13
III. METODOLOGI
3.1 WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian dilakukan selama delapan bulan, yaitu sejak akhir bulan Februari hingga September 2012 di Laboratorium Teknologi Bioindustri dan Laboratorium Teknik Kimia Departemen Teknologi
Industri Pertanian IPB.
3.2 ALAT DAN BAHAN 3.2.1 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat untuk pengujian, seperti spektrofotometer Hach dan untuk analisa, seperti erlenmeyer, termometer, 3G-filter glass, penyaring
vakum, pH-meter Beckman, inkubator waterbath, neraca analitik, gelas piala, alat pengaduk, penangas air, tabung reaksi, sentrifuse, tabung ulir, dan mikropipet.
3.2.2 Bahan
Bahan-bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tujuh pati palma Indonesia yang berasal dari Balai Penelitian Tanaman Kelapa dan Palma Lain, Manado, meliputi pati sagu
rumbia Metroxylon sp., sagu komersial, Caryota mitis, Arenga pinnata, Arenga microcarpa 1 sagu baruk 1, Arenga microcarpa 2 sagu baruk 2, dan Arenga microcarpa komersial sagu baruk 3
tersaji pada Lampiran 1. Enzim yang digunakan dalam penelitian ini adalah β-amilase dari barley
SIGMA dan pullulanase A.aerogenes, Hayashibara Biochemical Lab.. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk pemurnian pati deproteinase dan defatting starch, antara lain : Dimetil Sulfoksida
DMSO, metanol, eter, dan larutan NaOH 0,1 N. Bahan-bahan kimia lain yang digunakan adalah untuk analisa total gula, seperti larutan fenol dan H
2
SO
4
97 dan analisa gula pereduksi, seperti Na
2
CO
3
, NaHCO
3
, KCN, potasium ferrisianida K
3
FeCN
6
, dan ferric amonium sulfat NH
4 2
FeSO
4 2
.6H
2
O.
3.3 METODE PENELITIAN
3.2.1 Persiapan Bahan
1.a. Penentuan Kadar Amilosa Penentuan kadar amilosa dilakukan dengan metode IRRI yang menggunakan prinsip
pengikatan iodin iodine binding berdasarkan reaksi antara amilosa dengan senyawa iod yang prosedur pengujiannya tersaji pada Lampiran 2.
1.b Penghilangan Protein pada Pati Sunarti et al. 2001 Deproteinisasi pati dilakukan dengan menggunakan metode denaturasi protein. Sebanyak 10 g
pati ditambahkan dengan 15-20 ml NaOH 0,1 N sampai semua bagian pati terendam. Pati yang telah dicampur NaOH dikocok hingga terlarut homogen. Campuran yang terbentuk dipisahkan dengan alat
sentrifus. Selanjutnya pati yang terpisah dicuci dengan air lalu disentrifugasi kembali untuk memisahkan pati dari air pencuci. Pemisahan pati dengan alat sentrifus ini dilakukan berulang
sebanyak tiga kali. Pati akhir yang diperoleh dinetralkan dengan akuades sebelum disaring dengan
14 3G-3 filter glass. Pati yang sudah ber-pH netral disaring lalu dibilas dengan metanol. Pati hasil
penyaringan dikering-anginkan hingga kering. 1.c. Penghilangan Lemak pada Pati Sunarti et al. 2001
Sebanyak 5 g pati yang telah dideproteinisasi dilarutkan ke dalam 100 ml DMSO Dimethyl sulfoxide
lalu dikocok dengan shaker pada suhu 37
o
C selama semalam. Larutan tersebut kemudian dituang secara perlahan-lahan dalam 100 ml metanol lalu didiamkan semalam pada suhu 4
o
C. Endapan yang terbentuk seperti butiran pati disaring dengan menggunakan 3G-3 filter glass lalu
dibilas dengan metanol dan eter di akhir. Apabila pada larutan sebelum disaring belum terdapat endapan seperti butiran pati, ditambahkan terus metanol dan diaduk-aduk. Selanjutnya pati yang
dihasilkan dikering-anginkan.
3.3.2 Penentuan Aktivitas Enzim
2.a. Uji Aktivitas Pullulanase Sunarti et al. 2001 Sebanyak 3 ml larutan glutinous rice-defatted starch 0,4 ditambahkan dengan 1,5 ml buffer
fosfat 0,1 M pada pH optimal pH 6,0 lalu diinkubasi pada suhu optimal 40
o
C. Kemudian larutan ditambahkan 1,5 ml pullulanase dan dihidrolisis selama 3 jam. Selama proses dilakukan pengambilan
sampel setiap 15 menit. Tiap sampel diinaktivasi pada air mendidih selama 10 menit lalu diukur konsentrasi gula pereduksinya. Selisih kenaikan konsentrasi gula pereduksi terbesar ditetapkan
sebagai nilai aktivitas optimum enzim. 2.b. Uji Aktivitas
β-amilase Sunarti et al. 2001 Larutan
soluble starch 2 sebanyak 5 ml ditambahkan dengan 3,75 ml buffer asetat 0,2 M
pada pH optimal enzim pH 4,8 dan 1,25 ml akuades yang kemudian diinkubasi pada suhu optimal enzim 40
o
C. Setelah itu, ditambahkan 5 ml β-amilase yang kemudian dihidrolisis selama 3 jam.
Selama proses dilakukan pengambilan sampel setiap 15 menit kemudian tiap sampel diinaktivasi pada air mendidih selama 10 menit lalu diukur konsentrasi gula pereduksinya. Selisih kenaikan konsentrasi
gula pereduksi terbesar ditetapkan sebagai nilai aktivitas optimum enzim. Satu unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memproduksi 1 µmol gula pereduksi dalam bentuk
glukosa per menit pada kondisi yang telah ditentukan. Adapun rumus untuk menghitung aktivitas masing-masing enzim sebagai berikut.
3.3.3 Hidrolisis Pati Palma oleh Pullulanase dan β-amilase
Kategori