24
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metodologi penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, identifikasi
bahan tumbuhan, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol serta uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl sebagai sumber radikal bebas dan absorbansi DPPH diukur menggunakan alat spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516 nm.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat-alat gelas laboratorium corong, corong pisah, erlenmeyer, gelas arloji, gelas beaker, gelas ukur, labu
bersumbat, labu tentukur, matt pipet, tabung reaksi, pipet tetes, aluminium foil, blender National, cawan berdasar rata, desikator, kaca objek, kaca penutup,
kertas saring, krus porselin, lemari pengering, mikroskop Olympus, neraca anal
itis Vibra, neraca kasar O’haus, oven listrik Stork, penangas air Yenaco, rotary evaporator Stuart, spektofotometer UVVis Shimadzu dan
tanur Gallenkamp.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah herba dari tumbuhan kelakai. Bahan-bahan kimia berkualitas pro analisis poduksi Sigma: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DPPH; produksi E-Merck: amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida
Universitas Sumatera Utara
25
pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismuth III nitrat, isopropanol, kloroform, metanol, n-heksan, raksa II klorida, serbuk
magnesium Mg, timbal II asetat, kloralhidrat, toluen, kalium iodida, α-naftol. Bahan kimia berkualitas teknis: etanol 70 dan air suling.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposive yaitu tanpa membandingkan dengan bahan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan
tumbuhan yang digunakan adalah herba dari tumbuhan kelakai Stenochlaena palustris Burm.f. Bedd., diambil dari Jl.G.Obos, Kecamatan Jekan Raya Kota
Palangkaraya, Provinsi Kalimantan Tengah.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Laboratorium Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor dan di Herbarium Medanense
Universitas Sumatera Utara-Medan.
3.3.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Bahan yang digunakan adalah herba dari tumbuhan kelakai yang masih muda. Herba kelakai yang telah terkumpul dibersihkan dari kotoran, dicuci,
ditiriskan kemudian ditimbang sebagai berat basah. Herba kelakai selanjutnya dikeringkan dalam lemari pengering pada
temperatur ± 40°C sampai kering ditandai bila diremas rapuh, kemudian ditimbang sebagai berat kering. Simplisia yang telah kering diblender menjadi
serbuk lalu disimpan dalam kantong plastik untuk mencegah pengaruh lembab
Universitas Sumatera Utara
26
dan pengotoran lain. Bagan kerja penelitian dapat dilihat pada lampiran 2, halaman 50.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.2 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.3 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.4 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.5 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes RI, 1995.
3.4.6 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10
ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
27
3.4.7 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI,1995.
3.4.8 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, lalu ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodide dalam 50 ml air suling.
Kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna, larutan jernih diencerkan dalam air suling hingga volume 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.9 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.10 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95 ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian volume asam
asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Depkes RI, 1995.
3.5 Karakterisasi Simplisia
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari herba kelakai segar dan simplisia herba kelakai.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia herba kelakai. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan
Universitas Sumatera Utara
28
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah
mikroskop. 3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung
penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. a.
Penjenuhan toluen Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu alas
bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume
air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. b.
Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama
dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen yang telah dijenuhkan, kemudian labu dipanaskan selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan
diatur 2 tetesdetik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetesdetik, setelah semua air terdestilasi, bagian
dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar, setelah air dan
toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter sebanyak 100 ml
Universitas Sumatera Utara
29
didalam labu bersumbat, dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan
sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105º C sampai bobot tetap. Kadar dalam
persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam
etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 gram serbuk ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-
lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 ºC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. 3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas,
Universitas Sumatera Utara
30
lalu dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
Depkes RI, 1995.
3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan
penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida, sedangkan
warna merah, merah muda atau ungu meunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1987.
3.6.2 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit,
kemudian didinginkan dan disaring, filtrat lalu dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan
0,5 ml filtrat. Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan
menggumpal berwarna putih atau kuning. Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk
endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan. Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat, akan terbentuk
endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
Universitas Sumatera Utara
31
Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau tiga dari percobaan di atas Depkes RI, 1995.
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volum air suling ditambah
dengan 10 ml asam klorida 2 N. Direfluks selama 30 menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II
asetat 0,4 M lalu dikocok selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga
kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut,
yaitu 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air. Sisa dilarutkan dalam 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi Molish
kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat. Glikosida positif jika terbentuk cincin ungu Depkes, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan flavonoid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 10 g, ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml
filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966. 3.6.5 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan
Universitas Sumatera Utara
32
diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin
Farnsworth, 1966.
3.6.6 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak etanol herba kelakai dilakukan dengan cara perkolasi. Prosedur pembuatan ekstrak sebanyak 230 g serbuk simplisia dibasahi dengan
etanol 70 dan dibiarkan selama 3 jam., Kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari etanol sampai semua simplisia terendam
dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan
dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan 1 mlmenit, perkolat ditampung.
Cairan penyari ditambahkan berulang-ulang secukupnya sehingga selalu terdapat cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika cairan perkolat
terakhir yang keluar tidak berwarna lagi. Biarkan dalam bejana tertutup 2 hari ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya. Saring lalu dipekatkan dengan alat
penguap vakum putar hingga diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
33
3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan 3.8.1 Prinsip metode pemerangkapan radikal bebas DPPH
Kategori