Pada KCKT fase normal fase diam lebih polar daripada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak
biasanya non polar, seperti dietil eter, benzen, hidrokarbon lurus seperti pentana, heksana, heptana maupun iso-oktana. Halida alifatis seperti diklorometana,
dikloroetana, butilklorida dan kloroform juga digunakan. Umumnya gas terlarut tidak menimbulkan masalah pada fase normal.
Pada KCKT fase terbalik paling sering digunakan fase diam berupa oktadesilsilan ODS atau C
18
dan fase gerak campuran methanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk solut yang bersifat asam lemah
,peranan pH sangat krusial karena bila pH fase gerak tidak diatur maka solute akan mengalami ionisasi atau protonisasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi
ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solute dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi akan terelusi lebih cepat
Rohman, 2007.
2.2.4 Cara Kerja KCKT
Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya sehingga memastikan
kesetimbangan yang baik antara fase dan bila fase gerak bergerak dengan cepat
sehingga difusi sekecil-kecilnya Gritter, 1991.
Kromatografi merupakan teknik pemisahan dimana analit atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan analit-analit tersebut
melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan analit tersebut diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Untuk mendapatkan hasil analisis yang
Universitas Sumatera Utara
baik, diperlukan penggabungan secara tepat dari kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom dan ukuran sampel Rohman, 2007. Komponen yang telah terpisah akan dibawa oleh fase gerak menuju
detektor dan sinyal yang terekam oleh detektor disebut sebagai puncak, sedangkan keseluruhan puncak yang direkam oleh detektor selama analisis dinamakan
kromatogram. Puncak yang diperoleh dalam analisis memiliki dua informasi
penting yakni informasi kualitatif dan kuantitatif Meyer, 2004.
2.2.5 Migrasi dan Retensi Solut
Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan distribusinya D dan besarnya D ditentukan oleh afinitas relatif solut pada kedua
fase fase diam dan fase bergerak. Dalam konteks kromatografi, nilai D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam Cs dan
dalam fase gerak Cm.
Jadi semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat; dan semakin kecil nilai D migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi menurut
perbandingan distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut cukup besar maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan
Rohman, 2007.
m S
C C
D =
Universitas Sumatera Utara
2.2.6 Instrumen KCKT
Instrument KCKT tersusun atas 6 bagian dasar, yaitu wadah fase gerak reservoir, pompa pump, tempat injeksi sampel injector, kolom column,
detector detector dan perekam recorder. Ilustrasi instrument dasar KCKT dapat
dilihat pada gambar
Gambar 2 . Instrumen Dasar KCKT
2.2.6.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu dapat digunakan sebagai wadah fase gerak dan biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing penghilangan gas yang ada pada fase gerak, sebab adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis Rohman, 2007.
2.2.6.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert
Universitas Sumatera Utara
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml menit Rohman, 2007.
Ada dua jenis utama pompa yang digunakan: tekanan-tetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi lagi menjadi pompa torak dan pompa semprit.
Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilakan garis alais detektor yang
stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi
tandonnya terbatas Johnson, 1991.
2.2.6.3 Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel sample loop Rohman,2007.
2.2.6.4 Kolom
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: a.
Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasn pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm,
untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
Universitas Sumatera Utara
b. Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dari
panjang 25-100 cm. Kolom hampir selalu terbuat dari baja nirkarat. Kolom biasanya dipakai pada suhu
kamar, tetapi pada suhu yang lebih tinggi dapat juga dipakai Johnson, 1991.
2.2.6.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam
rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor
spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam efluen kolom da mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka,
tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua
Universitas Sumatera Utara
jenis senyawa. Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair kecepatan tinggi modern KCKT ialah detektor UV 254 nm Jonshon, 1991.
2.2.6.6 Perekam
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis Rohman, 2007.
2.2.7 Parameter Penting dalam KCKT 2.2.7.1 Tinggi dan Luas Puncak
