Pengaruh Ekstrak Etanol Kulit Buah Nanas (Ananas Comosus (L.) Merr.) Terhadap Glukosa Darah Dan Kadar Superoksida Dismutase (Sod) Pada Mencit Hiperglikemia Secara In Vivo

7 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uraian Tanaman

Di Indonesia, nanas ditanam di kebun-kebun, pekarangan, dan tempat-tempat lain yang cukup mendapat sinar matahari. Tanaman tahunan atau dua tahunan, terdapat tunas merayap pada bagian pangkalnya. Daun berkumpul pada roset akar dan pada bagian pangkalnya melebar menjadi pelepah. Helaian daun berbentuk pedang, tebal, liat, ujung lancip menyerupai duri, tepi berduri tempel yang membengkok ke atas, sisi bawah bersisik putih, berwarna hijau atau hijau kemerahan. Buah nanas merupakan gabungan buah-buah sejati yang dalam perkembangannya bergabung bersama-sama tongkol bunga majemuk menjadi satu buah besar. Perbanyakannnya saat ini lebih banyak secara vegetatif melalui penanaman “mahkota” buah. Buahnya bulat panjang, berdaging, berwarna hijau, jika masak warna menjadi kuning (Satya, 2013).

2.1.1 Sistematika Tanaman Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivisio : Spermatophyta Divisio : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Bromeliales Familia : Bromeliaceae Subfamilia : Bromelioideae

8 Genus : Ananas

Spesies : Ananas comosus (L) Merr. (Natural Resources Conservation Service, 2015) 2.1.2 Nama Daerah

Ekahauku, anes (Aceh), nas (Gayo), honas, hanas (Batak), gona (Nias), kanas, kanyas, nyanyas (Lampung), ganas (Sunda), nanas (Jawa), samblaka, malaka (Kalimantan), manas (Bali), panda (Sumba), manilmap, miniap (Irian Jaya) (Nuraini, 2011).

2.1.3 Nama Asing

Pineapple (Inggris), ananas 2.1.4 Kandungan Kimia

Kulit buah nanas mengandung senyawa metabolit sekunder fenol, flavonoid, saponin dan steroid/triterpenoid (Kalaiselvi, et al., 2012b). Buahnya mengandung vitamin A, C, betakaroten, kalsium, fosfor, magnesium, besi, natrium, kalium dan enzim bromelin. Daun dari tanaman nanas terbukti mengandung alkaloid, flavonoid, oligosakarida, dan polisakarida (Vuyyuru, et al., 2012)

2.1.5 Khasiat Tanaman

Kulit buah nanas dapat memodulasi aktivitas katalase dan lipid peroksidase pada tikus yang diinduksi alkohol (Okafor, et al., 2011). Kulit buah nanas juga dapat menurunkan kadar lipid peroksidase pada tikus yang diinduksi 7,12 dimethylbenz (α) anthracene (Kalaiselvi, et al., 2013). Buah nanas memiliki khasiat sebagai anti radang, mengganggu pertumbuhan sel kanker, mengahambat agregasi platelet dan mempunyai aktivitas fibrinolitik (Wibisono, 2011). Daun

9

nanas terbukti dapat menurunkan kadar gula darah tikus yang diinduksi streptozotocin (Vuyyuru, et al., 2012).

2.2Ekstraksi 2.2.1 Cara Dingin a. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan perendaman menggunakan pelarut yang sesuai dengan sesekali pengadukan pada temperatur ruangan (Depkes RI, 2000).

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses ini terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahapan maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan perkolat) (Depkes RI, 2000). 2.2.2 Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama 3-5 kali sehingga didapat proses ekstraksi sempurna (Depkes RI, 2000). b. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Depkes RI, 2000).

10 c. Digesti

Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50oC (Depkes RI, 2000).

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur (96-98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit) (Depkes RI, 2000).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 o) dan temperatur sampai titik didih air (Depkes RI, 2000).

2.3 Diabetes Mellitus

Diabetes Mellitus (DM) adalah suatu kelompok penyakit metabolik dimana terdapat adanya gangguan dalam metabolisme lemak, karbohidrat, dan protein akibat penurunan dalam sekresi insulin, sensitivitas insulin, atau keduanya (Triplitt, et al., 2008). Sindrom resistensi insulin adalah suatu kondisi dimana terjadi penurunan sensitivitas jaringan terhadap kerja insulin sehingga terjadi peningkatan sekresi insulin sebagai bentuk kompensasi sel β pankreas. Intoleransi glukosa merupakan salah satu manifestasi sindrom metabolik yang dapat menjadi awal suatu diabetes mellitus (Manaf, 2010). Diabetes mellitus (DM) mempunyai sindroma klinik yang ditandai adanya poliuria, polidipsia, dan polifagia, disertai peningkatan kadar glukosa darah atau hiperglikemia (kadar glukosa puasa ≥ 126

11

mg/dl atau postprandial ≥ 200 mg/dl atau glukosa sewaktu ≥ 200 mg/dl) (Triplitt, et al., 2008).

2.4 Klasifikasi Diabetes Mellitus

Klasifikasi diabetes mellitus berdasarkan etiologinya menurut American Diabetes Association (2008) meliputi:

a. DM tipe 1 adanya destruksi sel β langerhans pada pankreas, umumnya menjurus ke defisiensi insulin absolut, akibat kelainan autoimun (antibodi sel islet, antibodi insulin, dan antibodi asam glutamat dekarboksilase) atau idiopatik.

b. DM tipe 2, bervariasi mulai dari yang predominan resistensi insulin disertai defisiensi insulin relatif sampai yang predominan gangguan sekresi insulin bersama resistensi insulin.

c. DM tipe lain, akibat defek genetik fungsi sel β, defek genetik kerja insulin, penyakit eksokrin pankreas, endokrinopati, karena obat/zat kimia, infeksi, imunologi, sindroma genetik lain. Bentuk ini biasanya disebabkan oleh adanya malnutrisi disertai kekurangan protein. Dulu jenis ini disebut Diabetes Terkait Malnutrisi (MRDM), tetapi oleh karena patogenesis jenis ini tidak jelas maka tidak lagi disebut MRDM tetapi Diabetes Tipe Lain. d. Diabetes Kehamilan (Diabetes Gestasional), adalah diabetes yang timbul

selama kehamilan. Penderita DM gestasional kebanyakan memiliki homeostatis glukosa yang normal selama trimester pertama kehamilan dan mengalami defisiensi insulin relatif pada bulan keempat dan kelima. Pada

12

umumnya kadar glukosa darah kembali normal setelah melahirkan (Yuriska, 2009).

2.5Manifestasi Klinik Diabetes Mellitus

Gejala khas pada penderita DM antara lain poliuria (sering buang air kecil), polidipsia (sering haus), dan polifagia (banyak makan/mudah lapar) dengan atau tanpa keluhan penglihatan kabur, koordinasi gerak anggota tubuh terganggu dan berat badan menurun tanpa sebab yang jelas (ADA, 2008), cepat merasa lelah (fatigue),iritabilitas, dan pruritis (gatal-gatal pada kulit), lebih mudah terkena infeksi, sukar sembuh dari luka, daya penglihatan makin buruk (Depkes RI, 2005)

2.6 Manajemen Pengobatan Diabetes Mellitus

Langkah pertama dalam mengelola diabetes mellitus selalu dimulai dengan pendekatan non farmakologi, yaitu berupa perencanaan makan/terapi nutrisi medik, olahraga, dan penurunan berat badan. Bila dengan langkah tersebut sasaran terapi pengendalian DM belum tercapai, maka dilanjutkan dengan penggunaan obat atau intervensi farmakologis. Dalam melakukan pemilihan intervensi farmakologis perlu diperhatikan titik kerja obat sesuai dengan macam penyebab terjadinya hiperglikemia (Manaf, 2010).

13 a. Insulin Secretagogue

i. Sulfonilurea (misalnya: tolbutamid, klorpropamida, glibenklamida, gliklazida, glipizida, glikidon dan glimepirida)

Mekanisme kerja sulfonilurea dengan menstimulasi insulin dari sel β -pankreas. Sulfonilurea berikatan dengan reseptor sulfonilurea yang memiliki afinitas tinggi yang berkaitan dengan saluran K-ATP pada sel β-pankreas, akan menghambat efluks kalium sehingga terjadi depolarisasi kemudian membuka saluran Ca dan menyebabkan influks Ca sehingga meningkatkan pelepasan insulin. Di samping itu, sulfonilurea juga dapat meningkatkan kepekaan reseptor terhadap insulin di hati dan di perifer (Nolte dan Karam, 2010).

ii. Meglitinid (misal: Repaglinid)

Obat ini memodulasi pelepasan insulin dari sel β dengan mengatur efluks kalium melalui kanal kalium. Terdapat tumpang tindih tempat kerja molekularnya dengan sulfonilurea karena meglitinid memiliki dua tempat pengikatan yang sama dengan sulfonilurea dan satu tempat pengikatan yang berbeda (Nolte dan Karam, 2010).

iii. Derivat D-Fenilalanin (misal: Nateglinid)

Nateglinid merangsang pelepasan insulin secara cepat dan berlangsung sementara dari sel β melalui penutupan kanal K+

yang sensitif-ATP. Obat ini memiliki keuntungan dalam hal keamanan penggunaannya pada pasien dengan penurunan berat pada fungsi ginjal (Nolte dan Karam, 2010).

b. Biguanida (misalnya: metformin)

Berbeda dengan sulfonilurea, obat ini kerjanya dalam menurunkan kadar gula darah tidak tergantung pada sel β pankreas yang berfungsi. Metformin

14

bekerja dengan menurunkan glukoneogenesis di hati dan ginjal, perlambatan absorbsi glukosa dari saluran cerna dengan peningkatan konversi glukosa menjadi laktat oleh enterosit, stimulasi langsung glikolisis di jaringan dengan peningkatan bersihan glukosa dari darah dan penurunan kadar glukagon plasma (Nolte dan Karam, 2010).

c. Glukosidase-inhibitors (misalnya: akarbose dan miglitol)

Obat golongan ini bekerja dengan merintangi enzim alfa-glukosidase di mukosa duodenum, sehingga reaksi penguraian polisakarida menjadi monosakarida terhambat. Dengan demikian glukosa dilepaskan lebih lambat dan absorbsinya ke dalam darah juga kurang cepat, lebih rendah dan merata, sehingga puncak kadar gula darah dapat dihindarkan (Nolte dan Karam, 2010).

d. Thiazolidindion (misalnya: rosiglitazon dan pioglitazon)

Obat golongan ini bekerja dengan mengurangi resistensi insulin dan meningkatkan sensitivitas jaringan perifer untuk insulin (insulin sensitizers) (Nolte dan Karam, 2010).

e. Penghambat DPP-4 (dipeptidylpeptidase-4 blockers)

Obat golongan baru ini bekerja dengan menghambat enzim DPP-4 sehingga produksi hormon incretin tidak menurun. Adanya hormon incretin berperan utama dalam produksi insulin di pankreas dan pembentukan hormon GLP-1 (glukagon-like peptide-1) dan GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) di saluran cerna yang juga berperan dalam produksi insulin. Dengan penghambatan enzim DPP-4 akan mengurangi penguraian dan inaktivasi incretin, GLP-1 dan GIP, sehingga kadar insulin akan meningkat (Tan dan Rahardja, 2007).

15 2.7 Pankreas

Pankreas merupakan organ panjang dan besar, terletak pada bagian cekung (konkaf) duodenum dan meluas ke belakang peritoneum dari dinding posterior perut, menuju ke arah kiri mencapai hilus limpa (Leeson, et al. 1996). Pankreas adalah kelenjar campuran eksokrin-endokrin yang menghasilkan enzim pencernaan dan hormon. Enzim ditimbun dan dilepaskan oleh sel dari bagian eksokrin, yang tersusun dalam asini. Hormon disintesis oleh kelompok sel epitel endokrin, yang dikenal sebagai pulau langerhans (Junqueira dan Carneiro, 2007). Dalam pankreas terdapat 4 jenis sel endokrin, yakni:

a. sel alfa (α), yang memproduksi hormon glukagon dan proglucagon, menduduki pulau pankreas sekitar 20%.

b. sel-beta (β), yang memproduksi hormon insulin, C-peptide, proinsulin dan amylin, yang menduduki pulau pankreas sekitar 75%.

c. sel-D (δ), yang memproduksi somatostatin, memiliki massa sekitar 3-5 dari pulau pankreas.

d. sel-PP (Sel-F), yang memproduksi pancreatic polypeptide (PP), yang mungkin berperan pada penghambatan sekresi endokrin dan empedu (Nolte dan Karam, 2010).

2.8 Insulin

Insulin merupakan hormon yang terdiri dari rangkaian asam amino, dihasilkan oleh sel β pankreas. Dalam keadaan normal, bila ada rangsangan pada sel β pankreas, insulin disintesis dan kemudian disekresikan ke dalam darah sesuai kebutuhan tubuh untuk keperluan regulasi glukosa darah (Manaf, 2010).

16

Sintesis insulin dimulai dalam bentuk preproinsulin (precursor hormon insulin) pada retikulum endoplasma sel β. Dengan bantuan enzim peptidase, preproinsulin mengalami pemecahan sehingga terbentuk proinsulin, yang kemudian dihimpun dalam gelembung-gelembung (secretory vesicles) dalam sel tersebut. Disini, dengan bantuan enzim peptidase, proinsulin diurai menjadi insulin dan peptida-C (C-peptide) yang keduanya sudah siap untuk disekresikan secara bersamaan melalui membran sel (Manaf, 2010).

2.9 Aloksan

Pada uji farmakologi/bioaktivitas pada hewan percobaan, keadaan diabetes mellitus dapat diinduksi dengan cara pankreaktomi dan pemberian zat kimia. Zat kimia sebagai induktor (diabetogen) bisa digunakan aloksan, streptozotozin, diaksosida, adrenalin, glukagon, EDTA yang diberikan secara parenteral. Diabetogen yang lazim digunakan adalah aloksan karena obat ini cepat menimbulkan hiperglikemi yang permanen dalam waktu dua sampai tiga hari (Suharmiati, 2003).

Aloksan dapat diberikan secara parenteral seperti intravena, intraperitoneal atau subkutan pada hewan percobaan. Dosis aloksan yang diperlukan untuk menginduksi diabetes tergantung pada hewan percobaan yang digunakan, rute administrasi dan status nutrisi. Pemberian dosis secara intavena yang biasa digunakan untuk menginduksi diabetes pada tikus adalah 65 mg/kg bb, sedangkan secara intraperitoneal atau subkutan dosis efektifnya harus 2-3 kali lebih tinggi (Szkudelski, 2001).

17

Setelah pemberian aloksan, akan terlihat 4 fase dari fluktuasi kadar glukosa darah sebagai berikut (Lanzen, 2008):

a. fase hipoglikemia yang terjadi dalam waktu 30 menit setelah injeksi aloksan. Hal ini terjadi karena penghambatan glukokinase yang menyebabkan penghambatan fosforilasi glukosa. Penghambatan ini akan menyebabkan penurunan konsumsi dan peningkatan ketesediaan ATP yang kemudian akan menyebabkan stimulasi sekresi insulin.

b. fase kedua dimulai dengan peningkatan dari kadar glukosa darah dan penurunan kadar insulin plasma. Fase hiperglikemia pertama ini terjadi sekitar 1 jam setelah pemberian diabetogen dan bertahan kurang lebih 2-4 jam.

c. terjadi fase hipoglikemia kembali. Biasanya terjadi 4-8 jam setelah pemberian dan akan bertahan selama beberapa jam. Keadaan hipoglikemia ini terkadang sangat parah sampai menyebabkan kejang dan bahkan fatal tanpa pemberian glukosa. Keadaan hipoglikemia transisi ini dihasilkan akibat dari keluarnya insulin dari dalam sel β langerhans pankreas akibat kerusakan sel-sel tersebut.

d. fase ini merupakan fase hiperglikemia diabetik. Secara morfologis, telah terjadi degranulasi yang sempurna dan hilangnya integritas dari sel β Langerhans pankreas. Fase ini dapat terlihat pada 12-48 jam setelah pemberian.

18 2.10Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang memperlambat atau menghambat stress oksidatif pada molekul target. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi 3 kelompok, yaitu antioksidan primer, antioksidan sekunder dan antioksidan tersier (Winarsi, 2007).

a. Antioksidan Primer

Antioksidan primer disebut juga antioksidan endogenus atau antioksidan enzimatis. Antioksidan primer berperan sebagai hydrogen donors, yaitu dengan jalan memberikan atom hidrogen pada radikal peroksida yang terbentuk selama tahap inisiasi. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih stabil. Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase (GSH-Px) (Winarsi, 2007).

Tubuh dapat menghasilkan enzim antioksidan yang aktif bila didukung oleh nutrisi pendukung atau mineral yang disebut kofaktor, diantaranya tembaga, seng, selenium, mangan dan besi. Enzim ini memiliki berat molekul 30.000 atau lebih (Evans, 1991).

b. Antioksidan Sekunder

Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau antioksidan non-enzimatis. Perbedaan utama antioksidan primer dengan sekunder adalah antioksidan sekunder tidak mengubah radikal bebas menjadi molekul yang lebih stabil. Fungsi antioksidan sekunder adalah meningkatkan aktivitas antioksidan primer. Antioksidan sekunder berperan sebagai chelator untuk ion logam (metal

19

deactivator), menon-aktifkan singlet oxygen, menyerap radiasi ultraviolet, atau berperan sebagai oxygen scavanger (Ayucitra, et al., 2011).

Antioksidan non-enzimatik dapat berupa antioksidan alami maupun sintesis. Senyawa antioksidan alami pada umumnya berupa vitamin C, vitamin E, karotenoid, senyawa fenolik, dan polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kuomarin, tokoferol, dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, katekin, flavonol, dan kalkon (Kumalaningsih, 2006). Sedangkan antioksidan sintetik yang umum digunakan misalnya butil hidroksianisol (BHA), butil hidroksitoluen (BHT), propil galat (PG), and tert-butilhidrokuinon (TBHQ) yang digunakan pada konsentrasi rendah dalam makanan (Shahidi dan Zhong, 2005).

c. Antioksidan Tersier

Kelompok antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas (Winarsi, 2007).

2.11Superoksida Dismutase (SOD)

SOD adalah antioksidan intraselular utama dalam sel aerobik. SOD berada di otak, hati, sel darah merah, ginjal, tiroid, testis, otot jantung, mukosa lambung, kelenjar pituitari, pankreas dan paru-paru (Evans, 1991). SOD adalah metaloenzim yang mengkatalis dismutasi radikal anion superoksida (O2-) menjadi hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen (O2) di dalam mitokondria. Selanjutnya H2O2 di dalam mitokondria akan mengalami detoksifikasi oleh enzim katalase

20

menjadi senyawa H2O dan O2, sedangkan H2O2 yang berdifusi ke dalam sitosol akan didetoksifikasi oleh enzim glutation peroksidase (Ihnat, et al., 2007). Mekanisme pertahanan antioksidan ditunjukkan pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Mekanisme pertahanan antioksidan endogen Superoksida dismutase, Katalase dan Glutation peroksidase terhadap radikal bebas (Pandey dan Rizvi, 2010).

Ada 3 bentuk SOD yang terdapat pada manusia dimana ketiganya ditemukan dalam kompartemen tubuh yang berbeda.

a. Cu/Zn-SOD atau SOD1

Cu/Zn-SOD menggunakan copper atau zinc sebagai kofaktor. Gen SOD1 atau Cu/Zn-SOD terletak pada kromosom 21. SOD1 ditemukan pada sitoplasma, nukleus dan intermembran mitokondria. Pada manusia, mutasi SOD1 bertanggung jawab pada penyakit neurodegeneratif (contohnya amyotrophic lateral sclerosis) yang dihubungkan dengan kerusakan oksidatif. Pada mencit, mutasi

21

SOD1berhubungan dengan peningkatan apoptosis dan kerusakan oksidatif protein. SOD1 mempunyai peran penting dalam pertahanan dan pertumbuhan sel dimana enzim ini terlibat dalam respon sel terhadap berbagai sumber stress (Alfonso, 2007).

Cu/Zn-SOD merupakan salah satu antioksidan endogen yang sangat berperan dalam mengkatalisasi radikal bebas anion superoksida yang sangat reaktif menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen yang kurang reaktif. Cu/Zn-SOD dipercaya memainkan peranan utama dalam baris pertama pertahanan antioksidan (Mates, et al., 1999).

b. Mn-SOD atau SOD2

SOD2 (Mn-SOD) menggunakan mangan sebagai kofaktor. Gen SOD2 terdapat pada kromosom 6. SOD2 ditemukan dalam mitokondria dan mempunyai peran vital dalam perlindungan melawan spesies oksigen reaktif (ROS). Kekurangan SOD2 menyebabkan peningkatan kadar O2- pada mitokondria. Penurunan aktivitas SOD2 juga merupakan salah satu faktor resiko kardiomiopati (Alfonso, 2007). Pada jaringan, Mn-SOD terdapat satu setengah dari jumlah Cu/Zn SOD (Mates, et al., 1999).

c. EC-SOD (Extracellular-SOD) atau SOD3

Sama seperti Cu/Zn-SOD, EC-SOD menggunakan copper atau zinc sebagai kofaktor. Gen SOD3 terletak pada kromosom 4. SOD3 terutama ditemukan dalam kompartemen ekstraseluler (plasma, limfa, cairan serebrospinal dan cairan sendi). Mutasi SOD3 dapat meningkatkan resiko penyakit kardiovaskular (Alfonso, 2007).

22 2.12Imunohistokimia

Imunohistokimia adalah suatu teknik untuk mendeteksi keberadaan berbagai macam komponen yang terdapat di dalam sel atau jaringan dengan menggunakan prinsip reaksi ikatan antigen (Ag) dan antibodi (Ab). Teknik imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim spesifik serta mendeteksi keberadaan berbagai komponen aktif yang terdapat di dalam sel atau jaringan seperti protein dan karbohidrat (Furuya, et al., 2004). Terdapat dua metode pewarnaan imunohistokimia, yaitu metode langsung (direct) dan metode tidak langsung (indirect). Metode langsung hanya menggunakan satu antibodi, yaitu antibodi primer yang telah dilabel. Metode tidak langsung menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi primer tanpa dilabel dan antibodi sekunder yang telah dilabel (Polak dan VanNoorden, 2003). Namun metode tidak langsung lebih sering digunakan karena mempunyai tingkat sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode langsung (Ramos dan Vara, 2005).

Pada metode imunohistokimia langsung, antibodi harus diberi label yang sesuai. Sediaan jaringan diinkubasi dengan antibodi untuk beberapa waktu sehingga antibodi tersebut berinteraksi dengan dan terikat pada protein x. Sediaan itu kemudian dibilas untuk menghilangkan antibodi. Sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya atau elektron tergantung label yang dipakai (senyawa fluoresen, enzim, partikel emas) (Junqueira dan Carneiro, 2007).

Metode imunohistokimia tak langsung lebih sensitif namun membutuhkan lebih banyak langkah (Junqueira dan Carneiro, 2007). Pada metode imunohistokimia tak langsung, antibodi yang digunakan untuk mendeteksi suatu marker pada sel tidak dilabel. Antibodi ini dikenal dengan sebutan antibodi

23

primer. Namun pada metoda ini bukan berarti tidak membutuhkan antibodi yang berlabel. Hal ini tetap dibutuhkan tetapi yang dilabel adalah anti imunoglobulin atau yang dikenal dengan antibodi sekunder (Sudiana, 2005).

18 2.10Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang memperlambat atau menghambat stress oksidatif pada molekul target. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi 3 kelompok, yaitu antioksidan primer, antioksidan sekunder dan antioksidan tersier (Winarsi, 2007).

a. Antioksidan Primer

Antioksidan primer disebut juga antioksidan endogenus atau antioksidan enzimatis. Antioksidan primer berperan sebagai hydrogen donors, yaitu dengan jalan memberikan atom hidrogen pada radikal peroksida yang terbentuk selama tahap inisiasi. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih stabil. Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase (GSH-Px) (Winarsi, 2007).

Tubuh dapat menghasilkan enzim antioksidan yang aktif bila didukung oleh nutrisi pendukung atau mineral yang disebut kofaktor, diantaranya tembaga, seng, selenium, mangan dan besi. Enzim ini memiliki berat molekul 30.000 atau lebih (Evans, 1991).

b. Antioksidan Sekunder

Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau antioksidan non-enzimatis. Perbedaan utama antioksidan primer dengan sekunder adalah antioksidan sekunder tidak mengubah radikal bebas menjadi molekul yang lebih stabil. Fungsi antioksidan sekunder adalah meningkatkan aktivitas antioksidan primer. Antioksidan sekunder berperan sebagai chelator untuk ion logam (metal

19

deactivator), menon-aktifkan singlet oxygen, menyerap radiasi ultraviolet, atau

berperan sebagai oxygen scavanger (Ayucitra, et al., 2011).

Antioksidan non-enzimatik dapat berupa antioksidan alami maupun sintesis. Senyawa antioksidan alami pada umumnya berupa vitamin C, vitamin E, karotenoid, senyawa fenolik, dan polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kuomarin, tokoferol, dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, katekin, flavonol, dan kalkon (Kumalaningsih, 2006). Sedangkan antioksidan sintetik yang umum digunakan misalnya butil hidroksianisol (BHA), butil hidroksitoluen (BHT), propil galat (PG), and tert-butilhidrokuinon (TBHQ) yang digunakan pada konsentrasi rendah dalam makanan (Shahidi dan Zhong, 2005).

c. Antioksidan Tersier

Kelompok antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas (Winarsi, 2007).

2.11Superoksida Dismutase (SOD)

SOD adalah antioksidan intraselular utama dalam sel aerobik. SOD berada di otak, hati, sel darah merah, ginjal, tiroid, testis, otot jantung, mukosa lambung, kelenjar pituitari, pankreas dan paru-paru (Evans, 1991). SOD adalah metaloenzim yang mengkatalis dismutasi radikal anion superoksida (O2-) menjadi hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen (O2) di dalam mitokondria. Selanjutnya H2O2 di dalam mitokondria akan mengalami detoksifikasi oleh enzim katalase

20

menjadi senyawa H2O dan O2, sedangkan H2O2 yang berdifusi ke dalam sitosol akan didetoksifikasi oleh enzim glutation peroksidase (Ihnat, et al., 2007). Mekanisme pertahanan antioksidan ditunjukkan pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Mekanisme pertahanan antioksidan endogen Superoksida dismutase, Katalase dan Glutation peroksidase terhadap radikal bebas (Pandey dan Rizvi, 2010).

Ada 3 bentuk SOD yang terdapat pada manusia dimana ketiganya ditemukan dalam kompartemen tubuh yang berbeda.

a. Cu/Zn-SOD atau SOD1

Cu/Zn-SOD menggunakan copper atau zinc sebagai kofaktor. Gen SOD1 atau Cu/Zn-SOD terletak pada kromosom 21. SOD1 ditemukan pada sitoplasma, nukleus dan intermembran mitokondria. Pada manusia, mutasi SOD1 bertanggung jawab pada penyakit neurodegeneratif (contohnya amyotrophic lateral sclerosis) yang dihubungkan dengan kerusakan oksidatif. Pada mencit, mutasi

21

SOD1berhubungan dengan peningkatan apoptosis dan kerusakan oksidatif protein. SOD1 mempunyai peran penting dalam pertahanan dan pertumbuhan sel dimana enzim ini terlibat dalam respon sel terhadap berbagai sumber stress (Alfonso, 2007).

Cu/Zn-SOD merupakan salah satu antioksidan endogen yang sangat berperan dalam mengkatalisasi radikal bebas anion superoksida yang sangat reaktif menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen yang kurang reaktif. Cu/Zn-SOD dipercaya memainkan peranan utama dalam baris pertama pertahanan antioksidan (Mates, et al., 1999).

b. Mn-SOD atau SOD2

SOD2 (Mn-SOD) menggunakan mangan sebagai kofaktor. Gen SOD2 terdapat pada kromosom 6. SOD2 ditemukan dalam mitokondria dan mempunyai peran vital dalam perlindungan melawan spesies oksigen reaktif (ROS). Kekurangan SOD2 menyebabkan peningkatan kadar O2- pada mitokondria. Penurunan aktivitas SOD2 juga merupakan salah satu faktor resiko kardiomiopati (Alfonso, 2007). Pada jaringan, Mn-SOD terdapat satu setengah dari jumlah Cu/Zn SOD (Mates, et al., 1999).

c. EC-SOD (Extracellular-SOD) atau SOD3

Sama seperti Cu/Zn-SOD, EC-SOD menggunakan copper atau zinc sebagai kofaktor. Gen SOD3 terletak pada kromosom 4. SOD3 terutama ditemukan dalam kompartemen ekstraseluler (plasma, limfa, cairan serebrospinal dan cairan sendi). Mutasi SOD3 dapat meningkatkan resiko penyakit kardiovaskular (Alfonso, 2007).

22 2.12 Imunohistokimia

Imunohistokimia adalah suatu teknik untuk mendeteksi keberadaan berbagai macam komponen yang terdapat di dalam sel atau jaringan dengan menggunakan prinsip reaksi ikatan antigen (Ag) dan antibodi (Ab). Teknik imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim spesifik serta mendeteksi keberadaan berbagai komponen aktif yang terdapat di dalam sel atau jaringan seperti protein dan karbohidrat (Furuya, et al., 2004). Terdapat dua metode pewarnaan imunohistokimia, yaitu metode langsung (direct) dan metode tidak langsung (indirect). Metode langsung hanya menggunakan satu antibodi, yaitu antibodi primer yang telah dilabel. Metode tidak langsung menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi primer tanpa dilabel dan antibodi sekunder yang telah dilabel (Polak dan VanNoorden, 2003). Namun metode tidak langsung lebih sering digunakan karena mempunyai tingkat sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode langsung (Ramos dan Vara, 2005).

Pada metode imunohistokimia langsung, antibodi harus diberi label yang sesuai. Sediaan jaringan diinkubasi dengan antibodi untuk beberapa waktu sehingga antibodi tersebut berinteraksi dengan dan terikat pada protein x. Sediaan itu kemudian dibilas untuk menghilangkan antibodi. Sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya atau elektron tergantung label yang dipakai (senyawa fluoresen, enzim, partikel emas) (Junqueira dan Carneiro, 2007).

Metode imunohistokimia tak langsung lebih sensitif namun membutuhkan lebih banyak langkah (Junqueira dan Carneiro, 2007). Pada metode imunohistokimia tak langsung, antibodi yang digunakan untuk mendeteksi suatu marker pada sel tidak dilabel. Antibodi ini dikenal dengan sebutan antibodi

23

primer. Namun pada metoda ini bukan berarti tidak membutuhkan antibodi yang berlabel. Hal ini tetap dibutuhkan tetapi yang dilabel adalah anti imunoglobulin atau yang dikenal dengan antibodi sekunder (Sudiana, 2005).