Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia Mangostana.L) Terhadap Perubahan Makroskopis, Mikroskopis dan Tampilan Immunohistokimia Antioksidan Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) Pada Ginjal Mencit Jantan (Mus Musculus.L) Stra

Pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit buah Manggis

(Garcinia Mangostana.L) terhadap perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan Copper Zinc Superoxide Dismutase

(Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan (Mus musculus.L) strain DDW yang di papari oleh Monosodium glutamate (MSG)

dibandingkan dengan vitamin E

TESIS

Oleh: Lestari Mukti

107008013

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2013

Pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit buah Manggis

(Garcinia Mangostana.L) terhadap perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan Copper Zinc Superoxide Dismutase

(Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan (Mus musculus.L) strain DDW yang di papari oleh Monosodium glutamate (MSG)

dibandingkan dengan vitamin E

TESIS

Diajukan Untuk Melengkapi Persyaratan Memperoleh Gelar Magister Biomedik Pada Program Studi Magister Ilmu Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara

oleh : Lestari Mukti

107008013

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2013

Judul : Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia Mangostana.L) Terhadap Perubahan Makroskopis, Mikroskopis dan Tampilan Immunohistokimia Antioksidan Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) Pada Ginjal Mencit Jantan (Mus Musculus.L) Strain DDW Yang di Papari Oleh Monosodium Glutamate (MSG) Dibandingkan Dengan Vitamin E

Nama mahasiswa : Lestari Mukti Nomor Pokok : 107008013

Program Studi : S2 Ilmu Biomedik Minat studi : Farmakologi

Menyetujui Komisi Pembimbing

dr. Betty.,M.Ked.(PA), Sp.PA (Ketua)

dr. Datten Bangun, MSc., SpFK (Anggota)

Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik

Dr. Yahwardiah Siregar, PhD NIP 19550807 198503 2001

Dekan

Prof. dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD, KGEH NIP 19540220 198011 1001

Telah diuji pada

Tanggal : 26 Juli 2013

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : dr. Betty.,M.Ked.(PA), Sp.PA Anggota : dr. Datten Bangun, MSc., SpFK

: dr. Lidya Imelda Laksmi., M. Ked.(PA), Sp.PA : Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP

ABSTRAK Pendahuluan :

Ekstrak kulit manggis (Garcinia Mangostana L) yang selama ini telah banyak digunakan masyarakat sebagai obat, salah satunya sebagai antioksidan untuk mencegah radikal bebas. Penggunaan MSG sebagai penyedap dalam makanan telah dilaporkan mempunyai efek toksik terhadap ginjal yang dapat menurunkan fungsi ginjal dan menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid sehingga menimbulkan stres oksidatif. Pemberian EEKM secara oral diharapkan dapat menurunkan efek radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas EEKM sebagai antioksidan pada mencit yang dipapari dengan MSG. Metode :

Metode penelitian yang digunakan adalah metoda eksperimental yang dilakukan terhadap mencit jantan dengan 5 kelompok perlakuan dan 5 ulangan. Kelompok (P0): kontrol aquadest 0,3 ml/mencit/hari dari hari 1-35, (P1): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan hari ke 22-35 tanpa perlakuan. (P2): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-22 dan hari ke 22-35 pemberian EEKM 600mg/kg BB mencit/hari, (P3): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan pada hari ke-22-35 pemberian vitamin E 0,2 mg/g BB mencit/hari, dan (P4): EEKM sebanyak 600 mg/kg BB mencit/hari selama 14 hari.

Hasil penelitian :

Hasil penelitian menunjukkan pemberian MSG menyebabkan kerusakan makroskopis ginjal walaupun secara tidak bermakna (p>0,05), namun menyebabkan kerusakan mikroskopis pada ginjal secara bermakna (p<0,05) dan dapat diperbaiki dengan pemberian EEKM secara bermakna (p<0,05). MSG dapat menurunkan tampilan immunohistokimia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal secara bermakna (p<0,05), namun tampilan immunohistokimia copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ini dapat ditingkatkan secara bermakna dengan pemberian EEKM (p<0,05).

Kesimpulan:

Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa EEKM dapat berfungsi sebagai antioksidan dan dapat memperbaiki kerusakan jaringan ginjal secara mikroskopis. Kata kunci: Monosodium Glutamat, Ekstrak etanol kulit manggis (EEKM),

ABSTRACT Introduction :

Extract of Mangosteen rind (Garcinia Mangostana L) is widely used as a medicine, one of them as antioxidants to prevent the effect of free radicals. The use of MSG as a flavoring in food have been reported have a toxic effects in the kidney caused decreased kidney function and increased lipid peroxidation leading to oxidative stress. Giving ethanolic extract of mangosteen rind orally sugested reduce effects of free radicals. This study aimed to know the effectiveness ethanolic extract of mangosteen rind as antioxidants in mice given MSG.

Method :

This is an experimental investigation, using mice. The mice divided into 5 groups. First group (P0) was a control group only given distilled water 0.3 ml/mouse/day on 1-35 days, (P1):was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days no treatment. (P2): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days given ethanolic extract of mangosteen rind 600 mg/kg bw/day, (P3): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and on 22-35 days of vitamin E 0.2 mg/g bw/day, and (P4):only given mangosteen rind extracts as much as 600 mg/kg bw/day for 14 days.

Result :

The results showed MSG in the given dose produced macroscopic damage to the kidney although not significant (p>0.05), but microscopically significant (p<0.05) and with ethanolic extract of mangosteen rind could be repaired significantly (p<0,05). MSG could suppress the immunohistochemistry appearance of copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) in the kidney significantly (P<0.05), but with ethanolic extract of mangosteen rind this appearance improved significantly (p<0,05).

Conclusion:

In this experiments, it was found that the ethanolic extracts of the mangosteen rind could repair the damage in the kidney induced by MSG, microscopicallay and also improved the immunohistochemistry appearance .

Keywords:

Monosodium Glutamate, Ethanolic extract of Mangosteen rind, vitamin E, Cu Zn SOD.

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis sampaikan kehadirat Allah SWT atas berkat, rahmat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan tesis yang berjudul ” Pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit buah Manggis (Garcinia Mangostana.L) terhadap perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan (Mus musculus.L) strain DDW yang di papari oleh Monosodium glutamate (MSG) dibandingkan dengan vitamin E”. Penulisan tesis ini merupakan salah satu persyaratan dalam memperoleh Gelar Magister pada Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.

Proses penulisan tesis ini tidak terlepas dari bimbingan, bantuan, dukungan, doa dan perhatian dari berbagai pihak, pada kesempatan ini ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada yang terhormat:

1. Bapak Prof. dr. Gontar A. Siregar, SpPD-KGEH., Dekan Fakultas Kedokteran dan Ibu dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D., Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. 2. Ibu dr. Betty.,M.Ked.(PA), Sp.PA selaku Ketua Komisi Pembimbing dan

Ibu dr. Datten Bangun, MSc., SpFK selaku anggota Komisi Pembimbing yang senantiasa bersedia meluangkan waktu untuk membimbing, memberi masukan, motivasi dan pemikiran dengan penuh kesabaran kepada penulis dalam menyelesaikan tesis ini.

3. Ibu dr. Lidya Imelda Laksmi., M. Ked.(PA), Sp.PA selaku ketua Komisi Pembanding dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin, MP selaku anggota Komisi Pembanding yang telah banyak memberi masukan dan saran untuk perbaikan dalam penyelesaian tesis ini.

4. Terima kasih yang tulus penulis ucapkan kepada Ayahanda H. Imam dan Ibunda Alm Hj. Lasimah, serta mami mertua Hj. Ratna Juita berkat doa dan dukungan yang selalu menyertai dalam kehidupan sehingga mampu melindungi dan menghantarkan penulis dalam meraih cita-cita. Terima kasih kepada suami tercinta Rudi Putra, Dipl, atas segala kesabaran, doa, pengertian dan pengorbanan dalam mendukung cita-cita penulis selama proses pendidikan, Ananda Elang Samudra yang menjadi penyemangat untuk segera menyelesaikan pendidikan, keluarga besar Kakanda Sri Rejeki, AMK dan Kompol Husni serta keluarga besar Adinda drh. Agus Rahayu yang selalu memberikan dukungan selama penulis menjalani pendidikan di Sekolah Pasca sarjana Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. 5. Pimpinan dan seluruh staf Laboratorium Fisiologi Hewan Jurusan Biologi

FMIPA, Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan, yang menyediakan tempat dan membantu penulis untuk penelitian dalam menyelesaikan tesis ini.

6. Bapak Bupati Aceh Timur dan Bapak Direktur RSUD IDI Kabupaten Aceh Timur, yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk

mengikuti pendidikan pada Sekolah Pasca sarjana Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. 7. Seluruh staf pengajar, tenaga administrasi dan semua rekan-rekan

mahasiswa khususnya angkatan 2010 di lingkungan Progran Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan, yang telah banyak memberikan bimbingan, arahan, motivasi dan bantuan selama penulis mengikuti pendidikan.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih perlu mendapat koreksi dan masukan untuk kesempurnaan. Oleh karena itu Penulis berharap adanya kritik serta saran untukpenyempurnaan tulisan ini. Akhir kata penulis berharap kiranya tesis ini dapat bermanfaat bagi kita semua dan menambah wawasan bagi yang membaca. Amin

Medan, Juli 2013

Penulis Lestari Mukti

DAFTAR RIWAYAT HIDUP A. Identitas Diri

Nama : Lestari Mukti

Tempat / tgl lahir : Wonosobo, 12 September 1979

Agama : Islam

Alamat : Gang Sedar No 64, Sriwijaya, Kuala Simpang, Aceh Tamiang

Telp/Hp : 085262509099

Email : Lestari.Mukti43@yahoo.com

B. Riwayat pendidikan

SD Simpang III Pasaman : Tamat Tahun 1991 SMPN Simpang III Pasaman : Tamat Tahun 1994 SMF Prayoga Padang : Tamat Tahun 1997 Universitas Andalas Padang : Tamat Tahun 2004

C. Riwayat pekerjaan

DAFTAR ISI

Halaman ABSTRAK...

ABSTRACT... KATA PENGANTAR... DAFTAR RIWAYAT HIDUP...

i ii iii vi

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR GAMBAR ... xi

DAFTAR TABEL... xii

DAFTAR SINGKATAN... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

BAB 1 PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang ... 1.2. Perumusan Masalah ... 1.3. Tujuan Penelitian... 1.3.1 Tujuan Umum ... 1.3.2 Tujuan Khusus... 1.4. Hipotesis ... 1.5. Manfaat Penelitian ... 1 6 6 6 7 7 8 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ... 9

2.1. Monosodium Glutamat ... 2.2. Garcinia mangostana L. ... 2.3. Radikal Bebas ... 2.4. Antioksidan ... 2.5. Vitamin E ... 2.6. Ginjal... 2.7. Kerangka Teori...

9 13 18 20 22 24 33

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ... 34 3.1. Desain Penelitian ...

3.2.Tempat dan Waktu Penelitian ... 3.3. Populasi Dan Sampel ... 3.3.1 Populasi Penelitian... 3.3.2 Sampel Penelitian... 3.4. Kriteria Sampel ... 3.4.1 Kriteria Inklusi... 3.4.2 Kriteria Eksklusi... 3.5. Variabel Penelitian ... 3.5.1 Variabel Bebas... 3.5.2 Variabel Tergantung... 3.6. Kerangka Operasional ... 3.7. Definisi Operasional ... 3.8. Bahan Dan Alat Penelitian ...

34 34 34 34 35 36 36 36 36 36 36 37 38 44

BAB 4

BAB 5

3.9. Etika Penelitian ... 3.10.Pelaksanaan Penelitian... 3.10.1 Persiapan Dan Pemeliharaan Hewan Percobaan…. 3.10.2 Prosedur Pembedahan Hewan mencit ….……...…. 3.10.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Manggis……….. 3.10.4 Prosedur Pembuatan Preparat Histologi Ginjal

Mencit……….

3.10.5 Prosedur Pewarnaan Haematoxylin Eosin………... 3.10.6 Prosedur Pewarnaan Immunohistokimia Copper

Zinc SOD... 3.11. Analisa Data...

HASIL DAN PEMBAHASAN... 4.1 Pemeriksaan Makroskopis Ginjal ... 4.2 Pemeriksaan Mikroskopis Ginjal ... 4.3.Tampilan Pewarnaan Immunohistokimia Cu Zn SOD...

KESIMPULAN DAN SARAN... 5.1. Kesimpulan... 5.2. Saran... 45 45 45 46 47 48 49 50 51 53 53 56 61 67 67 68

DAFTAR GAMBAR

Gambar Judul Halaman

2.1. Rumus bangun Monosodium glutamat... 9

2.2. Garcinia Mangostana Linn…………………. 14

2.3. Struktur inti Xanthone ………... 16

2.4. Struktur ROS……….……….……… 18

2.5. Rumus bangun α- Tokoferol ……….…… 22

2.6. Anatomi ginjal normal………... 25

2.7. Struktur nefron………...……… 26

2.8. Histologi glomerulus ginjal………...…… 27 2.9. 2.10. 2.13 4.1 4.2 4.3 4.4

Gambaran histologi kortek ginjal normal..………….…... Gambaran histologi ginjal yang terpapar MSG...…….…….

Kerangka teori ……….…. Gambar kurva berat ginjal……….

Gambar makroskopis ginjal………...

Gambar mikroskopis ginjal………...

Tampilan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD ……..

30 31 33 53 55 57 62

DAFTAR TABEL

Tabel Judul Halaman

3.1. Dosis pemberian ekstrak kulit manggis pada kelompok

perlakuan ... 46 4.1.

4.2. 4.3.

Hasil pengamatan kerusakan ginjal secara makroskopis... Hasil pengamatan kerusakan ginjal secara mikroskopis... Tampilan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD ginjal...

56 58 63

DAFTAR SINGKATAN

ADI α- AMPA CPK Cu Zn SOD DPPH EC SOD EEKM FAO FDA GM GOT GPx GRAS GST HE IFIC KA LDH Mn SOD MSG NMDA

Acceptable Daily Intake

amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor Creatinine Phosphokinase

Cooper Zinc Superoxide Dismutase 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl Extracellular Sod

Ekstrak etanol kulit manggis Food Additive Asosiatian Food and Drugs Administration Garcinia Mangostana. L

Glutamat Oxaloacetate Transaminase Gluthation Peroxidase

Generally Recognized As Safe Gluthation S Transferase Hematoxylin Eosin

International Food Information Council foundation Kainite Receptor

Lactate Dehydrogenase Mangan SOD

Monosodium Glutamate N-methyl-D-aspartate

NTA Ni SOD ROS SOD

Strain DDW WHO

Nekrosis Tubular Akut Nickel SOD

Reactive Oxygen Species Superoxide Dismutase

Strain Double Distsch Webster World Health Organization

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 2 3 4

5 6

7 8 9

10

Judul

Surat identifikasi tumbuhan

Surat keterangan penelitian Fakultas Farmasi Surat Ethical Clearance hewan percobaan.

Surat keterangan izin penelitian laboratorium Fisiologi FMIPA USU

Proses pembuatan ekstrak etanol kulit manggis Dokumentasi pemeliharaan dan perlakuan hewan percobaan

Sertifikat analisa vitamin E Dokumentasi prosessing jaringan

Dokumentasi proses pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD

ABSTRAK Pendahuluan :

Ekstrak kulit manggis (Garcinia Mangostana L) yang selama ini telah banyak digunakan masyarakat sebagai obat, salah satunya sebagai antioksidan untuk mencegah radikal bebas. Penggunaan MSG sebagai penyedap dalam makanan telah dilaporkan mempunyai efek toksik terhadap ginjal yang dapat menurunkan fungsi ginjal dan menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid sehingga menimbulkan stres oksidatif. Pemberian EEKM secara oral diharapkan dapat menurunkan efek radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas EEKM sebagai antioksidan pada mencit yang dipapari dengan MSG. Metode :

Metode penelitian yang digunakan adalah metoda eksperimental yang dilakukan terhadap mencit jantan dengan 5 kelompok perlakuan dan 5 ulangan. Kelompok (P0): kontrol aquadest 0,3 ml/mencit/hari dari hari 1-35, (P1): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan hari ke 22-35 tanpa perlakuan. (P2): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-22 dan hari ke 22-35 pemberian EEKM 600mg/kg BB mencit/hari, (P3): MSG 8 mg/g BB mencit/hari dari hari 1-21 dan pada hari ke-22-35 pemberian vitamin E 0,2 mg/g BB mencit/hari, dan (P4): EEKM sebanyak 600 mg/kg BB mencit/hari selama 14 hari.

Hasil penelitian :

Hasil penelitian menunjukkan pemberian MSG menyebabkan kerusakan makroskopis ginjal walaupun secara tidak bermakna (p>0,05), namun menyebabkan kerusakan mikroskopis pada ginjal secara bermakna (p<0,05) dan dapat diperbaiki dengan pemberian EEKM secara bermakna (p<0,05). MSG dapat menurunkan tampilan immunohistokimia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal secara bermakna (p<0,05), namun tampilan immunohistokimia copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ini dapat ditingkatkan secara bermakna dengan pemberian EEKM (p<0,05).

Kesimpulan:

Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa EEKM dapat berfungsi sebagai antioksidan dan dapat memperbaiki kerusakan jaringan ginjal secara mikroskopis. Kata kunci: Monosodium Glutamat, Ekstrak etanol kulit manggis (EEKM),

ABSTRACT Introduction :

Extract of Mangosteen rind (Garcinia Mangostana L) is widely used as a medicine, one of them as antioxidants to prevent the effect of free radicals. The use of MSG as a flavoring in food have been reported have a toxic effects in the kidney caused decreased kidney function and increased lipid peroxidation leading to oxidative stress. Giving ethanolic extract of mangosteen rind orally sugested reduce effects of free radicals. This study aimed to know the effectiveness ethanolic extract of mangosteen rind as antioxidants in mice given MSG.

Method :

This is an experimental investigation, using mice. The mice divided into 5 groups. First group (P0) was a control group only given distilled water 0.3 ml/mouse/day on 1-35 days, (P1):was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days no treatment. (P2): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and 22-35 days given ethanolic extract of mangosteen rind 600 mg/kg bw/day, (P3): was given MSG 8 mg/g bw/day on 1-21 days and on 22-35 days of vitamin E 0.2 mg/g bw/day, and (P4):only given mangosteen rind extracts as much as 600 mg/kg bw/day for 14 days.

Result :

The results showed MSG in the given dose produced macroscopic damage to the kidney although not significant (p>0.05), but microscopically significant (p<0.05) and with ethanolic extract of mangosteen rind could be repaired significantly (p<0,05). MSG could suppress the immunohistochemistry appearance of copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) in the kidney significantly (P<0.05), but with ethanolic extract of mangosteen rind this appearance improved significantly (p<0,05).

Conclusion:

In this experiments, it was found that the ethanolic extracts of the mangosteen rind could repair the damage in the kidney induced by MSG, microscopicallay and also improved the immunohistochemistry appearance .

Keywords:

Monosodium Glutamate, Ethanolic extract of Mangosteen rind, vitamin E, Cu Zn SOD.

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari molekul atau sel lain. Radikal bebas mempunyai banyak bentuk seperti radikal hidroksil, peroksil, anion superoxidea, dan lain-lain (Murray, et al., 2003). Apabila radikal bebas terdapat dalam jumlah yang berlebihan maka akan terjadi stres oksidatif dimana terjadi ketidak seimbangan antara jumlah radikal bebas terhadap oksidan intra sel. Stres oksidatif yang berlangsung terlalu lama dapat menimbulkan kerusakan mulai dari tingkat molekul DNA, protein, lipid, sampai dengan kerusakan pada tingkat selular, jaringan, dan organ yang menyebabkan disfungsi, jejas sel (cell injury), degenerasi, penurunan fungsi, dan akhirnya dapat memicu terjadinya penyakit degeneratif dan memperpendek umur biologis atau penuaan serta kematian sel (Wresdiyati, 2006). Radikal bebas berasal dari hasil metabolisme tubuh dan faktor eksternal seperti asap rokok, hasil penyinaran ultra violet, zat kimiawi dalam makanan dan polutan lain.

Monosodium Glutamat (MSG) merupakan salah satu jenis bahan kimiawi yang sering ditambahkan di dalam makanan. Penambahan bahan kimiawi dalam makanan ini mempunyai berbagai tujuan, salah satunya adalah sebagai penyedap rasa. Pada tahun 1908, Kikunae Ikeda, seorang professor dari universitas di Tokyo, menemukan kunci kelezatan itu pada kandungan asam glutamat.

Penemuan ini melengkapi 4 jenis rasa sebelumnya yaitu asam, manis, asin dan pahit dengan umami dari akar kata umai (Ardyanto, 2004). MSG berasal dari ganggang laut (Laminaria japonica), MSG ini pertama kali di isolasi dalam bentuk kristal dan di indentifikasi sebagai asam amino glutamate yang dapat meningkatkan rasa lezat pada makanan (Tawfik, et al., 2012). Glutamat merupakan asam amino alami yang merupakan komponen utama dari protein dan peptide pada jaringan. MSG mengandung 78% asam glutamat dan 22% natrium dan air (Inuwa, et al., 2011).

Taiwan adalah negara yang paling tinggi mengkonsumsi MSG yaitu 3 gram per-kapita per-hari, sedangkan di negara Amerika merupakan negara yang paling rendah mengkonsumsi MSG yaitu hanya sekitar 0,5 gram kapita per-hari. Angka rata-rata konsumsi MSG di Indonesia sekitar 0,6 g/hari. Kadar MSG yang dikonsumsi tergantung pada isi kandungan MSG sendiri di dalam makanan dan pilihan rasa seseorang yaitu sekitar 0,1-0,8% dari makanan yang disajikan (Simanjuntak, 2010). Pada tahun 1959, Food and Drug Administration di negara Amerika mengelompokkan MSG sebagai generally recognized as safe (GRAS), sehingga tidak perlu pengaturan khusus. Tetapi tahun 1968, muncul laporan tentang keluhan beberapa gangguan setelah makan di restoran China, sehingga keluhan tersebut disebut sebagai Chinese Restaurant Syndrome. Karena kompisisinya dianggap signifikan dalam masakan itu, MSG diduga sebagai penyebabnya, tetapi belum dibuktikan secara ilmiah (Ardyanto, 2004), sehingga Food Additive Asosiatian (FAO) dan WHO mengelompokkan MSG sebagai Food Additive (zat tambahan makanan) dengan Acceptable Daily Intake (ADI) sebesar

120 mg/kg BB/hari. Nilai ambang keamanan ini harus diperhatikan oleh setiap konsumen MSG agar tidak melebihi jumlah konsumsinya (Elpiana, 2012).

Penelitian yang dilakukan oleh Vinodini, et al. (2010), menyatakan bahwa pemberian MSG 4 g/kgBB secara intra peritoneal dapat menyebabkan menurunnya fungsi ginjal dan menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid sehingga menimbulkan stres oksidatif. Thomas, et al. (2009), menyebutkan MSG juga dapat menginduksi stres oksidatif pada eritrosit, hepar, ginjal, jantung dan otak.

Ginjal merupakan organ yang berpasangan yang terletak pada dinding perut posterior, mempunyai fungsi utama untuk merubah metabolit beracun dan produk limbah dari darah serta mengatur jumlah cairan dan keseimbangan elektrolit dalam tubuh (Eweka, et al., 2007; Tawfik, et al., 2012). Tiap-tiap ginjal terdiri dari 1-4 juta unit filtrasi fungsional yang disebut nefron yang terdiri dari: glomerulus, tubulus kontortus proksimalis, loop of Henle, dan tubulus kontortus distalis (Junqueira, 2007).

Pada manusia umumnya obat dimetabolisme oleh hepar dan ginjal, tetapi fungsi utama dari ginjal adalah ekskresi. Ginjal merupakan organ yang cukup rentan terkena dampak keracunan karena ginjal mengekskresikan banyak produk metabolisme yang bersifat toksik, oleh karena itu sangat berguna untuk memeriksa efek MSG pada ginjal (Eweka, et al., 2007). Selain itu ginjal juga terpapar langsung dengan plasma darah melalui fenestrae terbuka pada kapiler glomerulus dan memetabolisme banyak zat toksin sehingga konsentrasi toksin

menjadi ratusan kali lebih besar pada ginjal dibanding organ lain (Abass, et al., 2011).

Untuk mencegah atau mengurangi penyakit kronis karena radikal bebas diperlukan antioksidan. Antioksidan ada dua jenis yaitu antioksidan eksogen seperti vitamin C, vitamin E dan antioksidan endogen yang disebut antioksidan intra sel yang berbentuk enzim. Enzim antioksidan yang terdapat dalam sel meliputi catalase, glutathione peroksidase dan superoxide dismutase (SOD). Berdasarkan adanya logam yang berperan sebagai kofaktor maka SOD ini terdiri dari mangan SOD (Mn SOD), Copper Zinc SOD (Cu Zn SOD) dan Nickel SOD (Ni SOD) dan berdasarkan tempat distribusinya maka terdapat pula extracellular SOD (EC SOD). Copper Zinc Superoxide Dismutase (Cu Zn SOD) merupakan salah satu antioksidan endogen yang berperan utama dalam mengkatalisis radikal bebas anion superoxidea menjadi hydrogen peroksida dan molekul oksigen (Mates, et al., 1999 dalam Wresdiyati, et al., 2010).

Vitamin E (α tocoferol) merupakan vitamin yang larut dalam lemak yang bekerja sebagai antioksidan yang bekerja dengan cara memutus rantai sehingga dapat melindungi sel dari peroksidasi lipid (Tawfik, et al., 2012). Selain vitamin C dan vitamin E, beberapa flavonoid yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan terbukti berkhasiat sebagai antioksidan. Salah satu tanaman yang diketahui berfungsi sebagai antioksidan adalah kulit buah manggis (Garcinia mangostana. Linn), yang merupakan family Clusiaceae (Guttiferae) (Akao, et al., 2008). Buah manggis mempunyai rasa yang manis, dengan campuran rasa sedikit asam dan beraroma wangi, dagingnya putih, lunak serta gurih, sehingga buah manggis

dikenal juga sebagai ratu buah. Kulit manggis (pericarp) tebal, keras dan berwarna ungu tua. Buah ini telah banyak digunakan dalam pengobatan pada beberapa negara di Asia Tenggara seperti Indonesia, Malaysia, Srilanka, Philipina dan Thailand. Masyarakat luas menggunakan ekstrak etanol kulit manggis dalam mengatasi diare, penyembuhan luka infeksi, nyeri perut, peradangan serta berbagai penyakit (Chaivisuthangkura, et al., 2008).

Penelitian fitokimia yang telah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa kulit buah manggis kaya akan senyawa xanthones yang mempunyai berbagai aktivitas biologi seperti antioksidan, anti bakteri, anti jamur, anti tumor, anti agregasi platelet dan anti trombotik. (Shan, et al., 2011; Akao, et al., 2008 dan Sato, et al., 2004). Ekstrak kulit buah manggis mengandung senyawa-senyawa yang diduga mempunyai potensi sebagai antioksidan tetapi yang menunjukkan aktivitas poten adalah 8- hidroksikudraxanton, gartanin, alpha mangostin, gamma mangostin dan smeathxanton A (Jung, et al., 2006). Penelitian oleh Weecharangsan, et al. (2006), menunjukan bahwa ekstrak etanol kulit manggis yang diekstraksi dengan pelarut air, etanol 50% dan 95% dan etil asetat yang diperiksa dengan metoda 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ternyata mempunyai aktivitas antioksidan dengan mekanisme penangkapan radikal bebas dan penelitian yang dilakukan oleh Moongkarndi, et al. (2004) menyebutkan bahwa ekstrak kulit buah manggis merupakan antioksidan kuat yang bekerja dengan cara menghambat secara signifikan produksi Reactive Oxygen Species (ROS) intraseluler.

Penelitian mengenai potensi ekstrak kulit buah manggis sebagai anti oksidan telah banyak dilakukan. Namun demikian, belum dilakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap kandungan Cu Zn SOD pada organ tubuh khususnya di ginjal. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh ekstrak kulit buah manggis terhadap kandungan antioksidan intrasel copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal mencit secara immunohistokimia.

1.2. Perumusan Masalah

Adakah pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit manggis terhadap perubahan gambaran makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ginjal mencit jantan strain DDW setelah diberi MSG dibandingkan dengan vitamin E.

1.3. Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol kulit manggis (EEKM) terhadap perubahan makroskopik, mikroskopik dan tampilan immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) pada ginjal mencit jantan strain DDW setelah dipapari oleh MSG dibandingkan dengan vitamin E.

1.3.2. Tujuan Khusus

1. Untuk mengetahui pengaruh pemberian EEKM terhadap perubahan berat, warna dan konsistensi pada ginjal mencit jantan strain DDW yang dipapari oleh MSG dan di bandingkan dengan vitamin E.

2. Untuk mengetahui pengaruh pemberian EEKM terhadap mikroskopis ginjal mencit jantan strain DDW yang papari oleh MSG dibandingkan dengan vitamin E yang dinilai dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin. 3. Untuk mengetahui pengaruh pemberian EEKM terhadap tampilan

immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) sel ginjal mencit jantan strain DDW yang papari oleh MSG dibandingkan vitamin E.

1.4.Hipotesis

Terdapat perbedaan terhadap gambaran makroskopik, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan endogen copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ginjal mencit yang dipapari MSG yang mendapat perlakuan pemberian ekstrak etanol kulit manggis.

1.5.Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi ilmiah mengenai ekstrak etanol kulit manggis (Garcinia mangostana Linn.) dan dapat dijadikan pertimbangan bagi masyarakat untuk menggunakan ekstrak etanol kulit manggis sebagai antioksidan untuk mencegah radikal bebas yang disebabkan oleh MSG. 2. Berguna sebagai acuan untuk penelitian selanjutnya untuk

BAB 2

TINJAUAN KEPUSTAKAAN

2.1 Monosodium Glutamat

Gambar 2.1 Rumus bangun Monosodium glutamat (Inuwa, 2011)

Monosodium glutamat (MSG) berupa serbuk kristal putih dengan rumus

molekul C5H8NNaO4, berat molekul 187,13, mempunyai sifat kelarutan 74 g/100 ml air (sangat mudah larut dalam air), tetapi tidak bersifat higroskopis

dan praktis tidak larut dalam pelarut organik umum seperti eter (Wikipedia, 2012). MSG mengandung 78% asam glutamat, 22% sodium dan 1%

air (Eweka, 2011).

Glutamat alami yang berbentuk L- glutamic acid pertama kali ditemukan pada tahun 1866 oleh Karl Ritthausen seorang peneliti Jerman yang mengisolasinya dari tepung gluten. Garam asam glutamat pertama kali ditemukan oleh Kikunae Ikeda pada tahun 1908 dan mengidentifikasi rasa umami dari asam glutamat serta berhasil mengisolasi asam glutamat dari tumbuhan laut (genus laminaria) atau disebut “konbu” di Jepang yang memiliki cita rasa yang khas yang disebut umami yaitu suatu elemen rasa yang dijumpai pada elemen alamiah

seperti kaldu dimana karakteristik umami berupa sedap, lezat dan enak berbeda

dengan empat rasa yang lain yaitu pahit, manis, asin, dan asam (Jinap, et al., 2010).

Glutamat juga dibentuk oleh tubuh dan berikatan dengan asam amino lain untuk membentuk struktur protein. Apabila glutamat berikatan dengan molekul protein menjadi tidak berasa dan tidak akan menimbulkan rasa umami pada makanan, namun hidrolisa protein oleh pemanasan selama proses pemasakan akan menyebabkan pelepasan glutamat sehingga glutamat menjadi bentuk bebas yang dapat menimbulkan rasa umami. Glutamat dalam bentuk bebas banyak ditemukan dalam bahan makanan seperti keju, daging dan sayuran, kedelai, jamur, teh hijau dan kol bahkan air susu ibu juga mengandung glutamat. Konsentrasi glutamat yang paling tinggi terdapat pada tomat matang 140 mg/100g dan keju parmesan 1200 mg/100g (Jinap, et al., 2010; Khropycheva, et al., 2009). MSG banyak digunakan pada masakan Cina dan Asia tenggara yang dikenal dengan nama ajinomoto, sasa, vet-sin, miwon, atau weichaun.

Tubuh memetabolisme glutamat yang berasal dari MSG dengan cara yang sama dengan terhadap glutamat alami. Tubuh hanya akan mengenali glutamat, tetapi tidak dapat membedakan dari mana asalnya, apakah berasal dari keju, tomat, jamur, atau berasal dari MSG (Jinap, et al., 2010).

MSG diabsorbsi sangat cepat didalam saluran cerna dan menyebabkan meningkatnya kadar glutamat dalam plasma darah (Abbas, et al., 2011). Dalam sirkulasi MSG akan berdisosiasi menjadi natrium dan L- glutamat, L-glutamat akan melewati mesothelial peritoneal sel dan tiba di aliran darah melalui suatu

sistem transportasi menggunakan ATP. sebagian L- glutamat akan berkonjugasi di dalam sel dan akan mengalami proses eliminasi dan sebagian lagi akan berubah menjadi glutamin (Abass, et al ., 2011)

Reseptor glutamat ada 2 jenis, ionotropik dan metabotropik. Reseptor Jenis ionotropik (terkait kanal ion) ada tiga, yaitu N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA), α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor (AMPA) and kainite receptor (KA). Reseptor NMDA ini banyak ditemukan diotak yaitu pada bagian cortex cerebral dan hippocampus, selain itu ditemukan juga pada jaringan ekstraneuronal seperti sel beta pankreas, saluran urogenital pria bagian bawah, ginjal dan limfosit (Gao, et al., 2007; Abass, et al., 2011).

Glutamat memicu reseptor NMDA dengan efek membuka reseptor sehingga terjadi pembukaan kanal ion Ca+2 , ion kalsium yang masuk akan mengaktifkan enzim enzim seperti protease, lipase dan endonuklease yang dapat berpengaruh terhadap posfolipid yang merupakan penyusun membran sel (Kumar, et al., 2004), proses ini disertai pelepasan radikal oksigen bebas berbentuk radikal superoxide (O2.-), oleh SOD akan dirubah menjadi bentuk H2O2, dengan adanya logam Fe2+ melalui reaksi Fenton akan terbentuk radikal hidroksi (OH-) dan diakhiri dengan peroksidasi lipid, peroksidasi protein dan kerusakan DNA, sehingga menyebabkan peroksidasi membran sel yang kemudian pecah dan

isi sel mengalir keluar dan mengalami kematian sel akibat nekrosis (Gao, et al., 2007; Abass, et al ., 2011).

Konsumsi MSG sangat kecil pengaruhnya terhadap kadar glutamat didalam air susu ibu dan tidak bisa menembus plasenta (International Food

Information Council Foundation). Pada tahun 1958 Menurut FDA MSG masuk dalam kategori “generally recognized as safe” (GRAS), sama seperti bahan tambahan lain seperti garam, cuka dan baking powder (IFIC Foundation), sehingga tahun 1970 FDA menetapkan batas aman konsumsi MSG 120 mg/kg berat badan/hari yang disetarakan dengan konsumsi garam (Ardyanto, 2004).

Bila penggunaanya dalam jumlah besar dan lama MSG dapat menimbulkan berbagai macam gejala berupa rasa kebas, jantung berdebar-debar, mual dan sakit kepala, gejala ini kemudian dikenal dengan Chinese restaurant syndrome (Attia, et al., 2008). Oleh karena itu penelitian terhadap efek MSG banyak dilakukan, dari penelitian yang dilakukan oleh Inuwa, et al., 2011, masyarakat Nigeria menggunakan MSG selain sebagai penyedap juga digunakan sebagai pemutih pakaian untuk menghilangkan noda dari pakaian, dari sini timbul pemikiran bahwa zat pemutih bisa saja berefek berbahaya pada jaringan dan organ pada tubuh yang menyebabkan penyakit bila di konsumsi sebagai penyedap makanan, didapatkan hasil bahwa MSG dengan dosis 200 mg, 300 mg dan 400 mg selama empat minggu menimbulkan efek toksikologi pada ginjal yang ditandai dengan peningkatan kadar ureum dan kreatinin.

Penelitian yang dilakukan oleh Bertolin, et al, (2011), menemukan bahwa pemberian MSG dengan dosis 4 mg/g BB secara intra peritoneal memperlihatkan bahwa MSG merupakan zat yang reaktif dalam menginduksi lipid peroksidasi yang menghasilkan malondialdehyd yang dideteksi menggunakan Thiobarbituric test. Selain itu pemberian MSG 830 mg/kg BB selama 28 hari memperlihatkan

perubahan pada jaringan ginjal seperti adanya pembengkakan pada endothelium glomerulus dan atropi glomerulus (Abbas, et al., 2011)

2.2 Garcinia Mangostan Linn

Buah manggis dapat diklasifikasikan dalam golongan divisi: Spermatophyta (tumbuhan berbiji); subdivisi: Angiospermae (berbiji tertutup); kelas: Dicotyledonae (biji berkeping dua); famili: Guttiferae; genus: Garcinia; dan spesies: Garcinia Mangostana L.

Manggis dengan nama Latinnya Garcinia mangostana Linn (GM) dikenal juga sebagai Queen of the Tropical Fruits di luar negeri. Tanaman ini pertama kali ditemukan di Burma dan Thailand, merupakan tanaman tropis dengan tinggi pohon antara 7-25 meter (Misra, et al., 2009). Manggis dibudidayakan di hutan hujan tropis pada beberapa negara di Asia Tenggara seperti Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Filipina, dan Thailand. Masyarakat di berbagai negara ini telah menggunakan kulit GM sebagai obat tradisional untuk pengobatan sakit perut, diare, disentri, luka yang terinfeksi dan gastritis kronis (Doi, et al., 2009). Penelitian lain telah menunjukkan bahwa ekstrak GM memiliki aktifitas antioksidan, anti tumor, anti alergi, anti inflamasi, anti bakteri, dan anti virus.

Kulit buah manggis mengandung berbagai senyawa seperti mangostin, tannin, Xanthon, crysanthemin, garcinone, gartanin, vitamin B1, B2, terpen, anthocyanin, phenol dan zat bioaktif lainnya (Moongkarndi, et al., 2004; Shan, et al., 2011). Diduga yang mempunyai aktifitas farmakologi adalah golongan Xanthone yang terdiri dari α-mangostin, - mangostin dan - mangostin (Doi, et al., 2009). Xanthone merupakan senyawa polifenol alami yang terdapat di dalam tanaman, dan telah disintesis secara luas dan memiliki efek antioksidan (Mahabusarakam, et al., 2000).

Xanthone atau xanthen-9H-one merupakan senyawa organik dengan rumus molekul C13H8O2 merupakan salah satu metabolit sekunder yang banyak ditemui pada beberapa tanaman tingkat tinggi, jamur dan lichen. Inti dari xanthone adalah 9-xanthene atau Dibenzo-c-pyrone. Xanthone di klasifikasikan dalam lima kelompok yaitu: (a) simple oxygenated xanthones; (b) xanthone glycosides; (c) prenylated xanthones; (d) xanthoneolignoids; dan (e) xanthone jenis lain (Chaverri, et al., 2006).

Ada sekitar 50 jenis xanthone yang terdapat dalam pericarp buah manggis beberapa di antaranya adalah α-Mangostin, -Mangostin -Mangostin, Garcinone A, Garcinone B, Garcinone C, Garcinone D, Garcinone E, Garcimangosone A (Chaverri, et al., 2006). Jung, et al. (2006), berhasil mengidentifikasi kandungan ekstrak xanthone yang terlarut di dalam diklorometana, berupa dua xanthone yang sudah teroksidasi yaitu 8-hidroksikudraksanton G, dan mangostingon7-metoksi-2(3-metil-2-butenil)-8-(3-metil-2-okso-3-butenil)-1,3,6 trihidroksiksanton dan 12 xanthone lainnya yaitu: (1) Kudraksanton G, 8-deoksigartanin; (2)

Garsimangostin; (3) Garsinon; (4). Garsinon-E; (5) Gartanin; (8) 1-isomangostin; (9) Alfamangostin; (10) Gamma-mangostin; (11) Mangostinon smeathxanthone A; dan (12) Tovofillin A. Struktur kimia dari kandungan ekstrak etanol kulit manggis terdapat pada gambar 2.3.

Gambar 2.3. Struktur inti Xanthone dan beberapa rumus kimia kandungan pericarp Garcinia Mangostana Linn

Mekanisme kerja senyawa xanthone ini adalah dengan cara menghambat produksi ROS intraseluler secara signifikan (Moongkarndi, et al., 2004). Penelitian Chomnawang, et al. (2007), menyebutkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mempunyai aktivitas antioksidan yang signifikan yang diukur dengan penghambatan pembentukan radikal dengan metoda DPPH dan menghasilkan bahwa ekstrak etanol kulit manggis mampu menghambat 50% pembentukan radikal dan juga mereduksi produksi ROS dengan menghambat radikal superoxide (O2-). Selain itu juga dapat menangkap radikal hidroksil (OH-), tetapi kerjanya lebih kuat dalam menghambat radikal superoxide (Kosem, et al., 2007). Evaluasi terhadap α mangostin sebagai antioksidan juga dilakukan dengan cara percobaan terhadap tikus yang diberi isopretenolol 150 mg/kg BB selama dua hari untuk menginduksi infark miokardia memperlihatkan penurunan enzim antioksidan seperti gluthation S transferase (GST), gluthation peroxidase (GPx) dan Superoxide dismutase (SOD) dan peningkatan serum enzim seperti lactate dehydrogenase (LDH), cretinine phosphokinase (CPK), glutamat oxaloacetate transaminase (GOT) serta lipid peroxidase, di samping itu pada pemeriksaan histologi menunjukan adanya nekrotik pada jaringan dengan infiltrasi neutrofil, setelah diberi α mangostin 200 mg/kg BB selama enam hari menunjukkan perubahan yang signifikan hingga dapat disimpulkan bahwa α mangostin mempunyai efek sebagai protektif lipid peroksidasi dan antioksidan (Chavveri, et al., 2008).

2.3 Radikal Bebas

Radikal bebas atau oksidan adalah molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit terluarnya. Oleh karena itu untuk menstabilkan diri maka mempunyai kecendrungannya memperoleh elektron dari substansi lain menjadikan radikal bebas sangat reaktif (Murray, et al., 2003). Radikal bebas terdapat dalam tubuh dengan berbagai cara, umumnya akibat proses biokimiawi, antara lain hasil samping dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernafas, metabolisme sel, olahraga berlebihan, peradangan, atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan berupa asap kendaraan, asap rokok, bahan pencemar dan radiasi matahari.

Radikal yang sangat berpengaruh terhadap proses biologi adalah yang berasal dari oksigen dan disebut reactive oxygen species (ROS). Oksigen memiliki dua elektron tidak berpasangan di orbital terpisah di kulit terluarnya. Struktur elektronik membuat oksigen sangat rentan terhadap pembentukan radikal. Kelompok ROS terdiri dari: (i) superoxide anion; (ii) peroxide (hydrogen peroxide); dan (iii) hydroxyl radical (Bowen, 2003). (gambar 2.4)

Gambar 2.4 Struktur ROS (Bowen, 2003)

Radikal bebas dapat merusak senyawa yang penting untuk mempertahankan integritas sel, yaitu :

1. Asam lemak, khususnya asam lemak tak jenuh yaitu fosfolipid, glikolipid yang merupakan komponen penting penyusun membran sel. Asam lemak tak jenuh sangat rawan terhadap serangan-serangan radikal, terutama radikal hidroksil. Radikal hidroksil dapat menimbulkan reaksi rantai yang dikenal dengan nama peroksidasi lipid

2. Protein, Oksidan dapat merusak asam amino yang merupakan penyusun protein, seperti sistein yang mengandung gugusan sulfidril (SH) yang paling peka terhadap radikal hidroksil sehigga terbentuk ikatan disulfida (-S-S-) menimbulkan ikatan intra atau antar molekul sehingga protein tersebut kehilangan fungsi biologisnya.

3. DNA, Radikal bebas dapat menimbulkan berbagai perubahan pada DNA berupa hidroksilasi basa timin dan sitosin, pembukaan inti purin dan pirimidin serta terputusnya rantai fosfodiester DNA yang berakibat timbulnya mutasi, apabila mutasi ini mengenai gen-gen tertentu yang disebut onkogen, maka mutasi tersebut dapat menimbulkan kanker Senyawa kimia dan reaksi kimia yang menghasilkan spesies oksigen yang bersifat toksis disebut prooksidan sedangkan senyawa yang menekan pembentukannya disebut antioksidan. Dalam sel yang normal terjadi keseimbangan antara prooksidan dan antioksidan, tetapi pada keadaan tertentu keseimbangan ini bergeser kearah prooksidan karena produksi spesies oksigen meningkat, keadaan ini disebut dengan stres oksidatif, apabila stres tersebut

berlangsung lama dapat mengakibatkan kerusakan sel yang berat atau menetap menyebabkan cedera ireversibel dan sel yang terkena akan mengalami kematian (Murray, et al., 2003).

2.4 Antioksidan

Antioksidan terdiri dari dua kelompok yaitu antioksidan enzimatis dan antioksidan nonenzimatis. Antioksidan enzimatis (primer): merupakan antioksidan endogen, yaitu enzim superoxidea dismutase (SOD), catalase, glutation peroksidase (GSH-PX), serta glutation reduktase (GSHR). Enzim SOD bekerja dengan cara mengubah radikal anion superoxidea (O2-) yang sangat reaktif menjadi H2O2 yang kurang reaktif, sedangkan catalase dan glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2 (Mates, et al., 1999 dalam Wresdiyati, et al., 2010; Bowen, 2003). Antioksidan non ezimatis (sekunder): disebut juga antioksidan eksogen, antioksidan ini bekerja secara preventif. Terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara menangkap radikal dan mencegah terjadinya reaksi berantai. Komponen ini meliputi vitamin C, vitamin E, -karoten, flavonoid. Senyawa-senyawa fitokimia ini membantu melindungi sel dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas (Mates, et al., 1999 dalam Wresdiyati, et al., 2010; Bowen, 2003Mates, et al., 1999).

SOD terdiri dari empat kelas, yaitu: (i) Mn SOD ( manganese superoxide dismutase) yang terdapat didalam mitokondria merupakan homotetramer dengan berat 96 KDa mengandung satu atom Mn perunitnya; (ii) Cu Zn SOD (Copper Zinc superoxide dismutase) yang terdapat didalam sitoplasma terdiri dari dua sub

unit yang identik dengan berat 32 KDa; (iii) Ni SOD (Nickel superoxide dismutase) mengandung empat unit yang identik dengan berat 13,4 KDa; (iv) EC SOD (extracellular superoxide dismutase), (Goodsel, 2007).

Pengukuran kandungan enzim antioksidan SOD merupakan cara untuk mengetahui kondisi pertahanan sel terhadap radikal bebas. Aktivitas SOD bervariasi pada beberapa organ. Aktivitas SOD tertinggi terdapat pada hati, diikuti kelenjar adrenal, ginjal, darah, limpa, pankreas, otak, paru-paru, usus, ovarium dan timus. Pada masa embrional Cu Zn SOD terdapat pada organ yang sedang berkembang dan sangat kuat terekspresi pada ependymal epithelium dari choroid plexus, ganglia, sel sensor pada olfactory dan epitel vestibulocochlear, sel darah, hepatosit, sel hematopoetik liver, dan kulit. Selama masa organogenesis dan pada masa akhir kehamilan levelnya akan meningkat pada sel yang telah matang dan akan terdeteksi pada sel epitel dari saluran cerna, saluran pernafasan, pankreas dan ginjal (Yon, et al., 2008)

Pada ginjal tikus Cu Zn SOD lebih banyak ditemukan pada bagian inti dan sitoplasma sel-sel tubuli renalis (tubuli distalis dan proksimalis). Tingginya kandungan Cu Zn SOD pada jaringan ginjal membuktikan bahwa ginjal mempunyai tingkat konsumsi oksigen yang sangat tinggi dan sangat rentan terkena dampak langsung dari radikal-radikal bebas yang terbentuk dari metabolisme parsial oksigen. Tingginya kandungan Cu Zn SOD pada ginjal juga merupakan indikasi tingginya kemampuan sistem pertahanan untuk tetap mempertahankan kapasitas antioksidan agar tetap mampu mengatasi oksidan-oksidan yang terbentuk selama proses metabolisme yang berlangsung di dalamnya

maupun yang terbentuk dari luar ginjal (Wresdiyati, et al., 2002). Pengamatan immunohistokimia dilakukan terhadap inti sel tubulus proksimal dan tubulus distal renalis yang memberikan reaksi positif pada berbagai tingkat kandungan Cu Zn SOD yaitu coklat tua (positif kuat/+++), coklat sedang (positif sedang/++), coklat muda campur biru (positif lemah/+), dan warna biru (negatif/-).

2.5 Vitamin E (Tokoferol)

Gambar 2.5 α- Tokoferol (Murray, et al., 2003)

Vitamin E merupakan senyawa 6-hidroksikromana (tokol) yang tersubsitusi isoprenoid seperti pada gambar 2.5. Di alam vitamin E terdiri dari berbagai jenis seperti: α tokoferol (5,7,8-Trimetil tokol), tokoferol (5,8-Dimetil tokol), tokoferol (7,8-Dimetil tokol), δ tokoferol (8-Metil tokol), yang mempunyai aktifitas biologis terbesar dan distribusi alami yang paling luas adalah α tokoferol dengan rumus kimia C29H50O2 (Murray, et al., 2003).

Alfa tokoferol berupa minyak kental jernih, warna kuning atau kuning kehijauan, tidak larut dalam air, sukar larut dalam larutan alkali, larut dalam etanol, eter, aseton dan dalam minyak nabati, mudah larut dalam kloroform (Eitenmiller, 2004).

Tokoferol merupakan antioksidan non enzimatik, memutus reaksi rantai radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan ion hidrogen fenolat kepada radikal bebas peroksil asam lemak tak jenuh ganda yang terperoksidasi seperti persamaan berikut ini:

ROO.+ TocOH ROOH + TocO. ROO. + TocO. ROO +

(Produk non radikal bebas)

Radikal bebas fenoksi yang dihasilkan dapat bereaksi dengan vitamin C untuk menghasilkan kembali tokoferol atau bereaksi dengan radikal bebas peroksil berikutnya sehingga cincin kromana serta rantai samping dioksidasi menjadi produk bukan radikal bebas. Kerja vitamin E akan efektif bila bekerja pada konsentrasi oksigen tinggi sehingga vitamin E cenderung terdapat pada struktur lipid yang terpajan tekan parsial O2 paling tinggi seperti membran eritrosit dan retina.

Sumber vitamin E banyak terdapat dialam seperti benih gandum, minyak biji bunga matahari, minyak jagung dan kedelai dapat rusak oleh proses pemasakan dan pengolahan makanan seperti proses deep freezing. Gangguan absorbsi lemak dapat menyebabkan defisiensi Vitamin E karena tokoferol larut dalam lemak makanan dan dibebaskan serta diserap saat lemak dicerna. Vitamin E tersimpan dalam jaringan adipose karena itu kondisi defisiensi vitamin E dapat ditemukan pada kondisi steatore kronis, penyakit hepar kolestatik, kistik fibrosis dan pasien yang menjalani operasi reseksi usus (Murray, et al., 2003)

2.6 Ginjal

Pada manusia bentuk ginjal seperti kacang merah dengan ukuran panjang sekitar 10-12 cm, lebar sekitar 6 cm dan ketebalan 3,5 cm dengan berat sekitar 150 gram dan terbenam dalam dasar lemak yang disebut lemak perirenal. Terdapat pada posterior abdomen bagian atas pada masing-masing sisi vertebrata lumbal atas, letak ginjal kanan biasanya terletak lebih rendah di bandingkan ginjal kiri (Gambar 2.6). Ginjal di bungkus oleh simpai jaringan fibrosa yang tipis. Setiap ginjal memiliki bukaan yang disebut hilus yang menghubungkan arteri renal, vena renal, dan ureter (Watson, 2002). Pada pelvis renalis yakni ujung atas ureter yang melebar terbagi menjadi tiga kaliks mayor dan 12-18 cabang kecil atau kaliks minor. Ginjal dibagi menjadi korteks luar dan medulla didalam yang terdiri dari 10-18 struktur piramid yang disebut pyramid medulla. Dari dasar tiap pyramid terjulur berkas tubulus yang parallel disebut berkas medulla yang menyusup kedalam korteks (Junqueira, et al., 2007).

Unit fungsional ginjal yaitu nefron yang berjumlah 1-4 juta, nefron memiliki beberapa segmen yaitu: (1) korpuskel renalis (Malpighi); (2) Tubulus kontortus proksimal; (3) Segmen tipis; (4) Segmen tebal; (5) Lengkung Henle; (6) Tubulus kontotortus distal; (7) Tubulus; dan (8) Duktus koligentes (gambar 2.7).

Gambar 2.7 Struktur nefron (Junqueira, et al., 2007)

Setiap korpusel renalis dengan diameter 150-25 µm mengandung gulungan kapiler darah yang disebut glomerulus yang berada dalam kapsula

Bowman berjumlah lebih dari satu juta unit dalam satu ginjal (gambar 2.8) (Junqueira, et al., 2007).

Gambar 2.8 A. Gambaran histologi glomerulus ginjal, (CL: Capylary lumen, MES: mesangium; END:endothelium; EP: visceral epithelia cells); dan B. Skema glomerulus (Kumar, 2010)

Nefron memiliki fungsi dasar membersihkan plasma darah dari zat yang tidak diinginkan oleh tubuh. Biasanya substansi tersebut berasal dari hasil metabolisme urea, kreatinin, asam urat, dan ion-ion natrium, kalium, klorida, serta ion-ion hidrogen dalam jumlah yang berlebihan, melalui mekanisme filtrasi pada

korpuskel renal, reabsorbsi pada saluran tubular dan sekresi pada epitel tubulus (Silverthone, 2001).

Tubulus kontortus proksimal dimulai dari korpuskel ginjal, panjangnya sekitar 14 mm dengan diameter 50-60 µm dan berkelok membentuk lengkungan yang menghadap ke permukaan kapsula ginjal dan berakhir sebagai saluran lurus menuju tempat tubulus melanjutkan diri dengan ansa Henle. Fungsi tubulus kontortus proksimal adalah reabsorpsi filtrat glomerulus dengan proses aktif melalui pompa natrium (Na+/K+ATPase) yaitu mengabsorbsi seluruh glukosa, asam amino, lebih kurang 85% NaCl dan air dari filtrat, selain fosfat dan kalsium (Junqueira, et al., 2007).

Epitel yang melapisi tubulus ini adalah selapis kuboid atau silindris yang menunjang dalam mekanisme absorbsi dan ekskresi. Sel-sel epitel ini memiliki sitoplasma asidofilik yang disebabkan oleh adanya mitokondria panjang dalam jumlah besar. Apeks sel memiliki banyak mikrovili dengan panjang sekitar 1 μm, yang membentuk suatu brush border (Junqueira, et al., 2007).

Tubulus kontortus distal dimulai sesudah ansa Henle segmen tebal dan bentuknya berkelok-kelok. Tubulus ini dilapisi oleh sel epitel selapis kuboid dan berbeda dengan tubulus proksimal karena tidak mempunyai sel brush border, tidak mempunyai kanalikuli apical dan ukuran sel lebih kecil. Karena sel tubulus distal lebih gepeng dan lebih kecil daripada tubulus proksimal, maka lebih banyak terdapat inti sel pada dinding Tubulus kontortus distal dibanding tubulus proksimal (Junqueira, et al., 2007).

Fungsi dari ginjal sebagian besar untuk mempertahankan kestabilan lingkungan cairan internal meliputi:1) Mengatur keseimbangan H2O dalm tubuh; 2) Mengatur jumlah dan konsentrasi ion cairan ekstra sel termasuk Na+, Cl-, K+, HCO3-, Mg++, SO4=; 3) Memelihara volume plasma sehingga sangat berperan dalam pengaturan jangka panjang tekanan darah arteri; 4) Memelihara keseimbangan asam basa tubuh dengan menyesuaikan pengeluaran H+ dan HCO3- melalui urin; 5) Memelihara osmolaritas (konsentrasi zat terlarut) berbagai cairan tubuh melalui pengaturan H2O; 6) Mengekskresikan produk sisa metabolisme tubuh; 7) mengekskresikan senyawa asing misalnya obat, bahan tambahan makanan, pestisida dan bahan eksogen yang masuk kedalam tubuh; 8) mengekskresikan eritropoietin (hormon yang merangsang pembentukan sel darah merah); 9) Mengekskresikan rennin; dan 10) Mengubah vitamin D menjadi bentuk aktifnya (Sherwood, 2001).

Karena fungsinya untuk mengekskresikan sisa metabolisme dan senyawa asing misalnya obat, bahan tambahan makanan, pestisida dan bahan eksogen yang masuk kedalam tubuh maka konsumsi MSG yang berlebihan dan berlangsung lama dapat merusak organ ginjal. Didalam tubuh MSG berubah natrium dan L- glutamat, ketika L- glutamat dalam konsentrasi yang tinggi memasuki arteri renal maka ginjal berusaha untuk mengekskresikannya. L- glutamat masuk kedalam korpuskel renal melalui arteriole afferent, kemudian akan diabsorbsi, filtrasi dan melintasi membrane merusak sel. Tubulus proksimal lebih rentan terhadap kerusakan dibandingkan dengan tubulus distal (Attia, et al., 2008), hal ini di sebabkan transport tubuler dari anion dan kation organik dan logam berat

terutama terjadi pada tubulus kontortus proksimalis, tubulus kontortus proksimalis juga mempunyai epitelium yang mudah bocor bila dibandingkan dengan tubulus kontortus distalis yang relatif rapat dan mempunyai ketahanan elektrik tinggi, maka diduga tubulus kontortus proksimalis akan mengalami kerusakan yang lebih berat apabila dibandingkan dengan tubulus kontortus distalis (Muliani, 2006).

Hal ini seperti penelitian yang dilakukan Abbas, et al. (2011) yang menyebutkan bahwa pemberian MSG pada tikus dengan dosis 830 mg/kgBB selama 28 hari secara oral akan menyebabkan terjadinya perubahan histopatologi pada ginjal, seperti terlihatnya pembengkakan pada endothelium glomerulus yang berhubungan dengan atropi glomerulus, dan juga terdapat degenerasi hidropic tubula dengan dilatasi tubula dan hyaline casts. Pada daerah inter tubula memperlihatkan adanya dilatasi dan kongesti pada pembuluh darah kortikal dengan haemorroge diantara tubula (Gambar 2.9 dan 2.10).

Gambar 2.9 Kortek ginjal normal (g) glomerulus yang dikelilingi oleh kapsul bowman (D) tubulus distal (P) tubulus proksimal (Abbas, et al., 2012)

Gambar 2.10 Gambaran bagian ginjal tikus yang mendapat MSG memperlihatkan degenerasi hidropik dan

vakuolisasi tubulus (panah), dilatasi tubulus (D) dengan hyaline casts (C) (Abbas, et al., 2012)

Ketika sel mengalami stres fisiologis atau patologis sel bisa beradaptasi mencapai kondisi baru dan mempertahankan kelangsungan hidupnya. Dalam batas tertentu bersifat reversibel dan sel akan kembali ke kondisi semula. Stres yang berat atau menetap menyebabkan cedera ireversibel dan sel yang terkena menjadi mati (Kumar, et al., 2010).

Nekrosis (jejas ireversibel) adalah perubahan morfologik yang mengikuti kematian sel pada jaringan atau organ hidup. Sel yang mengalami nekrotik berwarna seperti kaca (glassy), membran sel pecah-pecah. Perubahan inti sel nekrotik adalah kariopiknosis (inti kecil, padat), kariolisis (inti pucat, larut) dan kariorheksis (inti pecah menjadi beberapa gumpalan) (Kumar, et al., 2010). Nekrosis tubular akut (NTA) adalah kumpulan tanda dan gejala dari kegagalan ginjal yang disebabkan oleh iskemik atau toksik. Kerusakan tubulus proksimal ginjal akibat zat nefrotoksis terlihat adanya penyempitan tubulus proksimal,

nekrosis sel epitel tubulus proksimal dan adanya hyaline cast di tubulus distal. NTA merupakan penyebab terpenting dari gagal ginjal akut. Dengan gejala klinis oliguria yang dilanjutkan diuresis. Adanya kerusakan pada daerah tubulus menyebabkan retensi cairan, sehingga terjadi uremia, hiperkalemia, peningkatan kreatinin dan blood urea nitrogen (Underwood, 2000).

2.7 Kerangka Teori

Gambar 2.13 Kerangka Teori

Reactive Oxygen Species (ROS)

Stres oksidatif

Peroksidasi lipid

ginjal Ekstrak etanol

kulit manggis

Keterangan

: menghambat : memacu

Perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan

CU Zn SOD pada ginjal

MSG

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan rancangan the post test only control group dengan cara membandingkan hasil observasi pada kelompok perlakuan (eksperimen) dengan kelompok kontrol.

3.2. Tempat dan Waktu penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) USU sebagai tempat dimulainya proses aklimatisasi, pemberian perlakuan dan pembedahan hewan coba selama 6 minggu, Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU untuk pembuatan dan pembacaan preparat immunohistokimia dan laboratorium Farmasi USU untuk pembuatan ekstrak etanol kulit manggis. Penelitian ini di laksanakan dari Januari 2012 hingga Juli 2013.

3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi Penelitian

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus.L), Strain DDW (Double Distsch Webster) dewasa, jenis kelamin

jantan, sehat dan aktif, umur ± 8-12 minggu, mempunyai berat badan berkisar 25-30g, belum pernah digunakan untuk penelitian, diperoleh dari FMIPA USU.

3.3.2. Sampel penelitian

Besar sampel yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan rumus Federer (Wahyuni, 2010)

Dimana :

n = besar sampel dalam kelompok perlakuan

t = banyaknya kelompok perlakuan (5 kelompok perlakuan) Banyak sampel yang dibutuhkan dalam kelompok :

{(5 – 1) (n -1)} ≥ 15 4 (n –1) ≥ 15

4n –4 ≥ 15 4n ≥ 19 n ≥ 5

Maka jumlahnya adalah 5 ekor per kelompok, sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 25 ekor mencit jantan dewasa

Sampel penelitian adalah 25 ekor mencit jantan strain DDW yang dipilih dengan tekhnik acak sederhana. Sampel dikelompokkan atas lima kelompok, yakni kelompok I sebagai kontrol, sedangkan kelompok II sampai V adalah kelompok perlakuan.

3.4. Kriteria sampel 3.4.1. Kriteria inklusi

- Mencit jantan strain DDW - Umur 8-12 minggu

- Berat badan 25- 30 g

- Selama observasi 7 hari sebelum perlakuan, mencit tidak sakit, aktivitas dan tingkah laku normal.

3.4.2. Kriteria ekslusi

- Mencit dalam kondisi sakit. - Gerakan tidak aktif.

3.5. Variabel Penelitian 3.5.1. Variabel Bebas

Ekstrak kulit buah manggis MSG

Vitamin E 3.5.2. Variabel tergantung

Gambaran makroskopik ginjal meliputi berat, warna dan konsistensi

Gambaran mikroskopik ginjal mencit dengan pewarnaan HE. Gambaran immunohistokimia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD) ginjal mencit.

3.6. Kerangka operasional

Gambar 3.1 Kerangka operasional

Aklimatisasi ± 1 minggu

P0 (n=5) Aquadest 0,3ml (35 hari)

Randomisasi kedalam 5 kelompok

P1 (n=5)

MSG

(8 mg/gBB) 21 hari

P3 (n=5)

MSG 8mg/gBB 21 hari + EKM (600mg/kg BB) (hari ke-22 s/d 35) P2 (n=5)

MSG 8 mg/gBB 21 hari + Vit. E (0,2 mg/g BB) (hari ke-22 s/d 35)

Terminasi

Jaringan ginjal

Makroskopis

IHC (Cu Zn SOD)

- Berat - Warna - Konsistensi Mikroskopis Pewarnaan HE Mencit P4 (n=5) EKM (600mg/gBB) 14 hari

3.7Definisi Operasional

- Mencit (Mus musculus) merupakan hewan mamali dengan diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom Animalia, Filum Chordata, Klas Mamalia, Ordo Rodentia, Famili Muridae, Genus Mus, Spesies M. musculus (Wikipedia, 2012). Pada penelitian ini digunakan 25 ekor mencit jantan strain DDW, umur 8 - 12 minggu, berat badan 25 - 30 gr, yang berasal dari Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, USU.

- Aklimatisasi merupakan suatu upaya penyesuaian fisiologis atau adaptasi dari suatu organisme terhadap suatu lingkungan baru yang akan dimasukinya, pada penelitian ini aklimatisasi hewan dilakukan selama satu minggu (IACUC, 2012).

- Kelompok perlakuan adalah kelompok hewan percobaan yang digunakan untuk penelitian, Pada penelitian ini hewan yang digunakan adalah mencit yang dibagi atas lima kelompok perlakuan sebagai berikut:

- Kelompok I (P0): kelompok kontrol tanpa diberi MSG, Vitamin E dan Ekstrak manggis, hanya diberi aquadest sebanyak 0,3 ml/mencit/hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) dari hari pertama sampai hari ke- 35

- Kelompok II (P1): kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mg/gr BB setiap hari sebanyak 0,3ml/mencit/hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari selama 21 hari. - Kelompok III (P2): kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mg/g

menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian Ekstrak etanol kulit manggis 600 mg/kb/bb sebanyak 0,36 ml selama 14 hari.

- Kelompok IV (P3): kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mg/g BB setiap hari sebanyak 0,3 ml/mencit/hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian pemberian vitamin E 0,2mg/g bb selama 14 hari.

- Kelompok V (P4): kelompok perlakuan yang diberi ekstrak etanol kulit manggis dengan dosis 600 mg/kb/bb sebanyak 0,36 ml selama 14 hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral (gavage) setiap hari.

Masing-masing dari setiap kelompok P0, P1, P2, P3 dan P4 secara acak 5 ekor mencit didekapitasi, kemudian dilakukan penilaian perubahan makroskopik (berat, warna dan konsistensi ginjal), mikroskopis dengan pewarnaan HE dan kandungan antioksidan endogen Cu Zn SOD dengan pewarnaan immunohistokimia.

- Ekstrak etanol kulit manggis adalah cairan yang berasal dari kulit manggis berwarna ungu tua yang telah di ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96%, diberikan dengan dosis 600 mg/kg bb. Pemberian dilakukan selama 14 hari dicekok menggunakan jarum gavage (Towatana, et al., 2010; Palupi, 2008).

Buah manggis yang digunakan didapat dari daerah pantai Gemi, Stabat, Sumatera Utara.

- Monosodium glutamat (MSG) dengan rumus kimia C5H8O4NNaH2O terdiri atas Natrium sebanyak 12%, glutamat 78% dan air 10%, adalah garam sodium

“L glutamat acid” yang mudah larut dalam air dan tidak berbau, dibuat

melalui proses fermentasi dari tetes gula (molases) oleh bakteri Brevibacterium lactofermentum. Dari fermentasi ini dihasilkan asam glutamat. Asam glutamat kemudian ditambah soda (Natrium karbonat) sehingga terbentuk monosodium glutamat (MSG), kemudian dimurnikan dan dikristalisasi, sehingga merupakan serbuk kristal murni. Dosis yang diberikan adalah 8 mg/gr BB selama 21 hari dengan dicekok menggunakan jarum gavage (Thomas, et al., 2009). Pada penelitian ini menggunakan Ajinomoto 29 gr (BPOM RI MD245813034037), diproduksi oleh PT Ajinomoto Indonesia, Mojokerto 61352- INDONESIA.

- Vitamin E merupakan antioksidan non enzimatis yang mampu mendonorkan ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif sehingga tidak mampu menyerang rantai asam lemak. Dosis yang diiberikan sebanyak 0,2 mg/kg BB (Tawfik, et al., 2012) pada penelitian ini digunakan DL-A-TOCOPHERYL ACETATE, nomor produk: 0420085, lot no.: UT08010021, no. analisis: 03614504

- Cu Zn SOD merupakan antioksidan endogen yang berfungsi mencegah pembentukan radikal-radikal bebas. Antioksidan ini mengubah radikal superoxidea menjadi radikal bebas peroksida (Kumar, 2010).

- Gambaran makroskopis ginjal mencit yaitu penilaian yang meliputi berat ginjal, warna dan konsistensi. Ginjal normal berwarna merah kecoklatan, dan konsistensinya kenyal (Anggraini, 2008).

- Kriteria abnormal bila ditemukan: a. Perubahan berat ginjal b. Perubahan warna c. Perubahan konsistensi Derajat kerusakan ginjal:

0 (normal) =Tidak terdapat kelainan.

+ 1 (ringan) =Jika ditemukan 1 dari tiga kriteria di atas + 2 (sedang) =Jika ditemukan 2 dari tiga kriteria di atas + 3 (berat) =Jika ditemukan ketiga kriteria di atas

- Mikroskopis ginjal adalah pemeriksaan ginjal secara mikroskopis menggunakan mikroskop cahaya merk Olympus CX21 dengan pembesaran 40x dan 400x. Pengamatan dilakukan dengan membagi preparat dalam 4 bagian, pada setiap bagian dilihat luasnya kerusakan sel pada glomerulus yang di tandai dengan adanya hiperseluleritas yang disebabkan oleh infiltrasi dan proliferasi pada sel endotel dan mesangial, atropi yang ditandai dengan dilatasi ruang Bowman serta kontraksi glomerulus, tubulus proksimal maupun tubulus distal berupa nekrosis yang ditandai dengan degenerasi inti berupa kariopiknotik, kariorhexis dan kariolisis. Persentase luas kerusakan ginjal dari

ke-4 bagian tersebut kemudian dijumlahkan dan dibagi empat. Kemudian tingkat kerusakan ginjal dinilai sebagai berikut: (Santoso, et al., 2006)

- Skor 1 (Normal) = Bila tidak ditemukan kerusakan ginjal - Skor 2 (Ringan) = Bila luas kerusakan ginjal seluas < 25% - Skor 3 (Sedang) = Bila kerusakan ginjal seluas 26-50% - Skor 4 (Berat) = Bila kerusakan ginjal seluas > 50%

- Untuk memeriksa antioksidan endogen Cu Zn SOD digunakan tehnik pewarnaan immunohistokimia menggunakan SOD-1 polyclonal Antibody (3458-100, PT. Bio Vision, pengenceran 1:50). Jaringan ginjal yang telah dipotong secara serial, diwarnai dengan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD dan diamati di bawah mikroskop cahaya, dengan pembesaran mulai 40x, 100x dan 400x

- Hasil pulasan immunohistokimia antioksidan Cu Zn SOD adalah tampilan pulasan berwarna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla (Wresdiyati, et al., 2006), dinilai tampilan pewarnaan berupa:

- Positif: tertampil warna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla. - Negatif: bila tidak tertampilnya warna coklat pada inti dan

sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla.

- Untuk menilai hasil pewarnaan immunohistokimia antioksidan endogen Cu Zn SOD digunakan kontrol positif jaringan yang berasal dari hepar.

- Penilaian pewarnaan immunohistokimia merupakan hasil perkalian antara intensitas tampilan coklat dengan luas tampilan, dan hasil tersebut dibuat skor sebagai berikut: (Svensk, et al., 2004)

- 0 = negatif

- 1-3 = tampilan lemah - 4-6 = tampilan sedang - 7-9 = tampilan kuat

Penilaian Intensitas tampilan warna coklat yang dibandingkan dengan warna coklat yang tertampil pada kontrol positif dan diberi kategori sebagai berikut:

- 0 = Tidak tertampil / negatif

- 1 = Intensitas warna coklat tertampil lemah - 2 = Intensitas warna coklat tertampil sedang - 3 = Intensitas warna coklat tertampil kuat

Sedangkan penilaian luas tampilan hasil pewarnaan diberi skor sebagai berikut: - 0 = Tidak tertampil

- 1 = Luas tampilan warna coklat < 25% yang terwarnai positif

- 2 = Luas tampilan warna coklat 25 – 50% yang terwarnai positif

- 3 = Luas tampilan warna coklat > 50% yang terwarnai positif.

3.8. Bahan dan Alat Penelitian

Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian

a. Ekstrak etanol kulit manggis yang didapat dari Pericarp buah manggis yang telah dideterminasi di Herbarium Medanense Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Sumatera Utara. b. MSG

c. Vitamin E

d. Mencit jantan strain DDW dengan umur 8-12 minggu, mempunyai berat badan berkisar 25 – 30 gram, berasal dari FMIPA USU.

e. Pakan standar mencit berupa pellet produksi PT. Charoen Pokphan Medan yang dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1.

f. Reagensia untuk pembuatan preparat histologi ginjal. g. Reagensia untuk pewarnaan HE.

h. Regensia untuk pewarnaan immunohistokima antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD).

Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian a. Kandang mencit dan perlengkapannya

b. Jarum gavage untuk cekok tikus, timbangan, sekam padi. c. Peralatan pembuatan preparat histologi ginjal

e. Peralatan untuk pewarnaan immunohistokomia antioksidan copper zinc superoxide dismutase (Cu Zn SOD)

f. Peralatan untuk membuat ekstrak kulit buah manggis (timbangan, oven, mesin penggiling, bejana tertutup, rotary evaporator)

g. Timbangan tikus, gelas arloji, bak bedah dan dissecting set, cawan petri, batang pengaduk, sarung tangan, masker, kertas milli.

h. Mikroskop binokuler

3.9. Etika Penelitian

Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan yang diatur dalam deklarasi Helsinki dan Ethical clearance diperoleh dari komite etik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) USU Medan.

3.10 Pelaksanaan penelitian

3.10.1 Persiapan dan pemeliharaan hewan percobaan

Mencit dipelihara dalam kandang plastik (ukuran 30 x 20 x 10 cm) dengan anyaman kawat sebagai penutup, dasar kandang dilapisi sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari, ditempatkan dalam ruangan yang memiliki ventilasi dan mendapat cahaya matahari secara tidak langsung. Kandang tempat makan dan minum dibersihkan minimal tiga kali dalam seminggu. Sebelum perlakuan, mencit diaklimatisasi selama seminggu. Pemberian minum dilakukan

setiap hari secara ad libitum dan pakan yang diberikan berupa pellet c-0,5 produksi PT. Chaeron Pokphan Medan. Cahaya ruangan, kelembaban ruangan dan suhu berada pada kisaran alamiah. Sampel yang terdiri dari 25 mencit dibagi secara acak dalam lima kelompok, masing-masing kelompok lima ekor. Tiap kelompok diberi kode kelompok I, II, III, IV dan V.

Perlakuan diberikan sesuai dengan kelompok. Sebelum perlakuan, lebih dulu dilakukan penimbangan berat badan tikus. Pakan diberikan setelah perlakuan dilakukan berupa pelet dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1 diberikan secara setiap pagi hari jam ± 10.00-11.00 WIB sebanyak 2,5-5 gr/hari/mencit serta air minum ad libitum dari Perusahaan Air Minum (PAM). Tabel 3.1. Dosis pemberian Ekstrak etanol kulit manggis pada kelompok

perlakuan

Kelompok Dosis Ekstrak etanol kulit manggis

I (P0) Kontrol II (P1)

III (P2) IV (P3) V (P4)

Kontrol (MSG 8mg/g bb)

MSG + Ekstrak Manggis 600mg /kg bb MSG + Vitamin E (0,2mg/g bb) Ekstrak Manggis 600mg /kg bb

3.10.2 Prosedur pembedahan hewan mencit

Prosedur pembedahan dilakukan melalui tahap persiapan, pembedahan dan sanitasi. Pada tahap persiapan, disiapkan pot yang sudah diberi label sesuai dengan nomor perlakuan mencit yang akan dilakukan pembedahan. Pot organ di isi dengan formalin buffer 10% untuk menyimpan organ. Disiapkan peralatan

bedah seperti gunting bedah, pinset, gelas arloji, cawan petri, papan bedah, pins, beker glas.

Tahap pembedahan, mencit dikorbankan secara neck dislocation. Mencit diposisikan pada papan bedah menggunakan pins dan di bedah mulai dari bagian perut menggunakan gunting bengkok. Organ ginjal diambil, dibersihkan dari kotoran yang menempel, dicuci dengan menggunakan NaCl 0,9% sampai bersih. Secara makroskopik, ditimbang berat dan diamati perubahan warna, konsistensi dan permukaan pada ginjal, setelah itu dimasukkan kedalam pot berisi formalin buffer 10%.

Tahap sanitasi dilakukan dengan cara memasukkan sisa organ mencit yang tidak terpakai dalam kantong plastik yang akan dibuang. Tempat kerja sisa melakukan pembedahan dibersihkan dan semua peralatan bedah yang terpakai dibersihkan.

3.10.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit buah manggis yang di peroleh dari perkebunan penduduk daerah Pantai Gemi, Stabat, Sumatera Utara. Kulit buah dibersihkan dari pengotor lalu dicuci hingga bersih, dikupas kulit buah terluar dan ditimbang, diperoleh berat pericarp sebesar 10 kg. Selanjutnya kulit buah tersebut dikeringkan selama 7 hari dalam lemari pengering dengan temperatur 40oC sampai kulit buah kering, didapat berat kering 2454,7 gram. Simplisia yang telah kering dihaluskan menjadi serbuk lalu dimasukkan ke dalam wadah plastik bertutup dan di simpan pada suhu kamar. Kemudian serbuk ditimbang. Diperoleh berat kering sebesar 2262,8 gram.

Sebanyak 2262,8 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat dan dibasahi dengan etanol 96% sampai semua serbuk terendam, biarkan selama lima hari sambil diaduk 3-4 kali sehari. Setelah itu massa dipindahkan kedalam corong dan disaring menggunakan kertas penyaring. Hasil penyaringan yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Diperoleh ekstrak kental sebanyak 700 gram (BPOM, 2010).

3.10.4 Prosedur pembuatan preparat histologi ginjal mencit

Sampel jaringan ginjal mencit diambil dan dicuci dengan NaCl fisiologis, kemudian difiksasi dengan larutan formalin buffer 10% (0,1 mol/L Phospat Buffer saline) PH 7, selama 6-48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alkohol 70%, 80%, 96%, dan alkohol absolut masing-masing 1 jam untuk pengeluaran air dari jaringan tersebut. Clearing atau penjernihan menggunakan xylol 1, 2 dan 3 selama 1 jam setelah itu dilakukan Impregnasi (penyusupan parafin) dengan parafin cair 1 dan 2 suhu 60-70oC masing-masing selama 2 jam. Pada penelitian ini menggunakan mesin tissue prosescing otomatis dengan merk Leica TP 1020.

Embedding (parafinisasi) yaitu pembuatan blok parafin dengan cara penanaman jaringan dalam kaset dan didinginkan, kemudian dilakukan proses sectioning (pemotongan), dengan menggunakan mikrotom setebal 5µm dan selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah penampung atau waterbath. Kemudian dilanjutkan dengan proses mounting dengan meletakkan sediaan di atas objek glas dan diolesi dengan glyserin. Proses terakhir adalah staining atau pewarnaan dengan hematoksilin eosin, tutup objek glas dengan menggunakan deck glass dan

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U .000 2.000

Wilcoxon W 15.000 17.000

Z -2.887 -2.425

Asymp. Sig. (2-tailed) .004 .015 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008b .032b a. Grouping Variable: Kelompok

b. Not corrected for ties.

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P0 5 3.00 15.00

P3 5 8.00 40.00

Total 10

Cu Zn SOD

P0 5 7.60 38.00

P3 5 3.40 17.00

Total 10

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U .000 2.000

Wilcoxon W 15.000 17.000

Z -2.887 -2.425

Asymp. Sig. (2-tailed) .004 .015 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008b .032b a. Grouping Variable: Kelompok

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P0 5 5.50 27.50

P4 5 5.50 27.50

Total 10

Cu Zn SOD

P0 5 6.00 30.00

P4 5 5.00 25.00

Total 10

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U 12.500 10.000

Wilcoxon W 27.500 25.000

Z .000 -.655

Asymp. Sig. (2-tailed) 1.000 .513 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 1.000b .690b a. Grouping Variable: Kelompok

b. Not corrected for ties.

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P1 5 7.50 37.50

P2 5 3.50 17.50

Total 10

Cu Zn SOD

P1 5 3.50 17.50

P2 5 7.50 37.50

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U 2.500 2.500

Wilcoxon W 17.500 17.500

Z -2.449 -2.449

Asymp. Sig. (2-tailed) .014 .014 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .032b .032b a. Grouping Variable: Kelompok

b. Not corrected for ties.

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P1 5 7.50 37.50

P3 5 3.50 17.50

Total 10

Cu Zn SOD

P1 5 3.50 17.50

P3 5 7.50 37.50

Total 10

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U 2.500 2.500

Wilcoxon W 17.500 17.500

Z -2.449 -2.449

Asymp. Sig. (2-tailed) .014 .014 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .032b .032b

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P1 5 8.00 40.00

P4 5 3.00 15.00

Total 10

Cu Zn SOD

P1 5 3.00 15.00

P4 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U .000 .000

Wilcoxon W 15.000 15.000

Z -3.000 -2.835

Asymp. Sig. (2-tailed) .003 .005 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008b .008b a. Grouping Variable: Kelompok

b. Not corrected for ties.

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P2 5 5.50 27.50

P3 5 5.50 27.50

Total 10

Cu Zn SOD

P2 5 5.50 27.50

P3 5 5.50 27.50

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U 12.500 12.500

Wilcoxon W 27.500 27.500

Z .000 .000

Asymp. Sig. (2-tailed) 1.000 1.000 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 1.000b 1.000b a. Grouping Variable: Kelompok

b. Not corrected for ties.

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P2 5 8.00 40.00

P4 5 3.00 15.00

Total 10

Cu Zn SOD

P2 5 3.80 19.00

P4 5 7.20 36.00

Total 10

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U .000 4.000

Wilcoxon W 15.000 19.000

Z -2.887 -2.032

Asymp. Sig. (2-tailed) .004 .042 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008b .095b a. Grouping Variable: Kelompok

Mann-Whitney Test

Ranks

Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks

Mikroskopis

P3 5 8.00 40.00

P4 5 3.00 15.00

Total 10

Cu Zn SOD

P3 5 3.80 19.00

P4 5 7.20 36.00

Total 10

Test Statisticsa

Mikroskopis Cu Zn SOD

Mann-Whitney U .000 4.000

Wilcoxon W 15.000 19.000

Z -2.887 -2.032

Asymp. Sig. (2-tailed) .004 .042 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008b .095b a. Grouping Variable: Kelompok