VI. Rata-rata nilai AUC total pada mencit yang diinduksi formalin
0,5% selama 6 jam pengamatan ....................................................... 42 Tabel VII. Nilai persentase penghambatan inflamasi (tebal edema kaki mencit) yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan... 46
b
Tabel VIII. Nilai persentase daya antiinflamasi benzoil eugenol 25% / v ;
b b
benzoil eugenol 12,5% / ; dan benzoil eugenol 6,25% / .............. 47
v v
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Diagram mediator-mediator inflamasi, prostaglandin dan tromboksan yang dihasilkan akibat perombakan fosfolipid .......... 7 Gambar 2. Pembentukan prostaglandin H
2 dari substrat asam arakidonat
oleh enzim COX-2 ........................................................................ 8 Gambar 3. Turunan karboksiklis dan heterosiklis yang terikat visinal dengan
moieties aril .................................................................................... 10
Gambar 4. Perbandingan penghambatan penempelan asam arakidonat pada COX-2 dengan COX-1 saat diberikan obat yang selektif terhadap COX-2 ........................................................................................... 11
Gambar 5. Struktur asam amino valin 523 ...................................................... 11 Gambar 6. Struktur etil asetat .......................................................................... 15 Gambar 7. Struktur eugenol ............................................................................ 16 Gambar 8. Struktur benzoil eugenol ................................................................ 17 Gambar 9. Skema penghantaran obat secara transdermal ............................... 18 Gambar 10. Skema jalannya penelitian ............................................................. 27 Gambar 11. Diagram batang orientasi konsentrasi eugenol sebagai kontrol positif ............................................................................................. 35
Gambar 14. Diagram batang rata-rata persentase penghambatan inflamasi (edema kaki mencit) yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan .................................................................................... 45
Gambar 15. Bagian sifat lipofil dan rantai pendek karboksil pada benzoil eugenol ........................................................................................... 48 Gambar 16. Interaksi antara benzoil eugenol dengan asam amino valin ............ 49 Gambar 17. Grafik hubungan linieritas konsentrasi benzoil eugenol 6,25% b/v; 12,5% b/v; 25% b/v terhadap persen penghambatan inflamasi ........................................................................................ 50
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Elusidasi Struktur dari Benzoil Euge nol ....................................... 59
a. Grafik senyawa menggunakan Gas Chromatography ................... 59
b. Pencarian bobot molekul senyawa ................................................ 60
c. Elusidasi struktur menggunakan IR .............................................. 61
d. Elusidasi struktur menggunakan NMR ......................................... 62 Lampiran 2. Surat Keterangan Pembelian Mencit di LPPT-Universitas Gajah Mada (UGM) ................................................................................
63 Lampiran 3.
a. Sertifikasi Kalibrasi Caliper merk Mitutoyo ................................. 64
b. Tabel presisi jangka sorong merk Mitutoyo .................................. 66 Lampiran 4. Skema orientasi konsentrasi kontrol positif eugenol ..................... 66 Lampiran 5.
a. Orientasi rentang waktu pengolesan edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% dengan pengukuran setiap jam selama lima jam pengamatan .................................................................................... 67
b. Orientasi rentang waktu pengolesan edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% dengan pengukuran setiap 10 menit selama 1 jam
b. Hasil Analisa Rata-rata AUC total Eugenol 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v untuk Kontrol Positif menggunakan Metode Analisis One-Way ANOVA Tingkat Kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe ..................................... 74
Lampiran 7.
a. Perhitungan konsentrasi benzoil eugenol menggunakan pelarut non polar etanol 96% .................................................................... 77 b. Perhitungan konsentrasi benzoil eugenol menggunakan pelarut non polar kloroform ...................................................................... 77 c. Perhitungan konsentrasi benzoil eugenol menggunakan pelarut non polar etil asetat ........................................................................ 77
Lampiran 8. Perhitungan peringkat konsentrasi benzoil eugenol menggunakan pelarut etil asetat .................... ........................................................ 77 Lampiran 9. Hasil Analisa Tebal Edema Kaki Mencit yang diinduksi Formalin
0,5% menggunakan One-Way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe ............................. 78 Lampiran10.
a. Contoh perhitungan data tebal edema menjadi nilai AUC ...................... 87
Lampiran11. Perhitungan nilai persentase penghambatan inflamasi pada kelompok kontrol eugenol 50% v/v; benzoil eugenol 25% b/v; benzoil eugenol 12,5% b/v; dan benzoil eugenol 6,25% b/v ......... 91
Lampiran 12.Hasil analisa persentase penghambatan inflamasi menggunakan
One-Way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian
dilanjutkan dengan uji Scheffe ...................................................... 92 Lampiran 13.
a. Perhitungan persentase daya antiinflamasi benzoil eugenol ......... 95
b. Hasil analisa persentase daya antiinflamasi benzoil eugenol menggunakan One-Way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe ..................................... 95
Lampiran 14. Perhitungan nilai EC
50 ................................................................. 97
INTISARI
Benzoilasi merupakan proses penghasilan senyawa turunan dengan menambahkan gugus benzoil pada senyawa induk tertentu sehingga memiliki struktur yang lebih besar dibandingkan senyawa induknya. Benzoil eugenol merupakan hasil benzoilasi yang memiliki kecocokan dengan sisi aktif enzim siklooksigenase-2 sehingga diduga memiliki aktivitas antiinflamasi dengan menghambat biosintesis prostaglandin. Penelitian ini bertujuan untuk menguji secara in vivo efek antiinflamasi benzoil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit galur Swiss.
Pengujian aktivitas antiinflamasi benzoil eugenol dilakukan menggunakan formalin 0,5% dengan metode pengukuran jangka sorong setiap jam selama enam jam pengamatan setelah injeksi subplantar. Hewan uji dibagi menjadi tujuh kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif formalin, etil asetat,
v b b
VCO , kontrol positif eugenol 50% / v , benzoil eugenol 25% / v ; 12,5% / v ; dan
b6,25% / v . Persentase penghambatan inflamasi benzoil eugenol dibandingkan
v dengan kontrol negatif formalin, etil asetat, dan kontrol positif eugenol 50% / v .
Semua pemberian senyawa uji dilakukan secara topikal.
b Hasil persentase penghambatan inflamasi benzoil eugenol 25% / v ; 12,5% b b / v ; dan 6,25% / v secara berturut-turut sebesar 35,612%; 29,438%; dan 4,851%.
Berdasarkan uji Regresi Linier semakin meningkatnya konsentrasi benzoil eugenol
maka dapat meningkatkan % penghambatan inflamasi. Dari persamaan regresi linier
tersebut didapatkan nilai EC sebesar 41,67%.50 Kata kunci : topikal, benzoil eugenol, antiinflamasi, formalin
ABSTRACT
Benzoylation is processes that add a benzyl group to the main compound so that produce bigger structure than main structure. Benzoyl eugenol is one of them that match with active-side of cyclooxygenase enzyme so that unexpectedly benzoyl eugenol can be an anti-inflammatory agent through inhibit prostaglandins biosynthesis. This study aims to prove that benzoyl eugenol really has in vivo anti-inflammatory effect in formaldehyde-induced hind paw oedema in mice.
Benzoyl eugenol was studied in formaldehyde-induced hind paw oedema in mice and the paw oedema was measured by vernier caliper every hour during six hour after subplantar injection. Mice divided into seven groups. There are
v
negative control of formaldehyde, ethyl acetate, VCO, eugenol 50% / v , benzoyl
b b b
eugenol 25% / v ; 12.5% / v ; dan 6.25% / v . Degree of anti-inflammatory of benzoyl eugenol was compared with negative control, ethyl acetate and positive
v control eugenol 50% / v . All of them were administered topically. b
The percentage of anti-inflammatory activity of benzoyl eugenol 25% / v ;
b b
12.5% / v ; and 6.25% / v are 35.612%; 29.438%; and 4.851%. According to the linier regression’s result, the increment of concentration benzoyl euge nol will cause the increment of anti-inflammatory effect. The effective concentration of benzoyl eugenol is 41.67%.
Key words: topical, benzyl eugenol, anti-inflammatory, formaldehyde .
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Peradangan atau inflamasi merupakan hal yang tidak asing lagi bagi
masyarakat. Yang dimaksud dengan peradangan atau inflamasi adalah respon kompleks lokal terhadap benda asing, misalnya bakteri atau pada keadaan tertentu terhadap bahan yang dihasilkan dari dalam tubuh. Respon inflamatoris adalah respon secara patofisiologi pada jaringan mamalia akibat terkena infeksi organisme, substansi kimia, luka fisik sehingga timbul bengkak yang diikuti akumulasi lokal cairan plasma dan sel darah (Sobota, Szwed, Kasza, Bugno, and Kordula, 2000). Peristiwa inflamasi ini ditandai dengan beberapa gejala yang khas seperti calor, rubor, tumor (edema), dolor, dan functio lesa (Kee and Hayes, 1996).
Dua senyawa yang dapat menimbulkan inflamasi antara lain formalin dan karagenin, dimana formalin dapat memberikan gejala inflamasi berupa edema dan kemerahan terlihat lebih nyata dibandingkan dengan karagenin (Joseph, George, and Nair, 2005). Formalin merupakan larutan formaldehid 37% yang menimbulkan inflamasi dengan mekanisme bifasik yang terdiri dari fase nosiseptif sebagai fase awal dan fase inflamasi sebagai fase kedua. Pada fase antiinflamasi non steroid dapat mengiritasi lambung karena ketidakselektifan terhadap enzim siklooksigenase (COX). Hampir semua obat AINS bekerja pada kedua isoform dari enzim siklooksigenase sehingga senyawa proteksi lambung yang seharusnya dihasilkan oleh enzim siklooksigenase-1 (COX-1) dihambat pembentukannya (Schror and Meyer-Kirchrath, 2000). Maka salah satu hal yang dapat dilakukan untuk mengatasi permasalahan tersebut adalah mengubah jalur pemberian secara per oral menjadi secara topikal.
Menurut Sadeghian, Seyedi, Saberi, Arghiani, and Riazi (2008), eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol) merupakan salah satu senyawa alam yang menunjukkan aktivitas sebagai antispasmodik, antipiretik, antibakteri (Ayoola et
al., 2008), dan antiinflamasi dengan menghambat kemotaksis leukosit yang
dimiliki oleh setiap senyawa fenolik (Azuma, Ozasa, Ueda and Takagi, 1986) dan menekan ekspresi siklooksigenase-2 (COX-2) (Magalhaes et al., 2010) pada makrofag RAW 264,7 (Ozturk and Ozbek, 2005). Eugenol dapat mengalami benzoilasi menjadi benzoil eugenol dengan penambahan gugus benzoil sehingga menghasilkan senyawa yang memiliki struktur lebih besar dibandingkan senyawa induknya. Lebar jalan masuk ke sisi aktif enzim COX-2 lebih besar dibandingkan enzim COX-1 sehingga benzoil eugenol diduga memiliki keselektifan terhadap enzim COX-2 (Vane, Botting, and Botting, 1996). Sifat lipofilisitas benzoil enzim 5-lipooksigenase yang telah terbukti secara in vitro (Sadeghian et al., 2008) sehingga diduga memiliki aktivitas antiinflamasi.
1. Permasalahan
a. Apakah benzoil eugenol memiliki efek antiinflamasi secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss?
b. Berapakah persentase penghambatan inflamasi benzoil eugenol sebagai agen antiinflamasi terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss?
c. Berapakah persentase daya antiinflamasi benzoil eugenol sebagai agen antiinflamasi terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss?
d. Berapakah konsentrasi efektif (EC
50 ) benzoil eugenol sebagai agen
antiinflamasi terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss?
2. Keaslian penelitian Berdasarkan sumber-sumber informasi yang diperoleh, terdapat beberapa penelitian ilmiah yang memiliki korelasi dengan penelitian yang akan dilaksanakan oleh penulis. Penelitian ilmiah tersebut meliputi, Uji Efek antiinflamasi dengan persentase penghambatan (45,10 + 11,18)% lebih kecil dari Na diklofenak emulgel yang memiliki persentase penghambatan (76.47+13,16)% (p=0,002).
Selain itu, penelitian yang berjudul Design and Synthesis of Eugenol
Derivatives, as Potent 15-lipoxygenase Inhibitors oleh Sadhegian et al., 2008
menunjukkan bahwa benzoil eugenol dapat menghambat aktivitas enzim lipooksigenase dengan rentang penghambatan yang besar secara kimia komputasi.
Penelitian mengenai Efek Antiinflamasi Benzoil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang diinduksi Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss sejauh pengetahuan penulis belum pernah ada yang melakukan.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis Hasil penelitian ini dapat digunakan untuk menambah informasi dan perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang pengujian efek antiinflamasi benzoil eugenol secara topikal terhadap edema yang diinduksi formalin 0,5%.
b. Manfaat praktis Penelitian ini dapat dijadikan acuan dalam penanganan kasus inflamasi menggunakan benzoil eugenol yang dapat dilakukan secara
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk memberikan informasi bahwa benzoil eugenol memiliki aktivitas antiinflamasi.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui ada tidaknya efek antiinflamasi secara topikal dari benzoil eugenol terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
b. Mengetahui persentase penghambatan inflamasi benzoil eugenol sebagai agen antiinflamasi topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
c. Mengetahui persentase daya antiinflamasi benzoil eugenol sebagai agen antiinflamasi topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
d. Mengetahui konsentrasi efektif benzoil eugenol sebagai agen antiinflamasi topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Inflamasi
1. Definisi Inflamasi adalah respon jaringan hidup sebagai reaksi lokal atas keberadaan benda asing, organisme hidup atau adanya luka. Reaksi ini meliputi berbagai proses yang kompleks terdiri dari deretan aktivasi enzim, pelepasan mediator, pengeluaran cairan, migrasi sel, pembongkaran dan perbaikan jaringan (Vane et al., 1996). Definisi inflamasi juga dilakukan oleh Sobota et al. (2000) yang mengatakan bahwa peradangan atau inflamasi adalah respon secara patofisiologi pada jaringan mamalia akibat terkena infeksi organisme, substansi kimia, luka fisik sehingga timbul bengkak yang diikuti akumulasi lokal cairan plasma dan sel darah. Rhen and Cidlowski (2005) mendefinisikan inflamasi sebagai respon reflektif tubuh terhadap infeksi, ikatan antibodi terhadap antigen di dalam tubuh, iritasi mekanik, atau luka dan kerusakan jaringan. Pengamatan yang lebih dekat pada daerah inflamasi menunjukkan terjadinya dilatasi pada pembuluh darah sehingga darah pada daerah tersebut lebih banyak, serta terjadi bendungan cairan lainnya yang menyebabkan daerah tersebut membengkak (Maffetone, 2002).
2. Mekanisme Pada gambar 1 menunjukkan mekanisme terjadinya inflamasi akibat adanya pelepasan mediator-mediator inflamasi oleh enzim siklooksigenase.
Fosfolipid yang terdapat di dalam membran dipecah oleh fosfolipase A
2 ketika
dipicu oleh adanya neurotransmiter, neuromodulator, dan neurohormon. Salah satu hasil pemecahan tersebut adalah asam arakidonat. Asam arakidonat merupakan substrat bagi enzim siklooksigenase untuk menghasilkan prostanoid berupa prostasiklin, tromboksan A
2 , prostaglandin E 2 , prostaglandin D 2 , dan prostaglandin F 2α (Fitzgerald and Patrono, 2001). Asam arakidonat masuk ke dalam siklooksigenase melewati knob hidrofobik yang merupakan penghubung antara protein ke membran. Asam arakidonat masuk ke dalam sisi aktif siklooksigenase, dimana terjadi penambahan dua molekul oksigen sehingga terbentuk prostaglandin endoperoksida (PGG
2 ).
Prostaglandin endoperoksida masuk ke dalam sisi aktif peroksidase dimana gugus heme membantu menghilangkan satu atom oksigen dari bentuk peroksida sehingga menjadi prostaglandin H (PGH ) yang meninggalkan enzim
2
2
siklooksigenase dan berperan dalam penggumpalan darah, sensitivitas nyeri, dan reaksi alergi (Gambar 2) (Amasino et al., 1996).
Gambar 2. Pembentukan prostaglandin H
2 dari substrat asam arakidonat oleh
enzim COX-2 (Amasino et al., 1996) Peristiwa utama yang terjadi pada proses inflamasi adalah adanya merah dan hangat. Vasodilatasi ini membuat sirkulasi darah menjadi melambat dan terjadi peningkatan permeabilitas vaskular meningkat sehingga terjadi stasis.
Kemudian terjadi marginasi leukosit dan keluarnya cairan yang menyebabkan terjadinya edema. Peristiwa penting yang kedua adalah terjadinya peningkatan permeabilitas vaskular sehingga menyebabkan kebocoran endotel. Peristiwa ini akan meningkatkan tekanan hidrostatik dan penurunan tekanan koloid osmotik protein (Harijadi, 2009).
3. Siklooksigenase-1 dan siklooksigenase-2 Siklooksigenase-1 dan siklooksigenase-2 merupakan isoform dari siklooksigenase yang memiliki struktur yang mirip satu sama lain.
Siklooksigenase-1 merupakan enzim konstitutif yang berperan dalam mengkatalisis pembentukan prostanoid regulatoris pada berbagai jaringan, terutama pada selaput lendir traktus gastrointestinal, ginjal, platelet dan epitel pembuluh darah. Sedangkan enzim COX-2 merupakan enzim indusibel yang ekspresinya dipicu oleh adanya stimuli radang, mitogenesis atau onkogenesis. Namun seiring perkembangan waktu, selain merupakan enzim indusibel, enzim ini termasuk dalam enzim konstitutif yang terdapat di berbagai jaringan, antara lain ginjal, pembuluh darah, paru-paru, tulang, pankreas, sumsum tulang belakang, dan selaput lendir lambung (Emran, 2002).
Menurut Dannhardt et al. (2000) senyawa yang termasuk dalam penghambat enzim COX-2 adalah senyawa yang bersifat lipofil dan asam. Secara struktural terdapat beberapa golongan inhibitor selektif COX-2, yaitu: (1) turunan karbosiklis dan heterosiklis yang terikat visinal dengan moieties aril (Gambar 3), (2) turunan diaril- atau aril/heteroaril-eter dan –tioeter, (3) turunan cis-stilben, serta (4) keton diaril dan aril/heteroaril. Senyawa yang terdiri dari dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh rantai pendek akan berpotensi untuk menghambat kerja enzim COX-2 dalam proses biosintesis prostaglandin (Dewhirst, 1980).
Gambar 3. Turunan karboksiklis dan heterosiklis yang terikat visinal dengan
moieties aril (Dannhardt et al., 2000) Gambar 4. Perbandingan penghambatan penempelan asam arakidonat pada COX- 2 dengan COX-1 saat diberikan obat yang selektif terhadap COX-2 Pada gambar 4 menunjukkan bahwa senyawa yang memiliki struktur yang lebih besar akan lebih selektif terhadap enzim COX-2 karena jarak ‘mulut’ enzim COX-2 yang lebih besar dibandingkan dengan COX-1 (Vane et al., 1996). Senyawa yang termasuk dalam penghambat selektif enzim COX-2 akan masuk melalui knob hidrofobik pada protein siklooksigense kemudian menduduki sisi aktif enzim dan berinteraksi dengan salah satu asam amino, valin 523 (Gambar 5) sehingga mencegah masuknya asam arakidonat yang mengakibatkan terhambatnya pelepasan mediator kimia inflamasi seperti prostaglandin (Amasino
et al., 1996). Senyawa-senyawa yang termasuk di dalamnya akan bekerja sebagai
antiradang yang setara dengan obat-obat antiinflamasi bukan steroid tetapi dengan toksisitas yang lebih ringan terhadap saluran gastrointestinal (Emran, 2002).
4. Gejala Secara garis besar, Kee et al. (1996) menyebutkan beberapa gejala yang dapat dikenali dalam proses inflamasi antara lain adanya rubor (kemerahan), edema (pembengkakan), kolor (panas), dolor (nyeri), dan functio laesa (hilangnya fungsi).
Rubor atau kemerahan biasanya merupakan hal pertama yang terlihat di
daerah yang megalami peradangan yang disebabkan adanya dilatasi pembuluh
Dengan darah kecil dalam daerah yang mengalami kerusakan (Kee et al., 1996).
vasodilatasi maka aliran darah yang menuju ke daerah tersebut akan semakin banyak
sehingga terlihat warna kemerahan dan panas yang dirasakan (Karch, 2003).Gejala paling nyata dari peradangan akut yang mungkin terjadi adalah
edema lokal. Gejala ini timbul karena adanya migrasi cairan dan sel-sel dari sirkulasi
darah ke jaringan-jaringan interstial. Campuran dari cairan dan sel yang tertimbun di
daerah peradangan disebut eksudat. Pada awal peradangan, sebagian besar isi dari
eksudat adalah cairan plasma, tetapi kemudian sel-sel darah putih akan meninggalkan
aliran darah kemudian tertimbun sebagai bagian dari eksudat (Price and Wilson,
1995).Dolor atau rasa sakit dari reaksi peradangan dapat disebabkan oleh adanya
perubahan pH lokal atau konsentrasi lokal ion-ion tertentu dapat merangsang ujung-
ujung nosiseptor. Pengeluaran zat kimia tertentu seperti histamin, prostaglandin, dan
Gangguan fungsi (fungsiolaesa), merupakan reaksi peradangan yang terlihat mudah untuk dimengerti, mengapa bagian yang bengkak terasa nyeri dan berfungsi secara abnormal. Namun, sebetulnya tidak diketahui secara mendalam bagaimana mekanisme terganggunya fungsi jaringan oleh adanya peradangan (Price et al., 1995).
B. Antiinflamasi
Obat Anti-Inflamasi Non Steroid (OAINS) populer dengan menghambat baik sistem enzim siklooksigenase maupun lipooksigenase intraseluler, yang nantinya akan berpengaruh pada respon inflamasi yang terjadi dan menurunkan produksi berbagai komponen prostaglandin (Babb, 1992). Penggunaan obat AINS jangka panjang memiliki efek pada gastrointestinal seperti dispepsia dan rasa nyeri pada abdomen, tidak jarang terjadi perforasi atau pendarahan pada lambung atau duodenum (Fitzgerald et al., 2001). Salah satu solusi untuk mencegah terjadinya iritasi lambung adalah dengan pemberian obat secara topikal. Selain mencegah terjadinya iritasi lambung, sistem penghantaran secara topikal bertujuan untuk menghindari berbagai masalah absorbsi pada saluran cerna seperti deaktivasi oleh enzim pencernaan. Pemberian obat melalui transdermal juga dapat meningkatkan bioavaibilitas dan efikasi obat dengan menghindari first-pass
elimination pada hati (Gunani, 2009).
aqueous agar permeasi optimal. Sekalipun kadar plasma dari pemberian OAINS
topikal relatif lebih rendah daripada pemberian OAINS secara oral, akan tetapi studi komparatif yang dilakukan dengan zat aktif diklofenak menunjukkan tidak terjadi perbedaan yang signifikan dengan rute pemberian oral maupun topikal dalam terapi osteoartritis (Moore, 2004).
C. Formalin Formalin adalah larutan formaldehid sekitar 37% yang larut dalam air.
Secara seketikan, formaldehid menghasilkan gugus hidroksimetil yang reaktif pada asam amino seperti lysine (K), arginine (R), tyrosine (Y), asparagine (N), histidine (H), glutamine (Q), and serine (S) (Sompuram, Vani, Messana, dan Bogen, 2004). Asam-asam amino tersebut berikatan dengan protein dan molekul besar. Formaldehid memiliki nilai koefisien difusi sebesar 0,79. Kecepatan penetrasi jaringan oleh formaldehid relatif cepat, kurang lebih 1 mm/jam (Goldstein et al., 2003). Kandungan unsur aldehida yang terdapat di dalam formalin akan mudah bereaksi dengan protein sehingga menyebabkan kematian sel ( Hasyim, Hamam, dan Akil , 2006).
Di masyarakat , formalin digunakan sebagai bahan pengawet bahkan disalahgunakan untuk mengawetkan makanan agar tidak mudah membusuk ( Hasyim et al. , 2006). Selain digunakan sebagai bahan pengawet, formalin dapat sebagai fase kedua. Selama fase kedua, formalin memicu terjadinya pelepasan serotonin, histamin, bradikinin, dan prostaglandin.
D.
Etil Asetat
Etil asetat merupakan salah satu pelarut non polar yang memiliki rumus kimia C
4 H
8 O 2 (Gambar 6). Senyawa ini tidak berwarna, larut dalam air dingin maupun hangat, aseton, dietil eter, alkohol, dan benzen.
O H
2 C H C O CH
3
3 Gambar 6. Struktur etil asetat
Etil asetat menguap pada suhu 77
C. Senyawa ini sangat berbahaya jika tertelan sehingga tidak dipergunakan untuk pelarut oral. Sifat iritasi dari etil asetat pada kulit sangatlah sedikit tetapi jika terjadi kontak kulit yang berlangsung berulang akan menyebabkan iritasi yang cukup serius (MSDS, 2008).
®
E. Virgin Coconut Oil (VCO)
HealthyCo Virgin Coconut Oil (VCO) diperoleh dari biji matang dan segar darikelapa secara mekanik maupun natural dengan atau tanpa pemanasan dan bahan tambahan apapun. Di dalam masyarakat, VCO bermanfaat untuk meningkatkan dilihat pada tabel I. Dari komponen-komponen yang tercantum dalam tabel I,
®
asam lemak yang paling dominan di dalam HealthyCo Extra Virgin Coconut Oil adalah asam laurat, yang mempunyai keunggulan dapat membentuk munolaurin di dalam tubuh (Enig, 2001).
®
Tabel I. Komposisi HealthyCo Extra Virgin Coconut Oil yang digunakan sebagai
kontrol negatif (Yunus, 2009)
Komposisi Jumlah
Gliserol Asam Laurat 48,74% Gliserol Asam Miristat 16,31% Gliserol Asam Kaprilat 10,91% Gliserol Asam Kaprat 8,10% Gliserol Asam Palmiat 7,38% Gliserol Asam Palmitoleat 5,56% Gliserol Asam Stearat 1,76% Gliserol Asam Kaproat 1,24% Vitamin E 3000 ppm F.
Eugenol
Eugenol (C
10 H
12 O 2 ) (Gambar 7) merupakan isomer dari posisi betelfenol
yang ditemukan di tanaman Myrtaceae dan Lauraceae. Eugenol berwarna kekuningan dan berbentuk cair (Gildemeister, 2009). ditemukan dalam bentuk glukosida yang dihasilkan dari proses hidrolisis, yaitu hasil fermentasi (Gildemeister, 2009).
Menurut Sadeghian et al. (2008), eugenol (4-alil-2-metoksifenol) merupakan senyawa alam yang menunjukkan aktivitas sebagai antispasmodik, antipiretik, antibakteri (Ayoola et al., 2008), dan antiinflamasi (Ozturk et al., 2005). Aktivitas antiinflamasi eugenol dengan beberapa mekanisme, antara lain: menghambat kemotaksis leukosit yang dimiliki oleh setiap senyawa fenolik (Azuma et al., 1986) dan menekan ekspresi COX-2 ( Magalhaes et al., 2010) pada makrofag RAW 264,7 (Otzurk et al., 2005).
Eugenol memiliki titik didih 253 C dan titik lebur sebesar -9
C. Senyawa yang berbau cengkeh ini mudah terbakar, memiliki kestabilan yang cukup tinggi tetapi akan mudah teroksidasi dengan adanya agen pengoksidasi yang kuat. Senyawa ini berbahaya bila ditelan dan memiliki LD
50 sebesar 2680 mg/kg BB tikus. (MSDS, 2007).
G.
Benzoil Eugenol
Benzoil eugenol (Gambar 8) merupakan senyawa derivat eugenol, senyawa atsiri dalam minyak tumbuhan cengkeh (Syzygium aromaticum L.) dan memiliki nama kimia 4-alil-2-metoksifenil benzoat (JECFA, 2005).
Benzoil eugenol memiliki rumus kimia C
17 H
16 O 3 dengan berat molekul
268,31 g/mol. Senyawa ini tidak larut dalam air, tetapi larut dalam minyak dan etanol, merupakan komponen yang tidak berwarna, tidak berbau, dan berasa pahit.
Umumnya senyawa ini sebagai flavouring agent (JECFA, 2009) dan secara in
vitro dapat menghambat aktivitas enzim 5-lipooksigenase (Sadeghian et al.,
2008).H. Penghantaran Obat secara Topikal
Obat yang diberikan secara transdermal akan masuk ke sirkulasi darah melalui difusi pasif dari lapisan terluar kulit hingga masuk ke dalam jaringan di bawah kulit. Tujuan pemberian obat secara topikal adalah untuk menghindari berbagai masalah absorbsi pada saluran cerna, seperti deaktivasi oleh enzim pencernaan dan iritasi lambung, dapat meningkatkan bioavaibilitas dan efikasi obat dengan menghindari first-pass elimination pada hati (Gunani, 2009).
I. Metode Pengujian Antiinflamasi
Metode yang dapat digunakan untuk menguji aktivitas antiinflamasi suatu senyawa antara lain mengukur eritema dan udem pada telinga hewan pengerat, uji edema pada kaki hewan pengerat, uji induksi artritis pada hewan pengerat (Evans and Williamson, 1996).
Telah dilakukan pengujian efek antiinflamasi dengan mengukur diameter edema pada kaki tikus yang diinduksi formalin 50µL 2,5%v/v setiap satu jam selama lima jam. Pengukuran diameter edema tersebut dilakukan menggunakan vernier caliper (Tanko et al., 2008).
J. Landasan Teori
Pada dasarnya, inflamasi merupakan respon secara patofisiologi pada jaringan mamalia akibat terkena infeksi organisme, substansi kimia, luka fisik
30 menit) merupakan fase inflamasi (Lu et al., 2009). Pada fase inflamasi, formalin memicu terjadinya pelepasan mediator inflamasi berupa serotonin, prostaglandin, histamin, dan bradikinin (Tanko et al., 2008). Respon perlindungan terhadap adanya kerusakan jaringan tersebut terkadang terlalu berlebihan dan dapat berbahaya sehingga perlu penanganan secara farmakologis (Mosaddek and Rashid, 2008).
Eugenol sebagai komponen utama dari minyak cengkeh telah terbukti memiliki aktivitas antiinflamasi dengan cara menghambat kemotaksis leukosit yang dimiliki oleh setiap senyawa fenolik (Azuma et al., 1986) dan menekan ekspresi COX-2 (Magalhaes et al., 2010). Eugenol memiliki banyak derivat yang dapat disintesis menjadi senyawa tunggal dengan aktivitas antiinflamasi. Eugenol yang mengalami benzoilasi akan menghasilkan derivat senyawa berupa benzoil eugenol. Benzoil eugenol dihasilkan melalui penambahan gugus benzoat sehingga menghasilkan struktur yang lebih besar sehingga kecenderungan untuk menduduki sisi aktif enzim sikloksigenase-2 yang memiliki struktur yang lebih besar lebih besar dibandingkan senyawa induknya, eugenol.
Menurut Dannhardt et al. (2000), senyawa yang bersifat lipofil dan asam dapat menghambat ekspresi enzim siklooksigenase. Salah satu golongan senyawa yang dilaporkan memiliki keselektifan terhadap enzim siklooksigenase-2 adalah dihubungkan oleh sebuah rantai pendek dapat menghambat biosintesis prostaglandin oleh enzim COX-2.
Benzoil eugenol merupakan senyawa yang memiliki dua cincin aromatis sehingga membuat senyawa tersebut bersifat lebih lipofil dibandingkan dengan eugenol yang hanya memiliki satu cincin aromatis. Selain itu, benzoil eugenol juga merupakan golongan senyawa karboksiklis dan heterosiklis yang terikat visinal dengan moieties aril. Dua cincin aromatis yang dimiliki oleh benzoil eugenol ini dihubungkan oleh rantai pendek karboksil. Dari uraian tersebut maka dapat diduga bahwa benzoil eugenol memiliki potensi sebagai antiinflamasi.
K.
Hipotesis
1. Pemberian benzoil eugenol secara topikal memiliki efek antiinflamasi terhadap edema kaki mencit yang diinduksi formalin 0,5%.
2. Benzoil eugenol memiliki persentase penghambatan inflamasi secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
3. Benzoil eugenol memiliki persentase daya antiinflamasi secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
4. Benzoil eugenol memiliki konsentrasi efektif sebagai agen antiinflamasi topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian yang berjudul “Efek Antiinflamasi Benzoil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss” merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. B. Variabel Penelitian Dalam penelitian yang berjudul “Efek Antiinflamasi Benzoil Eugenol
secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss” terdapat dua variabel, yaitu:
1. Variabel utama Variabel utama dalam penelitian ini meliputi:
b
a. Variabel bebas : konsentrasi benzoil eugenol (% / v )
b. Variabel tergantung : tebal edema kaki pada mencit (cm)
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali: 1) Subyek uji : mencit jantan galur Swiss
C. Definisi Operasional
1. Inflamasi merupakan respon kompleks lokal terhadap benda asing, misalnya bakteri atau pada keadaan tertentu terhadap bahan yang dihasilkan dari dalam tubuh.
2. Gejala inflamasi ditandai dengan rubor, kalor, dolor, edema, dan fungtio laesa.
Dalam hal ini yang diamati adalah edema (bengkak).
3. Benzoil eugenol adalah senyawa hasil sintesis dari bensil klorida dengan eugenol. Benzoil eugenol yang digunakan dalam penelitian ini telah melalui uji pembuktian senyawa dengan prosedur yang telah diverifikasi (Ramdani, 2011).
4. Waktu pemberian senyawa antiinflamasi dilakukan secara topikal setelah 1 jam dari pemberian agen inflamasi.
5. Pemberian secara topikal dilakukan dengan mengoleskan senyawa ke seluruh bagian edema kaki mencit dengan merata.
6. Tebal edema merupakan tebal telapak kaki yang diukur menggunakan jangka sorong merk Mitutoyo.
D. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
a. Hewan Uji Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan
®
b. Formalin 0,5% merk Bratachem
®
Formalin 0,5% merk Bratachem yang digunakan sebagai agen penginflamasi didapatkan dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
®
c. Eugenol merk Sigma Aldrich
®
Eugenol murni merk Sigma Aldrich yang digunakan sebagai kontrol positif didapatkan dari Laboratorium Kimia Organik Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
d. Benzoil eugenol Benzoil eugenol yang digunakan didapatkan dari hasil sintesis
Ramdani (2011) di Laboratorium Kimia Organik Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Senyawa ini telah melewati proses pengujian senyawa melalui elusidasi struktur di Universitas Gadjah Mada dengan prosedur yang telah diverifikasi.
®
e. Virgin Coconut Oil (VCO) merk HealthyCo